Summary
Nous décrivons trois méthodes pour générer des polymères Ln1 avec des propriétés fractales qui signalent aux cellules différemment par rapport au Ln1 non polymérisé.
Abstract
La laminine-111 (Ln1) est une partie essentielle de la matrice extracellulaire dans les épithéliums, les muscles et les systèmes neuronaux. Nous avons déjà démontré que la microstructure de Ln1 modifie la façon dont il signale aux cellules, peut-être parce que l’assemblage de Ln1 en réseaux expose différents domaines adhésifs. Dans ce protocole, nous décrivons trois méthodes pour générer du Ln1 polymérisé.
Introduction
Contrairement aux facteurs de croissance ou aux cytokines, les protéines de la matrice extracellulaire (MEC) peuvent s’assembler en réseaux structurels. Comme le dysfonctionnement de la MEC est un élément clé de nombreuses maladies, les mécanismes par lesquels les cellules détectent et transduisent les signaux de la composition, de la microstructure et de la biomécanique de la MEC sont des cibles intéressantes pour le développement thérapeutique. De plus en plus de preuves suggèrent que la microstructure de ces réseaux joue un rôle majeur dans la façon dont ces protéines signalent aux cellules. À ce jour, ce lien entre la microstructure de la MEC et la fonction cellulaire a été démontré pour le collagène I1, la fibronectine2 et la fibrine3.
La laminine-111 (Ln1) est une protéine trimérique en forme de croix qui est un composant structurel clé de la matrice extracellulaire qui entre en contact avec les cellules épithéliales4, les cellules musculaires5 et les cellules neurales6. Dans la glande mammaire, Ln1 est nécessaire à la différenciation fonctionnelle des cellules épithéliales de la glande mammaire en cellules productrices de lait 7,8,9, et Ln1 est crucial pour l’induction de la réversion tumorale10,11. Ln1 et d’autres laminines sont nécessaires au développement des réseaux d’actine corticale et à l’organisation des sarcolemmes dans le muscle12,13, ainsi qu’à la migration des cellules neurales et à la croissance des neurites13 . Ainsi, la compréhension des mécanismes par lesquels la laminine envoie des signaux aux cellules est un domaine de recherche actif.
Ln1 contient plusieurs domaines adhésifs pour une large gamme de récepteurs, notamment les intégrines, les syndécines, le dystroglycane, le LBP-110 et le LamR (Figure 1A)4,14. Le fragment E8, qui contient les domaines globulaires c-terminus de la laminine α1, est nécessaire à la liaison du dystroglycane et des intégrines α6β1 et α3β115, et il est nécessaire à la différenciation fonctionnelle des cellules épithéliales 15,16. En revanche, les bras courts montrent une activité biologique différente17, ce qui signifie que la disponibilité pour la reconnaissance de ces différents domaines Ln1 après la formation du réseau pourrait modifier le comportement cellulaire.
Nous avons récemment démontré que Ln1 arrangé en un réseau polymérique présente des propriétés fractales (c’est-à-dire une structure auto-similaire sur plusieurs échelles de longueur)18. Les réseaux fractals signalent différemment aux cellules épithéliales par rapport à Ln1, qui n’a pas cet arrangement19. Ce réseau fractal indique une structure d’assemblage particulière, où le bras long est préférentiellement exposé aux cellules18. En raison de cette différence de bras long, les cellules épithéliales subissent une différenciation fonctionnelle en cellules productrices de lait avec des jonctions serrées bien organisées et une suppression des fibres de stress d’actine19.
Nous décrivons 3 méthodes pour générer des réseaux Ln1 à partir d’interactions de liaison bras court-bras court, qui montrent une forte manifestation du bras long Ln1 : 1) par assemblage acellulaire avec des tampons acides, 2) par co-incubation avec des glycoprotéines, ou 3) par interaction avec le dystroglycane de surface cellulaire. Ces trois méthodes génèrent des microstructures de laminines similaires par trois mécanismes très différents, ce qui permet une flexibilité dans la conception expérimentale. Des travaux antérieurs suggèrent que ces trois méthodes pourraient représenter une robustesse biologique : dans les épithéliums des glandes mammaires, le dystroglycane de surface cellulaire, les glycoprotéines ou la laminine structurée artificiellement peuvent induire une différenciation fonctionnelle19. Ainsi, les chercheurs peuvent choisir entre ces méthodes en fonction du sujet de l’étude : les cellules exprimant le dystroglycane ne montrent aucune sensibilité à la microstructure Ln-1, car le dystroglycane dans la membrane cellulaire induit une polymérisation correcte en un réseau fractal19,20. Matrigel, un mélange de laminines et de glycoprotéines21, représente la source la plus économique de Ln-1 et offre la microstructure nécessaire pour induire les cellules mammaires knock-out des dystroglycanes à se différencier20, mais contient un mélange complexe de protéines avec une variabilité d’un lot à l’autre. PolyLM représente le système le plus propre et le plus réductionniste qui assure cette fonction, mais à un coût accru et à une efficacité moindre pour induire la différenciation des cellules mammaires par rapport à Matrigel19.
