Summary
Vi beskriver tre metoder for å generere Ln1-polymerer med fraktale egenskaper som signaliserer til celler annerledes enn upolymerisert Ln1.
Abstract
Laminin-111 (Ln1) er en viktig del av den ekstracellulære matrisen i epitel, muskel og nevrale systemer. Vi har tidligere vist at mikrostrukturen til Ln1 endrer måten den signaliserer til celler på, muligens fordi Ln1-montering i nettverk eksponerer forskjellige limdomener. I denne protokollen beskriver vi tre metoder for å generere polymerisert Ln1.
Introduction
I motsetning til vekstfaktorer eller cytokiner, kan ekstracellulære matriksproteiner (ECM) samle seg i strukturelle nettverk. Siden ECM-dysfunksjon er et nøkkelelement i mange sykdomstilstander, er mekanismene som celler sanser og transduserer signaler fra ECM-sammensetning, mikrostruktur og biomekanikk attraktive mål for terapeutisk utvikling. Økende bevis tyder på at mikrostruktur av disse nettverkene spiller en viktig rolle i hvordan disse proteinene signaliserer til celler. Hittil har denne koblingen mellom ECM-mikrostruktur og cellefunksjon blitt vist for kollagen I1, fibronektin2 og fibrin3.
Laminin-111 (Ln1) er et trimerisk, kryssformet protein som er en viktig strukturell komponent i den ekstracellulære matrisen som kontakter epitelceller4, muskelceller5 og nevrale celler6. I brystkjertelen er Ln1 nødvendig for funksjonell differensiering av brystkjertelepitelceller til melkeproduserende celler 7,8,9, og Ln1 er avgjørende for induksjon av tumorreversjon10,11. Ln1 og andre lamininer er nødvendige for utvikling av kortikale aktinnettverk og sarcolemma-organisering i muskel12,13, og for nevralcellemigrasjon og nevrittutvekst13 . Dermed er forståelse av mekanismene som laminin signalerer til celler et aktivt forskningsområde.
Ln1 inneholder flere klebende domener for et bredt spekter av reseptorer, inkludert integriner, syndekaner, dystroglykan, LBP-110 og LamR (figur 1A) 4,14. E8-fragmentet, som inneholder de c-terminale kuleformede domenene til laminin α1, er nødvendig for binding av dystroglykan og integriner α6β1 og α3β115, og det er nødvendig for funksjonell differensiering av epitelceller 15,16. I motsetning til dette viser de korte armene forskjellig biologisk aktivitet17, noe som betyr at tilgjengeligheten for anerkjennelse av disse forskjellige Ln1-domenene etter nettverksdannelse kan endre celleadferd.
Vi har nylig vist at Ln1 arrangert i et polymert nettverk utviser fraktale egenskaper (dvs. en struktur som er selvlik over flere lengdeskalaer)18. Fraktalnettverk signaliserer annerledes enn epitelceller sammenlignet med Ln1, som mangler dette arrangementet19. Dette fraktale nettverket indikerer en bestemt monteringsstruktur, hvor den lange armen fortrinnsvis eksponeres for celler18. Som et resultat av denne forskjellige lange armdisplayet, gjennomgår epitelceller funksjonell differensiering i melkeproduserende celler med velorganiserte stramme kryss og undertrykkelse av aktinstressfibre19.
Vi beskriver 3 metoder for å generere Ln1-nettverk fra korte arm-korte armbindingsinteraksjoner, som viser en høy visning av Ln1 lange arm: 1) ved cellefri montering med sure buffere, 2) ved co-inkubasjon med glykoproteiner, eller 3) ved interaksjon med celleoverflatedystroglykan. Disse tre metodene genererer lignende lamininmikrostrukturer gjennom tre svært forskjellige mekanismer, noe som tillater fleksibilitet i eksperimentell design. Tidligere arbeid tyder på at disse tre metodene kan representere biologisk robusthet: i brystkjertelepitel kan enten dystroglykan, glykoproteiner eller kunstig strukturert laminin indusere funksjonell differensiering19. Dermed kan forskere velge mellom disse metodene basert på studieobjektet: dystroglykanuttrykkende celler viser ingen følsomhet for Ln-1-mikrostruktur, da dystroglykan i cellemembranen induserer korrekt polymerisering i et fraktalt nettverk19,20. Matrigel, en blanding av lamininer og glykoproteiner21, representerer den mest økonomiske kilden til Ln-1, og tilbyr den nødvendige mikrostrukturen for å indusere dystroglykan-knockout brystceller for å skille20, men inneholder en kompleks blanding av proteiner med mye til mye variabilitet. PolyLM representerer det reneste, mest reduksjonistiske systemet som gir denne funksjonen, men til økt kostnad og lavere effekt for å indusere brystcelledifferensiering sammenlignet med Matrigel19.
