Summary
Describimos tres métodos para generar polímeros Ln1 con propiedades fractales que señalan a las células de manera diferente en comparación con Ln1 no polimerizado.
Abstract
La laminina-111 (Ln1) es una parte esencial de la matriz extracelular en los epitelios, los sistemas muscular y neural. Hemos demostrado previamente que la microestructura de Ln1 altera la forma en que envía señales a las células, posiblemente porque el ensamblaje de Ln1 en redes expone diferentes dominios adhesivos. En este protocolo, describimos tres métodos para generar Ln1 polimerizado.
Introduction
A diferencia de los factores de crecimiento o las citocinas, las proteínas de la matriz extracelular (MEC) pueden ensamblarse en redes estructurales. Dado que la disfunción de la MEC es un elemento clave de muchas enfermedades, los mecanismos por los cuales las células detectan y transducen señales de la composición, la microestructura y la biomecánica de la MEC son objetivos atractivos para el desarrollo terapéutico. Cada vez hay más pruebas que sugieren que la microestructura de estas redes desempeña un papel importante en la forma en que estas proteínas envían señales a las células. Hasta la fecha, se ha demostrado esta relación entre la microestructura de la MEC y la función celular para el colágenoI1, la fibronectina2 y la fibrina3.
La laminina-111 (Ln1) es una proteína trimérica en forma de cruz que es un componente estructural clave de la matriz extracelular que contacta con las células epiteliales4, las células musculares5 y las células neurales6. En la glándula mamaria, Ln1 es necesaria para la diferenciación funcional de las células epiteliales de la glándula mamaria en células productoras de leche 7,8,9, y Ln1 es crucial para la inducción de la reversión tumoral10,11. Ln1 y otras lamininas son necesarias para el desarrollo de las redes corticales de actina y la organización del sarcolema en el músculo12,13, y para la migración de las células neurales y el crecimiento de neuritas13 . Por lo tanto, la comprensión de los mecanismos por los cuales la laminina envía señales a las células es un área activa de investigación.
Ln1 contiene múltiples dominios adhesivos para una amplia gama de receptores, incluyendo integrinas, sindecanos, distroglicanos, LBP-110 y LamR (Figura 1A)4,14. El fragmento E8, que contiene los dominios globulares c-terminales de la laminina α1, es necesario para la unión del distroglicano y las integrinas α6β1 y α3β115, y es necesario para la diferenciación funcional de las células epiteliales 15,16. Por el contrario, los brazos cortos muestran una actividad biológica diferente17, lo que significa que la disponibilidad para el reconocimiento de estos diferentes dominios Ln1 después de la formación de la red podría alterar el comportamiento celular.
Recientemente hemos demostrado que Ln1 dispuesto en una red polimérica exhibe propiedades fractales (es decir, una estructura que es autosimilar a través de múltiples escalas de longitud)18. Las redes fractales señalan de manera diferente a las células epiteliales en comparación con Ln1, que carece de esta disposición19. Esta red fractal indica una estructura de ensamblaje particular, donde el brazo largo está expuesto preferentemente a las celdas18. Como resultado de esta exhibición diferente de brazos largos, las células epiteliales experimentan una diferenciación funcional en células productoras de leche con uniones estrechas bien organizadas y supresión de las fibras de estrés de actina19.
Describimos 3 métodos para generar redes Ln1 a partir de interacciones de unión de brazo corto-brazo corto, que muestran un alto despliegue del brazo largo Ln1: 1) por ensamblaje libre de células con tampones ácidos, 2) por co-incubación con glicoproteínas, o 3) por interacción con distroglicano de superficie celular. Estos tres métodos generan microestructuras similares de laminina a través de tres mecanismos muy diferentes, lo que permite flexibilidad en el diseño experimental. Trabajos previos sugieren que estos tres métodos podrían representar la robustez biológica: en los epitelios de la glándula mamaria, el distroglicano de la superficie celular, las glicoproteínas o la laminina estructurada artificialmente pueden inducir la diferenciación funcional19. Por lo tanto, los investigadores pueden elegir entre estos métodos en función del sujeto de estudio: las células que expresan distroglicanos no muestran sensibilidad a la microestructura de Ln-1, ya que el distroglicano en la membrana celular induce una polimerización correcta en una red fractal19,20. Matrigel, una mezcla de lamininas y glicoproteínas21, representa la fuente más económica de Ln-1, y ofrece la microestructura necesaria para inducir a las células mamarias knockout de distroglicanos a diferenciarse20, pero contiene una mezcla compleja de proteínas con una variabilidad de mucho a lote. PolyLM representa el sistema más limpio y reduccionista que proporciona esta función, pero a mayor costo y menor eficacia para inducir la diferenciación de las células mamarias en comparación con Matrigel19.
Estos tres métodos tienen una estructura de red fractal característica de agregación limitada por difusión18,19, y muestran una actividad biológica alterada en comparación con la laminina agregada en múltiples sistemas experimentales 22,23,24,25. Futuros estudios que utilicen estos métodos podrían identificar los receptores y la señalización necesarios para la diferenciación epitelial y determinar el restablecimiento de las interacciones normales célula-matriz en células en microambientes anormales20, como los tumores.
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Protocol
1. Descongelación y laminina alícuota-111
NOTA: La laminina-111 purificada está disponible comercialmente (normalmente purificada a partir de la matriz de EHS vendida como Matrigel), pero no todas las fuentes proporcionan proteínas intactas y no degradadas.