Ces trois méthodes ont une structure de réseau fractal caractéristique de l’agrégation limitée par diffusion18,19, et montrent une activité biologique altérée par rapport à la laminine agrégée dans plusieurs systèmes expérimentaux 22,23,24,25. De futures études utilisant ces méthodes pourraient identifier les récepteurs et la signalisation nécessaires à la différenciation épithéliale et déterminer comment restaurer les interactions normales entre la matrice cellulaire et la matrice dans les cellules dans des microenvironnements anormaux20, tels que les tumeurs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Décongélation et aliquote laminine-111
REMARQUE : La laminine-111 purifiée est disponible dans le commerce (généralement purifiée à partir de la matrice EHS vendue sous le nom de Matrigel), mais toutes les sources ne fournissent pas de protéines intactes et non dégradées.
- Confirmer que Ln1 n’est pas dégradé en s’approvisionnant en Ln1 et en utilisant la chromatographie d’exclusion de tailled’essai 26 ou l’électrophorèse sur gel de polyacrylamide26. Le Ln1 dénaturé doit avoir des bandes de 337 kDa, 197 kDa et 177 kDa, et le Ln1 natif doit avoir une seule bande de 711 kDa.
- Décongeler Ln1 sur de la glace au réfrigérateur pendant la nuit et aliquote dans des tubes de microcentrifugation à faible liaison protéique (généralement aliquote à 100 μg/tube pour les superpositions de culture, ou 10 μg pour les enrobages) à l’aide d’embouts à faible liaison protéique et d’une technique stérile27. Congeler les aliquotes et les conserver à -80 °C.
2. Polymérisation de la laminine à l’aide de tampons à faible pH
- Fabriquer un tampon de polymérisation polyLM : Peser et mélanger 1 mM de CaCl2 et 20 mM d’acétate de sodium dans de l’eau ultrapure. Ajustez ensuite le pH à 4,0, en utilisant du HCl ou de l’acide acétique. Filtrer stérilement à travers un filtre de 0,2 μm et conserver à 4 °C.
- Fabriquer un tampon de polymérisation témoin : Mélanger 1 mM de CalCl2 et 20 mM de Tris et ajuster le pH à 7,0, en utilisant 10 N HCl ou 12 N NaOH si nécessaire. Filtrer stérilement à travers un filtre de 0,2 μm et conserver à 4 °C.
REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause ici. - Décongeler le nombre nécessaire d’aliquotes de Ln-1 au réfrigérateur pendant la nuit.
- À l’aide d’une technique de culture cellulaire stérile, ajouter le tampon approprié (soit un tampon de polymérisation polyLM de l’étape 2.1, soit un tampon de polymérisation témoin de l’étape 2.2) aux aliquotes de laminine à une concentration finale de 100 μg/mL (c.-à-d. ajouter 0,5 mL à 50 μg d’aliquotes) et mélanger doucement par pipetage.
- Si vous utilisez de la laminine marquée par fluorescence pour la visualisation, reconstituer et ajouter à un rapport poids/poids de 1 :50 (par exemple 2 μg/100 μg) et mélanger doucement par pipetage.
REMARQUE : Si vous utilisez des laminines comme substrat pour la fixation des cellules, suivez les étapes 2.6-2.8 : - Immédiatement après dilution dans un tampon approprié, transférer les laminines sur du plastique de culture ou de la verrerie et incuber toute la nuit dans un incubateur de culture cellulaire à 37 °C. Il convient de noter que lorsque vous recouvrez des lamelles, ajoutez un volume suffisamment important pour produire une goutte équilibrée (utilisez généralement 50 μL pour une lamelle ronde de 13 mm) et conservez-les dans une chambre humidifiée pendant la nuit à 37 °C.
- En utilisant la technique stérile27, laver avec 1x solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
- Retirez le liquide avec précaution. Ne laissez pas la surface être complètement sèche.