Disse tre metodene har en fraktal nettverksstruktur som er karakteristisk for diffusjonsbegrenset aggregering18,19, og viser endret biologisk aktivitet sammenlignet med aggregert laminin i flere eksperimentelle systemer 22,23,24,25. Fremtidige studier ved hjelp av disse metodene kan identifisere reseptorene og signalene som er nødvendige for epiteldifferensiering og bestemme å gjenopprette normale cellematriseinteraksjoner i celler i unormale mikromiljøer20, for eksempel svulster.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Tine og aliquot laminin-111
MERK: Renset laminin-111 er tilgjengelig kommersielt (vanligvis renset fra HMS-matrise solgt som Matrigel), men ikke alle kilder gir intakt, ikke-nedbrutt protein.
- Bekreft at Ln1 ikke brytes ned ved å bruke Ln1 og kjøre størrelsesekskluderingskromatografi26 eller polyakrylamidgelelektroforese26. Denatured Ln1 skal ha bånd på 337 kDa, 197 kDa og 177 kDa, og native Ln1 skal ha et enkelt bånd på 711 kDa.
- Tine Ln1 på is i kjøleskap over natten, og alikot i mikrosentrifugerør med lav proteinbinding (typisk alikot ved 100 μg/rør for dyrkningsoverlegg, eller 10 μg for belegg) ved bruk av spisser med lav proteinbinding og steril teknikk27. Frys alikoter og oppbevares ved -80 °C.
2. Lamininpolymerisering ved bruk av lave pH-buffere
- Lag polyLM-polymerisasjonsbuffer: Vei ut og bland 1 mMCaCl2 og 20 mM natriumacetat i ultrarent vann. Juster deretter pH til 4,0 ved hjelp av HCl eller eddiksyre. Sterilt filter gjennom 0,2 μm filter, og oppbevares ved 4 °C.
- Lag kontrollpolymerisasjonsbuffer: Bland 1 mMCalCl2 og 20 mM Tris og juster pH til 7,0, bruk 10 N HCl eller 12 N NaOH etter behov. Sterilt filter gjennom 0,2 μm filter, og oppbevares ved 4 °C.
MERK: Protokollen kan settes på pause her. - Tine det nødvendige antall Ln-1 alikoter i kjøleskap over natten.
- Bruk steril cellekulturteknikk til å tilsette passende buffer (enten polyLM-polymerisasjonsbuffer fra trinn 2.1 eller kontrollpolymerisasjonsbuffer fra trinn 2.2) til lamininalikoter ved en endelig konsentrasjon på 100 μg/ml (dvs. tilsett 0,5 ml til 50 μg alikoter) og bland forsiktig ved pipettering.
- Ved bruk av fluorescerende merket laminin til visualisering, rekonstituer og tilsett ved forholdet 1:50 vekt/vekt (f.eks. 2 mikrogram/100 mikrogram) og bland forsiktig med pipettering.
MERK: Hvis du bruker lamininer som substrat for cellevedlegg, følg trinn 2.6-2.8: - Umiddelbart etter fortynning i egnet buffer overføres lamininer til dyrkningsplast eller glass og ruges over natten i en cellekulturinkubator ved 37 °C. Merk at når du belegger dekkslips, tilsett et tilstrekkelig stort volum til å gi et likevektsfall (bruk vanligvis 50 μL for et 13 mm rundt deksel), og oppbevar det i et fuktet kammer over natten ved 37 °C.
- Bruk steril teknikk27, vask med 1x fosfatbufret saltvann (PBS).
- Fjern væsken forsiktig. Ikke la overflaten være helt tørr.