REMARQUE : Si vous utilisez des laminines pour couvrir les cellules pour l’induction des protéines du lait, suivez les étapes 2.9 à 2.12 : - Culture de cellules épithéliales mammaires. Culture de cellules de dystroglycanes MepG knock-in (DgKI) ou de cellules MepG dystroglycanes knock-out (DgKO) dans le DMEM-F12 supplémentées en FBS à 2 %, 0,01 mg/mL d’insuline, 0,005 μg/mL d’EGF, 0,05 mg/mL de gentamycine et 0,05 g/mL de normocine.
- Semez des cellules DgKO et DgKI pour la stimulation de la laminine à 10 500 cellules/cm2 dans des plaques à puits ou des plats à fond de lamelle
- Incuber les laminines diluées dans un incubateur de culture cellulaire à 37 °C pendant 30 min.
- Centrifugez polyLM aliquotes à 2 000 x g pendant 20 minutes, mais centrifugez LM à pH neutre à 20 000 x g pendant 20 minutes en raison de la petite taille des entités protéiques et de la nécessité de vitesses plus élevées pour collecter efficacement.
- À l’aide de la technique stérile27, retirer délicatement le surnageant et remettre en suspension dans un volume approprié de milieu d’induction de DMEM-F12 complété par 3 μg/mL de prolactine, 2,8 μM d’hydrocortisone et 5 μg/mL d’insuline
- Transférez immédiatement la laminine dans le milieu de culture cellulaire pour stimuler les cellules. Nous avons stimulé avec succès des cellules avec 50-800 μg/mL Ln1
3. Polymérisation de la laminine à l’aide de glycoprotéines isolées
- Décongeler doucement le nidogène recombinant 1 et Ln1 sur de la glace au réfrigérateur pendant la nuit.
- Mélanger Ln1 avec le nidogen-1 à un rapport poids/poids de 1 :1 dans un milieu de culture cellulaire en utilisant des embouts et des tubes à faible liaison protéique et en utilisant une technique stérile. Utilisez du Ln1 pur dans un milieu de culture cellulaire comme témoin.
- Si vous utilisez de la laminine marquée par fluorescence pour la visualisation, reconstituez et ajoutez à un rapport poids/poids de 1 :50 (p. ex., 2 μg/100 μg). Mélanger délicatement par pipetage.
- Incuber le Ln1-nidogen ou le contrôle du Ln1 dans un incubateur de culture cellulaire à 37 °C pendant 30 min.
- Centrifuger les copolymères Ln1-nidogen à 2 000 x g pendant 30 min et le témoin Ln1 à 20 000 x g pendant 30 min.
- Retirer délicatement le surnageant et le remettre en suspension dans le milieu de culture cellulaire jusqu’à une concentration finale de 100 à 800 μg de protéines totales/mL.
- Utiliser immédiatement pour stimuler les cellules, ou transférer sur des lamelles et laisser adhérer toute la nuit à 37 °C dans des incubateurs de culture cellulaire humidifiés.
- Retirer le milieu de culture des lamelles, laver les lamelles avec 1x PBS, puis fixer avec du formol à 10 % (c.-à-d. 4 % de formaldéhyde dans du PBS) pendant 15 minutes à température ambiante.
4. Polymérisation de la laminine à l’aide de cellules exprimant des dystroglycanes
- Culture de cellules épithéliales mammaires. Culture de cellules de dystroglycanes MepG knock-in (DgKI) ou de cellules MepG dystroglycanes knock-out (DgKO) dans le DMEM-F12 supplémentées en FBS à 2 %, 0,01 mg/mL d’insuline, 0,005 μg/mL d’EGF, 0,05 mg/mL de gentamycine et 0,05 g/mL de normocine.
- Semez des cellules DgKI à 5 000 cellules/cm2 et des cellules DgKO à 8 000 cellules/cm2 en raison des différences de taux de croissance. Culture à 37 °C dans des incubateurs humidifiés avec des changements de milieu tous les 2-3 jours et des passages tous les 4-5 jours en utilisant une technique stérile rigoureuse. Comptez soigneusement les cellules à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur de cellules automatisé27 pour assurer des taux de croissance appropriés.
- Cellules d’ensemencement pour la stimulation de la laminine à 10 500 cellules/cm2 dans des plaques à puits ou des boîtes de fond de lamelle et culture pendant 2 jours, en utilisant des cellules DgKI pour générer des cellules fractales Ln1 et DgKO comme témoins négatifs. Décongeler doucement Ln-1 pendant la nuit sur de la glace au réfrigérateur, puis mélanger avec un milieu d’induction de DMEM-F12 complété par 3 μg/mL de prolactine, 2,8 μM d’hydrocortisone et 5 μg/mL d’insuline. Pour une boîte de 35 mm, utilisez 1 mL de milieu à induction contenant 50 à 800 μg de Ln1.