MERK: Hvis du bruker lamininer til å dekke celler for melkeproteininduksjon, følg trinn 2.9-2.12: - Kultur mammary epitelceller. Kultur MepG dystroglykan banke i (DgKI) eller MepG dystroglykan knockout celler (DgKO) celler i DMEM-F12 supplert med 2% FBS, 0,01 mg / ml insulin, 0,005 μg / ml EGF, 0,05 mg / ml gentamycin og 0,05 g / ml normocin.
- Frø DgKO- og DgKI-celler for lamininstimulering ved 10 500 celler/cm2 i brønnplater eller dekkbunnsskål
- Inkuber fortynnede lamininer i en cellekulturinkubator ved 37 °C i 30 minutter.
- Sentrifuge polyLM alikoter ved 2,000 x g i 20 minutter, men sentrifuge LM i nøytral pH ved 20,000 x g i 20 minutter på grunn av den mindre størrelsen på proteinenhetene og behovet for høyere hastigheter for å samle effektivt.
- Ved steril teknikk27 fjernes supernatanten forsiktig og resuspenderes i et passende volum induksjonsmedium av DMEM-F12 supplert med 3 μg/ml prolaktin, 2,8 μM hydrokortison og 5 μg/ml insulin
- Overfør laminin i cellekulturmedium umiddelbart for å stimulere cellene. Vi har lykkes med å stimulere celler med 50-800 μg/ml Ln1
3. Lamininpolymerisering ved bruk av isolerte glykoproteiner
- Tine rekombinant nidogen-1 og Ln1 forsiktig på is i kjøleskapet over natten.
- Bland Ln1 med nidogen-1 ved et 1: 1 wt / wt-forhold i cellekulturmedium ved hjelp av lavproteinbindende tips og rør og ved hjelp av steril teknikk. Bruk ren Ln1 i cellekulturmedium som kontroll.
- Ved bruk av fluorescerende merket laminin til visualisering, rekonstituer og tilsett ved forholdet 1:50 vekt/vekt (f.eks. 2 mikrog/100 mikrogram). Bland forsiktig med pipettering.
- Inkuber Ln1-nidogen eller kontroller Ln1 i en cellekulturinkubator ved 37 °C i 30 minutter.
- Sentrifuge Ln1-nidogen kopolymerer ved 2000 x g i 30 minutter og kontrollen Ln1 ved 20.000 x g i 30 minutter.
- Fjern supernatanten forsiktig og resuspender den i cellekulturmedium til en endelig konsentrasjon på 100-800 μg totalt protein/ml.
- Brukes umiddelbart for å stimulere celler, eller overfør til dekkslipp og la det feste seg over natten ved 37 °C i fuktede cellekulturinkubatorer.
- Fjern dyrkningsmedium fra deksler, vask dekksedler med 1x PBS, og fest deretter med 10% formalin (dvs. 4% formaldehyd i PBS) i 15 minutter ved romtemperatur.
4. Lamininpolymerisering ved bruk av dystroglykanuttrykkende celler
- Kultur mammary epitelceller. Kultur MepG dystroglykan banke i (DgKI) eller MepG dystroglykan knockout celler (DgKO) celler i DMEM-F12 supplert med 2% FBS, 0,01 mg / ml insulin, 0,005 μg / ml EGF, 0,05 mg / ml gentamycin og 0,05 g / ml normocin.
- Frø DgKI-celler ved 5000 celler / cm2, og frø DgKO-celler ved 8000 celler / cm2 på grunn av forskjeller i veksthastighet. Dyrkning ved 37 °C i fuktede inkubatorer med media endres hver 2-3 dag og passeringer hver 4-5 dag ved hjelp av en streng steril teknikk. Telle celler nøye med et hemocytometer eller automatisert celleteller27 for å sikre passende veksthastigheter.
- Frøceller for lamininstimulering ved 10 500 celler/cm2 i brønnplater eller dekkbunnstallerkener og kultur i 2 dager, ved bruk av DgKI-celler for å generere fraktale Ln1- og DgKO-celler som negative kontroller. Tine Ln-1 forsiktig over natten på is i kjøleskap, og bland deretter med induksjonsmedium av DMEM-F12 supplert med 3 μg/ml prolaktin, 2,8 μM hydrokortison og 5 μg/ml insulin. For en 35 mm tallerken, bruk 1 ml induksjonsmedier med 50-800 μg Ln1.