- Si vous utilisez du Ln1 fluorescent, mélangez à un rapport poids/poids de 50 :1.
- Retirer les milieux des cellules et les recouvrir de laminine et de milieux d’induction de DMEM-F12 additionnés de 3 μg/mL de prolactine, de 2,8 μM d’hydrocortisone et de 5 μg/mL d’insuline
- Cultivez des cellules pendant 2 jours, puis fixez avec du formol à 10%.
5. Caractérisation de la microstructure de la laminine par microscopie optique
- Prélever des échantillons fixes et laver 3 fois avec 1x PBS à température ambiante pendant 5 min.
- Bloquer et perméabiliser les échantillons dans 1x PBS avec 0,5 % de Triton X-100, 3 % d’albumine sérique bovine, 10 % de sérum de chèvre et 40 μg/mL de fragment d’anticorps anti-blocage de la souris pendant 1 h à température ambiante dans une chambre humidifiée.
REMARQUE : Triton X-100 est dangereux. Manipulez avec des gants et des lunettes de protection et jetez-les de manière appropriée. - Mélanger les anticorps anti-laminine à une dilution de 1 :100 avec 1x PBS avec 0,5 % de Triton X-100 et 3 % de BSA et ajouter aux échantillons pendant 2 h à température ambiante ou toute la nuit à 4 °C dans une chambre humidifiée (généralement utiliser des boîtes à embouts avec une lingette de laboratoire humide au fond).
- Retirer l’anticorps primaire et laver 3 fois avec 1x PBS avec 0,5% de Triton X-100 et 3% de BSA.
- Ajouter un anticorps secondaire approprié à une dilution de 1 :500 aux échantillons dans 1x PBS avec 0,5 % de Triton X-100 et 3 % de BSA et incuber à température ambiante dans l’obscurité dans une chambre humidifiée.
- Retirer l’anticorps secondaire et laver 3 fois avec 1x PBS avec 0,5% de Triton X-100 et 3% de BSA.
- Pour les échantillons contenant des cellules, ajouter 6 μM de phalloïdine pendant 45 min, suivi de 3 lavages avec du PBS avec 0,5 % de Triton X-100 et 3 % de BSA, et suivi de 3 lavages avec du PBS. Colorer ensuite avec 0,1 μg/mL de DAPI dans du PBS pendant 5 minutes.
- Monter les échantillons si nécessaire.
- Image de la structure ln-1 à l’aide de la microscopie confocale à haute résolution. Utilisez un microscope à balayage laser équipé d’objectifs à immersion (plan d’immersion dans l’eau Plan Apochromat 40X/1.1NA ou plan d’immersion dans l’huile Apochromat 63X/1.4NA).
6. Caractérisation des constructions de laminines via la dimension de comptage de boîtes
- Analysez les propriétés fractales à l’aide des algorithmes de dimension de comptage de boîtes disponibles dans les boîtes à outils Matlab ou dans ImageJ. Ces méthodes permettent de chiffrer les images de laminine et de tracer sur un logarithme le nombre de boîtes contenant Ln1 par rapport à la taille des boîtes. La pente de la relation entre ces paramètres est la dimension de comptage de boîtes : les géométries non fractales auront une dimension de 0, 1 ou 2, tandis que les géométries fractales ont une dimension non entièrede 28.
REMARQUE : Les Ln1 traités à l’acide, aux glycoprotéines et aux cellules DgKI ont tous une dimension fractale de comptage de boîtes de ~1,7, tandis que le Ln1 témoin a une dimension fractale de 2,0.
7. Caractérisation des constructions laminines par microscopie électronique
- Remettre les laminines en suspension dans des milieux de culture cellulaire et les laisser adsorber sur des plaquettes de silice pendant 90 minutes dans un environnement humide à 37 °C.
- Fixer les matrices dans du glutaraldéhyde à 2,5 % dans un tampon de cacodylate de sodium 0,1 M à pH 7,2.
REMARQUE : Le glutaraldéhyde est dangereux et doit être manipulé dans une hotte avec des gants et des lunettes de protection et éliminé comme déchet dangereux. - Matrices Postfix dans du tétroxyde d’osmium à 1 % dans un tampon de cacodylate de sodium 0,1 M à pH 7,2.
REMARQUE : Le tétroxyde d’osmium est dangereux et doit être manipulé dans une hotte avec des gants et des lunettes de protection et éliminé de manière appropriée. Le cacodylate est dangereux et doit être manipulé dans une hotte avec des gants et des lunettes de protection et éliminé de manière appropriée. - Laver 3 fois dans un tampon de cacodylate de sodium à pH 7,2.
- Déshydrater avec des concentrations croissantes d’éthanol.
- Pulvériser les matrices de couche avec une fine couche d’or.
- Image par microscopie électronique à balayage.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
La laminine-111 est une protéine trimérique avec trois domaines auto-assemblés à l’extrémité de ses bras courts (Figure 1A). Lorsqu’ils sont traités de manière appropriée, les bras courts peuvent polymériser en un réseau hexagonal (Figure 1B,1C), qui présente des propriétés fractales agrégées limitées par diffusion à des échelles spatiales plus grandes (Figure 2). La laminine incubée dans des tampons à pH neutre contenant du calcium forme de petits agrégats visualisés avec un anticorps anti-Ln1 (Figure 2A), qui ont une dimension fractale de comptage de boîtes de ~2, indiquant l’absence de fractalité. En revanche, Ln1 incubé dans un tampon pH4 contenant du calcium (Figure 2B), ou dans un tampon neutre avec du nidogène-1 (Figure 2C) forment des réseaux de dentelle remplissant l’espace avec une dimension fractale de ~1,7 (Figure 3). Ln1 cultivé avec des cellules exprimant des dystroglycanes forme des réseaux de dentelle similaires (Figure 2D, l’encart montre les noyaux cellulaires).
Lorsque pH7Ln et polyLM sont imagés avec MEB avec une résolution croissante, les différences de microstructure deviennent plus apparentes. À basse résolution (Figure 2Ei et v), les réseaux polyLM semblent plus étendus que pH7-Ln, et à haute résolution, les agrégats pH7-Ln sont apparents (Figure 2E iv) alors qu’un réseau hexagonal étalé peut être vu dans les polyLM à haute résolution (Figure 2E viii).
Figure 1 : Contexte du Ln1 et de la méthode de polymérisation : R : Ln1 est une protéine trimérique complexe avec de multiples domaines adhésifs (sites de liaison aux récepteurs notés), qui peut se lier à une variété de récepteurs d’intégrine et de non-intégrine (en noir) et former des réseaux polymères par liaison bras court-bras court (en beige). B : Ln1 peut former un réseau hexagonal en présence d’ions calcium et de glycoprotéines à faible pH telles que le nidogène-1 ou le dystroglycane de surface cellulaire. C : exemple d’image MEB de Ln1 polymérisé montrant un réseau hexagonal et le modèle d’assemblage proposé pour Ln1. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Données représentatives de la polymérisation du Ln1. R : Ln1 s’agrège dans des tampons neutres avec du calcium. Lorsqu’ils sont visualisés avec un anticorps anti-Ln1, de petits agrégats peuvent être vus. B : Ln1 dans le tampon contenant du calcium acide polymérise en polyLM, qui présente des propriétés fractales. C : Le mélange Ln1-nidogen-1 (1 :1 poids/poids) forme des polymères similaires. D : Ln1 dans un milieu de culture cellulaire tamponné neutre superposé à des cellules exprimant des dystroglycanes montre un réseau laceux similaire. Encadré : contre-coloration nucléaire montrant la morphologie cellulaire. E : Microscopie électronique à balayage des réseaux pH7-Ln et polyLM (méthode de spin down) avec une résolution croissante. Dans pH7-Ln, les balayages à faible résolution (i et ii) montrent des fibres relativement compactes, qui se résolvent sous forme d’agrégats dans les balayages à haute résolution (iii). polyLM à la même concentration est beaucoup plus répandu (iv&v), et les balayages à haute résolution montrent un réseau hexagonal remplissant l’espace (vii). F : Ce changement microstructurel provoque la différenciation fonctionnelle des cellules épithéliales de la glande mammaire DgKO en cellules productrices de lait19. i : les cellules stimulées par pH7-Ln présentent des fibres de stress d’actine abondantes (rouge) et des jonctions serrées désorganisées contenant du zo-1 (vert), tandis que ii : les cellules stimulées par le polyLM contiennent moins d’actine filamenteuse totale, une localisation latérale de l’actine dans la limite cellule-cellule et un zo-1 bien organisé contenant des jonctions serrées. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Estimation de la dimension fractale avec la méthode de comptage des boîtes. A&B : L’image brute de pH7-Ln et polyLM montre des différences de morphologie. C&D : ces images sont seuillées pour donner lieu à une image en noir et blanc, E&F : alors le log du rapport entre le nombre de boîtes contenant l’image et la taille de la boîte est calculé. La pente moyenne représente la dimension de comptage de boîtes Fd est calculée. pH7-Ln a une dimension caractéristique de 2,0, indiquant qu’il n’y a pas de propriétés fractales, tandis que polyLM a une dimension de ~1,7, indiquant un processus d’agrégation limité par diffusion. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Les laminines représentent un élément clé de la MEC dans les systèmes épithéliaux, musculaires et d’organes neuraux, et il a été démontré in vitro qu’elles jouent un rôle essentiel dans la régulation de la différenciation fonctionnelle des cellules. De plus en plus de preuves indiquent que la structure de la laminine présentée aux cellules régule sa signalisation et le phénotype cellulaire résultant15,16, donc les méthodes de contrôle de la microstructure Ln1 devraient intéresser les biologistes fondamentaux travaillant dans ces domaines, et les ingénieurs tissulaires cherchant à récapituler le comportement normal in vitro. Plus généralement, la microstructure d’une variété de protéines de la matrice extracellulaire est connue pour réguler la réponse biologique et la compréhension des mécanismes par lesquels la microstructure module la fonction cellulaire est un domaine de recherche actif.
Dans ce travail, nous décrivons trois méthodes pour polymériser la laminine en réseaux avec une microstructure fractale caractéristique d’une agrégation limitée par diffusion. Il a été démontré que ces polymères Ln1 signalent différemment aux cellules par rapport aux Ln1 agrégés, potentiellement en raison d’une altération de l’affichage du domaine adhésif aux cellules. Ces trois méthodes de contrôle de la microstructure de Ln1 peuvent représenter une redondance biologique dans l’assemblage de Ln1, mais cela représente un défi pour les travaux expérimentaux. Le contrôle de la microstructure Ln1 à l’aide d’un traitement tampon acide ne montrera d’effets que lorsqu’il est ajouté aux cellules knock-out des dystroglycanes19,20. Ainsi, la conception expérimentale doit tenir compte des cellules et de la pureté de Ln1 à utiliser. Le Ln1 disponible dans le commerce est généralement dérivé de la matrice EHS, qui contient un pourcentage élevé de nidogènes et d’autres glycoprotéines ; Ln1 dans la matrice EHS polymérise correctement en réseaux fractals dans des systèmes à tampon neutre. Le Ln1 recombinant est récemment devenu disponible dans le commerce, mais il est exceptionnellement coûteux.
La qualité de la protéine Ln1 est cruciale pour ce travail car les fragments de bras courts peuvent bloquer la polymérisation. Les fragments de bras courts (c’est-à-dire le fragment E4) interfèrent avec la formation du réseau car chaque fragment induit un vide dans le réseau29. Des données antérieures montrent que l’inclusion de fragments E4 peut bloquer les phénotypesinduits par Ln1 29,30. De même, nous avons constaté que la formation de réseaux est perturbée par de petites quantités de laminine-332 (données non publiées), qui, comme les fragments E4, contient un seul domaine adhésif29,30. Il est donc crucial de vérifier que Ln1 est intact et hautement purifié pour éliminer les autres espèces de laminines avant de commencer le travail.
Bien que ces méthodes soient pertinentes pour les chercheurs qui étudient les interactions cellule-matrice, il convient de noter que la famille des laminines est très complexe, impliquant 15 membres connus et des variantes d’épissage supplémentaires31, et cette famille interagit avec un large éventail de récepteurs, de glycoprotéines, de collagènes et potentiellement de facteurs de croissance4. Ainsi, le Ln1 polymérisé représente un état réductionniste dont on peut s’attendre à ce qu’il soit modifié rapidement par la fonction cellulaire. De plus, différents systèmes organiques détectent, répondent et remodèlent différemment les laminines : nous avons démontré que la liaison de la laminine à l’actine par le biais du dystroglycane est dispensable pour la glande mammaire19, tandis que le dystroglycane est absolument nécessaire à la fonction des myocytes32.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ce travail a été effectué sous les auspices du département de l’Énergie des États-Unis par le Lawrence Livermore National Laboratory sous le contrat DE-AC52-07NA27344. Communiqué de messagerie instantanée LLNL-JRNL-799443.