- Hvis du bruker fluorescerende Ln1, bland inn i forholdet 50:1 vekt/vekt.
- Fjern medier fra cellene, og dekk med laminin og induksjonsmedier av DMEM-F12 supplert med 3 μg/ml prolaktin, 2,8 μM hydrokortison og 5 μg/ml insulin
- Kulturceller i 2 dager, og fikser deretter med 10% formalin.
5. Karakterisering av lamininmikrostruktur via optisk mikroskopi
- Samle faste prøver og vask 3 ganger med 1x PBS ved romtemperatur i 5 min.
- Blokker og permeabiliser prøver i 1x PBS med 0,5% Triton X-100, 3% bovint serumalbumin, 10% geitserum og 40 μg / ml anti-museblokkerende antistofffragment i 1 time ved romtemperatur i et fuktet kammer.
MERK: Triton X-100 er farlig. Håndter med hansker og øyevern og kast på riktig måte. - Bland anti-laminin antistoff ved en fortynning på 1:100 med 1x PBS med 0,5% Triton X-100 og 3% BSA og legg til prøver i 2 timer ved romtemperatur eller over natten ved 4 ° C i et fuktet kammer (bruk vanligvis spissbokser med en våt laboratorieserviett i bunnen).
- Fjern primært antistoff og vask 3 ganger med 1x PBS med 0,5% Triton X-100 og 3% BSA.
- Tilsett et passende sekundært antistoff ved en fortynning på 1:500 til prøver i 1x PBS med 0,5 % Triton X-100 og 3 % BSA og inkuber ved romtemperatur i mørket i et fuktet kammer.
- Fjern sekundært antistoff og vask 3 ganger med 1x PBS med 0,5% Triton X-100 og 3% BSA.
- For prøver som inneholder celler, tilsett 6 μM phalloidin i 45 minutter, etterfulgt av 3 vasker med PBS med 0,5% Triton X-100 og 3% BSA, og etterfulgt av 3 vasker med PBS. Beis deretter med 0,1 μg/ml DAPI i PBS i 5 minutter.
- Monter prøver hvis det er aktuelt.
- Bilde ln-1 struktur ved hjelp av høyoppløselig konfokal mikroskopi. Bruk et laserskanningsmikroskop utstyrt med nedsenkingsmål (vannnedsenking Plan Apochromat 40X/1.1NA eller oljenedsenking Plan Apochromat 63X/1.4NA).
6. Karakterisering av lamininkonstruksjoner via bokstellingsdimensjon
- Analyser fraktalegenskaper ved hjelp av algoritmer for bokstellingsdimensjoner som er tilgjengelige i Matlab-verktøykasser eller i ImageJ. Disse metodene tersker bilder av laminin og plotter på et loggloggplott antall bokser som inneholder Ln1 i forhold til størrelsen på boksene. Hellingen av forholdet mellom disse parametrene er bokstellingsdimensjonen: ikke-fraktale geometrier vil ha en dimensjon på 0, 1 eller 2, mens fraktale geometrier har en ikke-heltallsdimensjon28.
MERK: Syrebehandlet, glykoproteinbehandlet og DgKI cellefestet Ln1 har alle en bokstellende fraktal dimensjon på ~ 1,7, mens kontroll Ln1 har en fraktal dimensjon på 2,0.
7. Karakterisering av lamininkonstruksjoner via elektronmikroskopi
- Resuspender lamininer i cellekulturmedier og la dem adsorberes i silikaskiver i 90 minutter i fuktige omgivelser på 37 °C.
- Fiks matriser i 2,5% glutaraldehyd i 0,1 M natriumkakodylatbuffer ved pH 7,2.
MERK: Glutaraldehyd er farlig og skal håndteres i avtrekkshette med hansker og øyevern og kastes som farlig avfall. - Postfix-matriser i 1% osmiumtetroxid i 0,1 M natriumkakodylatbuffer ved pH 7,2.
MERK: Osmiumtetroxid er farlig og skal håndteres i avtrekkshette med hansker og øyevern og kastes på riktig måte. Kakodolat er farlig og skal håndteres i avtrekkshette med hansker og øyevern og kastes på riktig måte. - Vask 3 ganger i natriumkakodylatbuffer ved pH 7,2.
- Dehydrer med økende konsentrasjoner av etanol.
- Sputter frakkmatriser med et tynt lag gull.