Acknowledgments
Ce travail a été financé par Lawrence Livermore National Lab LDRD 18-ERD-062 (à C.R.). Merci à John Muschler pour son aimable don des cellules DgKO et DgKI. Merci au personnel du laboratoire de microscope électronique de l’Université de Californie à Berkeley pour ses conseils et son aide dans la préparation des échantillons de microscopie électronique et la collecte de données.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% formalin | Sigma Aldrich | HT501128 | |
| Anti-Laminin primary antibody | Sigma Aldrich | L9393 | |
| Anti-Rabbit Alexafluor 488 secondary antibody | Thermo | A32731 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9418 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C4901 or similar | |
| Cell Culture Incubator | Thermo | Heracell 150 or similar | |
| Centrifuge for microcentrifuge tubes | Eppendorf | 5418 or similar | |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM 710 or equivalent | |
| Coverslips | Thermo | 25CIR-1 or similar | |
| DMEM-F12, Liquid, High Glucose, +HEPES, L-glutamine, +Phenol red | Thermo | 11330107 | |
| EGF (Epidermal Growth Factor) | Sigma Aldrich | 11376454001 | |
| Fluorescently Labeled Laminin | Cytoskeleton Inc | LMN02 | |
| Gentamicin | VWR | VWRV0304-10G | |
| Glutaraldehyde | Sigma Aldrich | G5882 | |
| HCl | Sigma Aldrich | 320331 or similar | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888-5G | |
| Insulin | Sigma Aldrich | 16634-50mg | |
| MepG Dystroglycan Knockout Cells | LBNL | N/A | |
| NaOH | Sigma Aldrich | S8045 or similar | |
| Normocin | Invivogen | ant-nr-1 | |
| Osmium Tetroxide | Sigma Aldrich | 75633 | |
| Ovine Prolactin | Los Angeles Biomedical Research Institute | Ovine Pituitary Prolactin | |
| Phalloidin | Thermo | A22287 | |
| Phosphate Buffered Saline | Thermo | 10010023 or similar | |
| Purified Laminin-111 | Sigma Aldrich | L2020-1MG | |
| Recombinant human Nidogen-1, carrier free | R&D systems | 2570-ND-050 | |
| Sodium Acetate | Sigma Aldrich | S2889 or similar | |
| Sodium Cacodylate | Sigma Aldrich | C0250 | |
| Sterile filters | Millipore | SLGP033RS or similar | |
| Tris | Sigma Aldrich | 252859 or similar | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Ultra-low protein binding tubes | VWR | 76322-516, 76322-522 or similar | |
| Ultrapure water | Thermo | 15230253 or similar |
References
- Carey, S. P., Kraning-Rush, C. M., Williams, R. M., Reinhart-King, C. A. Biophysical control of invasive tumor cell behavior by extracellular matrix microarchitecture. Biomaterials. 33 (16), 4157-4165 (2012).
- Wang, K., et al. Stiffening and unfolding of early deposited-fibronectin increase proangiogenic factor secretion by breast cancer-associated stromal cells. Biomaterials. 54, 63-71 (2015).
- Bruekers, S. M. C., et al. Fibrin-fiber architecture influences cell spreading and differentiation. Cell Adhesion & Migration. 10 (5), 495-504 (2016).
- Yurchenco, P. D. Integrating Activities of Laminins that Drive Basement Membrane Assembly and Function. Curr Top Membr. 76, 1-30 (2015).
- Colognato, H., Winkelmann, D. A., Yurchenco, P. D. Laminin Polymerization Induces a Receptor-Cytoskeleton Network. The Journal of Cell Biology. 145 (3), 619-631 (1999).
- Powell, S. K., Kleinman, H. K. Neuronal laminins and their cellular receptors. International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 29 (3), 401-414 (1997).
- Li, M. L., et al. Influence of a reconstituted basement membrane and its components on casein gene expression and secretion in mouse mammary epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (1), 136-140 (1987).
- Fiore, A., et al. Laminin-111 and the Level of Nuclear Actin Regulate Epithelial Quiescence via Exportin-6. Cell Rep. 19 (10), 2102-2115 (2017).
- Inman, J. L., Robertson, C., Mott, J. D., Bissell, M. J. Mammary gland development: cell fate specification, stem cells and the microenvironment. Development. 142 (6), 1028-1042 (2015).
- Weaver, V. M., et al. Reversion of the malignant phenotype of human breast cells in three-dimensional culture and in vivo by integrin blocking antibodies. Journal of Cell Biology. 137 (1), 231-245 (1997).