- Bilde ved hjelp av skanning elektronmikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Laminin-111 er et trimerisk protein med tre selvmonterende domener i enden av de korte armene (figur 1A). Når de behandles hensiktsmessig, kan de korte armene polymeriseres til et sekskantet gitter (figur 1B,1C), som viser diffusjonsbegrensede fraktale egenskaper ved større romlige skalaer (figur 2). Laminin inkubert i kalsiumholdige nøytrale pH-buffere danner små aggregater visualisert med et anti-Ln1-antistoff (figur 2A), som har en bokstellende fraktal dimensjon på ~2, noe som indikerer ingen fraktalitet. I motsetning til dette danner Ln1 inkubert i kalsiumholdig pH4-buffer (figur 2B), eller i nøytral buffer med nidogen-1 (figur 2C) romfyllende lacy-nettverk med en fraktal dimensjon på ~1,7 (figur 3). Ln1 dyrket med dystroglykanuttrykkende celler danner lignende lacy-nettverk (figur 2D, innfelt viser cellekjerner).
Når pH7Ln og polyLM avbildes med SEM med økende oppløsning, blir forskjellene i mikrostruktur tydeligere. Ved lav oppløsning (figur 2Ei og v) virker polyLM-nettverk mer spredt sammenlignet med pH7-Ln, og ved høy oppløsning er pH7-Ln-aggregater synlige (figur 2E iv), mens et spredt sekskantet gitter kan ses i polyLM ved høy oppløsning (figur 2E viii).
Figur 1: Bakgrunn av Ln1 og polymerisasjonsmetode: A: Ln1 er et komplekst trimerisk protein med flere klebende domener (reseptorbindingssteder notert), som kan binde en rekke integrin- og ikke-integrinreseptorer (i svart) og danne polymere nettverk ved kort arm-kort armbinding (i tan). B: Ln1 kan danne et sekskantet gitter i nærvær av kalsiumioner og enten lav pH, glykoproteiner som nidogen-1 eller dystroglykan på celleoverflaten. C: eksempel SEM-bilde av polymerisert Ln1 som viser sekskantet gitter og foreslått Ln1-monteringsmodell. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Representative data for Ln1-polymerisasjon. A: Ln1 aggregerer i nøytrale buffere med kalsium. Når visualisert med et anti-Ln1 antistoff, kan små aggregater sees. B: Ln1 i sur kalsiumholdig bufferpolymeriserer til polyLM, som viser fraktale egenskaper. C: Ln1-nidogen-1 blanding (1: 1 vekt/vekt) danner lignende polymerer. D: Ln1 i nøytrale bufrede cellekulturmedier overlagt på dystroglykanuttrykkende celler viser et lignende lacy-nettverk. Innfelt: kjernefysisk motfarging som viser cellemorfologi. E: Scanning elektronmikroskopi av pH7-Ln og polyLM nettverk (spin down metode) med økende oppløsning. I pH7-Ln viser skanninger med lav oppløsning (i &; ii) relativt kompakte fibre, som løses som aggregater i høyoppløselige skanninger (iii). polyLM i samme konsentrasjon er mye mer spredt (IV&v), og høyoppløselige skanninger viser et sekskantet, romfyllingsgitter (VII). F: Denne mikrostrukturelle forandringen fører til at DgKO brystkjertelepitelceller funksjonelt differensieres til melkeproduserende celler19. i: pH7-Ln-stimulerte celler viser rikelig med aktinstressfibre (rød) og uorganiserte zo-1 som inneholder tette overganger (grønne), mens ii: polyLM-stimulerte celler inneholder mindre totalt filamentøst aktin, lateral lokalisering av aktin i cellecellegrensen og godt organisert zo-1 som inneholder tette kryss. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Fraktaldimensjonsestimering med bokstellemetode. A&B: Råbilde av pH7-Ln og polyLM viser forskjeller i morfologi. C&D: disse bildene er terskelverdier for å gi opphav til et svart-hvitt bilde, E&F: deretter beregnes loggen over forholdet mellom antall bokser som inneholder bildet og størrelsen på boksen. Gjennomsnittlig helning representerer bokstellingsdimensjonen Fd beregnes. pH7-Ln har en karakteristisk dimensjon på 2,0, noe som indikerer ingen fraktale egenskaper, mens polyLM har en dimensjon på ~ 1,7, noe som indikerer en diffusjonsbegrenset aggregeringsprosess. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Lamininer representerer et nøkkelelement i ECM i epitel-, muskel- og nevrale organsystemer, og har vist seg in vitro å spille viktige roller i regulering av funksjonell differensiering av celler. Økende bevis indikerer at strukturen av laminin som vises til celler regulerer dens signalering og resulterende cellefenotype15,16, og dermed bør metoder for å kontrollere Ln1-mikrostruktur være av interesse for grunnleggende biologer som arbeider i disse feltene, og for vevsingeniører som søker å rekapitulere normal oppførsel in vitro. Mer generelt er mikrostrukturen til en rekke ekstracellulære matriksproteiner kjent for å regulere biologisk respons og forståelse av mekanismene som mikrostruktur modulerer cellefunksjon er et aktivt forskningsområde.