- Furuta, S., Ren, G., Mao, J. -H., Bissell, M. J. Laminin signals initiate the reciprocal loop that informs breast-specific gene expression and homeostasis by activating NO, p53 and microRNAs. eLife. 7, 26148 (2018).
- Brown, S. C., et al. Dystrophic phenotype induced in vitro by antibody blockade of muscle alpha-dystroglycan-laminin interaction. Journal of Cell Science. 112 (2), 209 (1999).
- Calof, A. L., Campanero, M. R., O'Rear, J. J., Yurchenco, P. D., Landert, A. D. Domain-specific activation of neuronal migration and neurite outgrowth-promoting activities of laminin. Neuron. 13 (1), 117-130 (1994).
- Li, S., et al. Laminin-sulfatide binding initiates basement membrane assembly and enables receptor signaling in Schwann cells and fibroblasts. The Journal of Cell Biology. 169 (1), 179-189 (2005).
- Sonnenberg, A., et al. Integrin recognition of different cell-binding fragments of laminin (P1, E3, E8) and evidence that alpha 6 beta 1 but not alpha 6 beta 4 functions as a major receptor for fragment E8. The Journal of Cell Biology. 110 (6), 2145-2155 (1990).
- Sorokin, L., Sonnenberg, A., Aumailley, M., Timpl, R., Ekblom, P. Recognition of the laminin E8 cell-binding site by an integrin possessing the alpha 6 subunit is essential for epithelial polarization in developing kidney tubules. The Journal of Cell Biology. 111 (3), 1265-1273 (1990).
- Horejs, C. -M., et al. Biologically-active laminin-111 fragment that modulates the epithelial-to-mesenchymal transition in embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (16), 5908-5913 (2014).
- Hochman-Mendez, C., Cantini, M., Moratal, D., Salmeron-Sanchez, M., Coelho-Sampaio, T. A Fractal Nature for Polymerized Laminin. PLOS ONE. 9 (10), 109388 (2014).
- Kent, A. J., et al. The microstructure of laminin-111 compensates for dystroglycan loss in mammary epithelial cells in downstream expression of milk proteins. Biomaterials. 218, 119337 (2019).
- Weir, M. L., et al. Dystroglycan loss disrupts polarity and beta-casein induction in mammary epithelial cells by perturbing laminin anchoring. Journal of Cell Science. 119, Pt 19 4047-4058 (2006).
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
- Palmero, C. Y., et al. The follicular thyroid cell line PCCL3 responds differently to laminin and to polylaminin, a polymer of laminin assembled in acidic pH. Molecular and Cellular Endocrinology. 376 (1), 12-22 (2013).
- Hochman-Mendez, C., Lacerda de Menezes, J. R., Sholl-Franco, A., Coelho-Sampaio, T.
- Leal-Lopes, C., Grazioli, G., Mares-Guia, T. R., Coelho-Sampaio, T., Sogayar, M. C. Polymerized laminin incorporation into alginate-based microcapsules reduces pericapsular overgrowth and inflammation. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 13 (10), 1912-1922 (2019).
- Paccola Mesquita, F. C., Hochman-Mendez, C., Morrissey, J., Sampaio, L. C., Taylor, D. A. Laminin as a Potent Substrate for Large-Scale Expansion of Human Induced Pluripotent Stem Cells in a Closed Cell Expansion System. Stem Cells International. 2019, 9 (2019).
- Walker, J. M. The Protein Protocols Handbook. Walker, J. M. , Humana Press. 61-67 (2002).
- Freshney, R. I. Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Techniques. 7th edition. , John Wiley and Sons. (2016).
- Mandelbrot, B. The Fractal Geometry of Nature. , WH Freedman and Company. (1982).
- Schittny, J. C., Yurchenco, P. D. Terminal short arm domains of basement membrane laminin are critical for its self-assembly. Journal of Cell Biology. 110 (3), 825-832 (1990).
- Schuger, L., Yurchenco, P., Relan, N. K., Yang, Y. Laminin fragment E4 inhibition studies: basement membrane assembly and embryonic lung epithelial cell polarization requires laminin polymerization. International Journal of Developmental Biology. 42 (2), 217-220 (1998).
- Colognato, H., Yurchenco, P. D. Form and function: the laminin family of heterotrimers. Developmental Dynamics. 218 (2), 213-234 (2000).
- Kabaeva, Z., Meekhof, K. E., Michele, D. E. Sarcolemma instability during mechanical activity in Large myd cardiac myocytes with loss of dystroglycan extracellular matrix receptor function. Human Molecular Genetics. 20 (17), 3346-3355 (2011).