I dette arbeidet beskriver vi tre metoder for å polymerisere laminin i nettverk med fraktal mikrostruktur karakteristisk for diffusjonsbegrenset aggregering. Disse Ln1-polymerene har vist seg å signalisere annerledes til celler sammenlignet med aggregert Ln1, potensielt på grunn av endret klebende domenevisning til celler. Disse tre metodene for å kontrollere Ln1-mikrostruktur kan representere biologisk redundans i montering av Ln1, men dette representerer en utfordring for eksperimentelt arbeid. Kontroll av Ln1-mikrostruktur ved hjelp av sur bufferbehandling vil bare vise effekter når den tilsettes dystroglykan-knockoutceller19,20. Dermed må eksperimentell design vurdere cellene og renheten til Ln1 som skal brukes. Kommersielt tilgjengelig Ln1 er vanligvis avledet fra EHS matrise, som inneholder en høy prosentandel av nidogener og andre glykoproteiner; Ln1 i EHS-matrise polymeriserer korrekt i fraktale nettverk i nøytrale bufrede systemer. Rekombinant Ln1 har nylig blitt tilgjengelig kommersielt, men er svært kostbart.
Ln1-proteinkvalitet er avgjørende for dette arbeidet, da korte armfragmenter kan blokkere polymerisasjon. Korte armfragmenter (dvs. E4-fragmentet) forstyrrer nettverksdannelse da hvert fragment induserer et tomrom i nettverket29. Tidligere data viser at inklusjon av E4-fragmenter kan blokkere Ln1-induserte fenotyper29,30. På samme måte har vi funnet ut at nettverksdannelse forstyrres av små mengder laminin-332 (upubliserte data), som i likhet med E4-fragmenter inneholder et enkelt limdomene29,30. Det er derfor viktig å kontrollere at Ln1 er intakt og sterkt renset for å fjerne andre lamininarter før arbeidet starter.
Selv om disse metodene er relevante for forskere som studerer cellematriseinteraksjoner, bør det bemerkes at lamininfamilien er svært kompleks, og involverer 15 kjente medlemmer og ytterligere spleisevarianter31, og denne familien samhandler med et bredt spekter av reseptorer, glykoproteiner, kollagener og potensielt vekstfaktorer4. Polymerisert Ln1 representerer således en reduksjonistisk tilstand som kan forventes å bli modifisert raskt ved cellefunksjon. Videre fornemmer, reagerer og omstrukturerer forskjellige organsystemer lamininer forskjellig: Vi har vist at kobling av laminin til aktin gjennom dystroglykan er dispensabel for brystkjertelen19, mens dystroglykan er absolutt nødvendig for myocyttfunksjon32.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dette arbeidet ble utført i regi av US Department of Energy av Lawrence Livermore National Laboratory under kontrakt DE-AC52-07NA27344. IM-utgivelse LLNL-JRNL-799443.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert av Lawrence Livermore National Lab LDRD 18-ERD-062 (til CR). Takk til John Muschler for hans vennlige gave av DgKO og DgKI celler. Takk til personalet ved University of California Berkeley Electron Microscope Laboratory for råd og hjelp i elektronmikroskopiprøvepreparering og datainnsamling.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% formalin | Sigma Aldrich | HT501128 | |
| Anti-Laminin primary antibody | Sigma Aldrich | L9393 | |
| Anti-Rabbit Alexafluor 488 secondary antibody | Thermo | A32731 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9418 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C4901 or similar | |
| Cell Culture Incubator | Thermo | Heracell 150 or similar | |
| Centrifuge for microcentrifuge tubes | Eppendorf | 5418 or similar | |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM 710 or equivalent | |
| Coverslips | Thermo | 25CIR-1 or similar | |
| DMEM-F12, Liquid, High Glucose, +HEPES, L-glutamine, +Phenol red | Thermo | 11330107 | |
| EGF (Epidermal Growth Factor) | Sigma Aldrich | 11376454001 | |
| Fluorescently Labeled Laminin | Cytoskeleton Inc | LMN02 | |
| Gentamicin | VWR | VWRV0304-10G | |
| Glutaraldehyde | Sigma Aldrich | G5882 | |
| HCl | Sigma Aldrich | 320331 or similar | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888-5G | |
| Insulin | Sigma Aldrich | 16634-50mg | |
| MepG Dystroglycan Knockout Cells | LBNL | N/A | |
| NaOH | Sigma Aldrich | S8045 or similar | |
| Normocin | Invivogen | ant-nr-1 | |
| Osmium Tetroxide | Sigma Aldrich | 75633 | |
| Ovine Prolactin | Los Angeles Biomedical Research Institute | Ovine Pituitary Prolactin | |
| Phalloidin | Thermo | A22287 | |
| Phosphate Buffered Saline | Thermo | 10010023 or similar | |
| Purified Laminin-111 | Sigma Aldrich | L2020-1MG | |
| Recombinant human Nidogen-1, carrier free | R&D systems | 2570-ND-050 | |
| Sodium Acetate | Sigma Aldrich | S2889 or similar | |
| Sodium Cacodylate | Sigma Aldrich | C0250 | |
| Sterile filters | Millipore | SLGP033RS or similar | |
| Tris | Sigma Aldrich | 252859 or similar | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Ultra-low protein binding tubes | VWR | 76322-516, 76322-522 or similar | |
| Ultrapure water | Thermo | 15230253 or similar |
References
- Carey, S. P., Kraning-Rush, C. M., Williams, R. M., Reinhart-King, C. A. Biophysical control of invasive tumor cell behavior by extracellular matrix microarchitecture. Biomaterials. 33 (16), 4157-4165 (2012).
- Wang, K., et al. Stiffening and unfolding of early deposited-fibronectin increase proangiogenic factor secretion by breast cancer-associated stromal cells. Biomaterials. 54, 63-71 (2015).
- Bruekers, S. M. C., et al. Fibrin-fiber architecture influences cell spreading and differentiation. Cell Adhesion & Migration. 10 (5), 495-504 (2016).
- Yurchenco, P. D. Integrating Activities of Laminins that Drive Basement Membrane Assembly and Function. Curr Top Membr. 76, 1-30 (2015).
- Colognato, H., Winkelmann, D. A., Yurchenco, P. D. Laminin Polymerization Induces a Receptor-Cytoskeleton Network. The Journal of Cell Biology. 145 (3), 619-631 (1999).
- Powell, S. K., Kleinman, H. K. Neuronal laminins and their cellular receptors. International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 29 (3), 401-414 (1997).
- Li, M. L., et al. Influence of a reconstituted basement membrane and its components on casein gene expression and secretion in mouse mammary epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (1), 136-140 (1987).
- Fiore, A., et al. Laminin-111 and the Level of Nuclear Actin Regulate Epithelial Quiescence via Exportin-6. Cell Rep. 19 (10), 2102-2115 (2017).
- Inman, J. L., Robertson, C., Mott, J. D., Bissell, M. J. Mammary gland development: cell fate specification, stem cells and the microenvironment. Development. 142 (6), 1028-1042 (2015).
- Weaver, V. M., et al. Reversion of the malignant phenotype of human breast cells in three-dimensional culture and in vivo by integrin blocking antibodies. Journal of Cell Biology. 137 (1), 231-245 (1997).
- Furuta, S., Ren, G., Mao, J. -H., Bissell, M. J. Laminin signals initiate the reciprocal loop that informs breast-specific gene expression and homeostasis by activating NO, p53 and microRNAs. eLife. 7, 26148 (2018).
- Brown, S. C., et al. Dystrophic phenotype induced in vitro by antibody blockade of muscle alpha-dystroglycan-laminin interaction. Journal of Cell Science. 112 (2), 209 (1999).
- Calof, A. L., Campanero, M. R., O'Rear, J. J., Yurchenco, P. D., Landert, A. D. Domain-specific activation of neuronal migration and neurite outgrowth-promoting activities of laminin. Neuron. 13 (1), 117-130 (1994).
- Li, S., et al. Laminin-sulfatide binding initiates basement membrane assembly and enables receptor signaling in Schwann cells and fibroblasts. The Journal of Cell Biology. 169 (1), 179-189 (2005).
- Sonnenberg, A., et al. Integrin recognition of different cell-binding fragments of laminin (P1, E3, E8) and evidence that alpha 6 beta 1 but not alpha 6 beta 4 functions as a major receptor for fragment E8. The Journal of Cell Biology. 110 (6), 2145-2155 (1990).
- Sorokin, L., Sonnenberg, A., Aumailley, M., Timpl, R., Ekblom, P. Recognition of the laminin E8 cell-binding site by an integrin possessing the alpha 6 subunit is essential for epithelial polarization in developing kidney tubules. The Journal of Cell Biology. 111 (3), 1265-1273 (1990).
- Horejs, C. -M., et al. Biologically-active laminin-111 fragment that modulates the epithelial-to-mesenchymal transition in embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (16), 5908-5913 (2014).
- Hochman-Mendez, C., Cantini, M., Moratal, D., Salmeron-Sanchez, M., Coelho-Sampaio, T. A Fractal Nature for Polymerized Laminin. PLOS ONE. 9 (10), 109388 (2014).
- Kent, A. J., et al. The microstructure of laminin-111 compensates for dystroglycan loss in mammary epithelial cells in downstream expression of milk proteins. Biomaterials. 218, 119337 (2019).
- Weir, M. L., et al. Dystroglycan loss disrupts polarity and beta-casein induction in mammary epithelial cells by perturbing laminin anchoring. Journal of Cell Science. 119, Pt 19 4047-4058 (2006).
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
- Palmero, C. Y., et al. The follicular thyroid cell line PCCL3 responds differently to laminin and to polylaminin, a polymer of laminin assembled in acidic pH. Molecular and Cellular Endocrinology. 376 (1), 12-22 (2013).
- Hochman-Mendez, C., Lacerda de Menezes, J. R., Sholl-Franco, A., Coelho-Sampaio, T.
- Leal-Lopes, C., Grazioli, G., Mares-Guia, T. R., Coelho-Sampaio, T., Sogayar, M. C. Polymerized laminin incorporation into alginate-based microcapsules reduces pericapsular overgrowth and inflammation. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 13 (10), 1912-1922 (2019).
- Paccola Mesquita, F. C., Hochman-Mendez, C., Morrissey, J., Sampaio, L. C., Taylor, D. A. Laminin as a Potent Substrate for Large-Scale Expansion of Human Induced Pluripotent Stem Cells in a Closed Cell Expansion System. Stem Cells International. 2019, 9 (2019).
- Walker, J. M. The Protein Protocols Handbook. Walker, J. M. , Humana Press. 61-67 (2002).
- Freshney, R. I. Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Techniques. 7th edition. , John Wiley and Sons. (2016).
- Mandelbrot, B. The Fractal Geometry of Nature. , WH Freedman and Company. (1982).
- Schittny, J. C., Yurchenco, P. D. Terminal short arm domains of basement membrane laminin are critical for its self-assembly. Journal of Cell Biology. 110 (3), 825-832 (1990).
- Schuger, L., Yurchenco, P., Relan, N. K., Yang, Y. Laminin fragment E4 inhibition studies: basement membrane assembly and embryonic lung epithelial cell polarization requires laminin polymerization. International Journal of Developmental Biology. 42 (2), 217-220 (1998).
- Colognato, H., Yurchenco, P. D. Form and function: the laminin family of heterotrimers. Developmental Dynamics. 218 (2), 213-234 (2000).
- Kabaeva, Z., Meekhof, K. E., Michele, D. E. Sarcolemma instability during mechanical activity in Large myd cardiac myocytes with loss of dystroglycan extracellular matrix receptor function. Human Molecular Genetics. 20 (17), 3346-3355 (2011).