- Confirme que Ln1 no se degrada mediante la obtención de Ln1 y la cromatografía de exclusión de tamaño26 o la electroforesis en gel de poliacrilamida26. El Ln1 desnaturalizado debe tener bandas a 337 kDa, 197 kDa y 177 kDa, y el Ln1 nativo debe tener una sola banda a 711 kDa.
- Descongele Ln1 en hielo en un refrigerador durante la noche y alícuota en tubos de microcentrífuga de baja unión a proteínas (generalmente alícuotas a 100 μg/tubo para superposiciones de cultivo, o 10 μg para recubrimientos) utilizando puntas de baja unión a proteínas y técnica estéril27. Congelar las alícuotas y almacenar a -80 °C.
2. Polimerización de laminina utilizando tampones de pH bajo
- Hacer tampón de polimerización polyLM: Pesar y mezclar 1 mM de CaCl2 y 20 mM de acetato de sodio en agua ultrapura. A continuación, ajuste el pH a 4,0, utilizando HCl o ácido acético. Filtrar estérilmente a través de un filtro de 0,2 μm y almacenar a 4 °C.
- Hacer tampón de polimerización de control: Mezclar 1 mM de CalCl2 y 20 mM de Tris y ajustar el pH a 7,0, utilizando 10 N HCl o 12 N NaOH según sea necesario. Filtrar estérilmente a través de un filtro de 0,2 μm y almacenar a 4 °C.
NOTA: El protocolo se puede pausar aquí. - Descongele la cantidad necesaria de alícuotas Ln-1 en un refrigerador durante la noche.
- Utilizando la técnica de cultivo celular estéril, añadir el tampón adecuado (tampón de polimerización polyLM del paso 2.1 o tampón de polimerización de control del paso 2.2) a las alícuotas de laminina a una concentración final de 100 μg/ml (es decir, añadir 0,5 ml a 50 μg de alícuotas) y mezclar suavemente mediante pipeteo.
- Si utiliza laminina marcada con fluorescencia para la visualización, reconstituir y añadir en una proporción de 1:50 peso/peso (por ejemplo, 2 μg/100 μg) y mezclar suavemente mediante pipeteo.
NOTA: Si utiliza lamininas como sustrato para la unión de células, siga los pasos 2.6-2.8: - Inmediatamente después de la dilución en tampón adecuado, transferir las lamininas al plástico o cristalería de cultivo e incubar durante la noche en una incubadora de cultivo celular a 37 °C. Tenga en cuenta que al recubrir cubreobjetos, agregue un volumen lo suficientemente grande como para producir una gota equilibrada (normalmente, use 50 μL para un cubreobjetos redondo de 13 mm) y manténgalo en una cámara humidificada durante la noche a 37 ° C.
- Utilizando la técnica estéril27, lavar con 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS).
- Retire el líquido con cuidado. No permita que la superficie esté completamente seca.
NOTA: Si usa lamininas para cubrir las células para la inducción de proteínas de la leche, siga los pasos 2.9-2.12: - Cultivo de células epiteliales mamarias. Cultivo de células knock-in de distroglicano MepG (DgKI) o células knock-in de distroglicano MepG (DgKO) en DMEM-F12 suplementadas con FBS al 2%, 0,01 mg/ml de insulina, 0,005 μg/ml de EGF, 0,05 mg/ml de gentamicina y 0,05 g/ml de normocina.
- Células de semillas DgKO y DgKI para la estimulación de lamininas a 10.500 células/cm2 en placas de pocillos o placas de fondo de cubreobjetos
- Incubar lamininas diluidas en una incubadora de cultivo celular a 37 °C durante 30 min.
- Centrifugar las alícuotas de polyLM a 2.000 x g durante 20 minutos, pero centrifugar LM en pH neutro a 20.000 x g durante 20 minutos debido al menor tamaño de las entidades proteicas y a la necesidad de velocidades más altas para recolectar de manera efectiva.
- Utilizando la técnica estéril27, retire el sobrenadante suavemente y vuelva a suspender en un volumen adecuado de medio de inducción de DMEM-F12 suplementado con 3 μg/ml de prolactina, 2,8 μM de hidrocortisona y 5 μg/ml de insulina
- Transfiera laminina en medio de cultivo celular inmediatamente para estimular las células. Hemos estimulado con éxito células con 50-800 μg/mL Ln1
3. Polimerización de laminina mediante glicoproteínas aisladas
- Descongele el nidogen-1 y el Ln1 recombinantes suavemente en hielo en el refrigerador durante la noche.
- Mezclar Ln1 con nidogen-1 en una relación peso/peso de 1:1 en medio de cultivo celular utilizando puntas y tubos de baja unión a proteínas y utilizando una técnica estéril. Utilice Ln1 puro en medio de cultivo celular como control.
- Si utiliza laminina marcada con fluorescencia para la visualización, reconstituya y agregue en una relación de 1:50 en peso/peso (p. ej., 2 μg/100 μg). Mezclar suavemente pipeteando.
- Incubar Ln1-nidogen o controlar Ln1 en una incubadora de cultivo celular a 37 °C durante 30 min.
- Centrifugar los copolímeros Ln1-nidogen a 2.000 x g durante 30 min y el control Ln1 a 20.000 x g durante 30 min.
- Retirar suavemente el sobrenadante y volver a suspender en medio de cultivo celular hasta una concentración final de 100-800 μg de proteína total/mL.
- Utilizar inmediatamente para estimular las células, o transferir a cubreobjetos y dejar adherir durante la noche a 37 °C en incubadoras de cultivos celulares humidificadas.
- Retire el medio de cultivo de los cubreobjetos, lávelos con 1x PBS y luego fíjelos con formalina al 10% (es decir, formaldehído al 4% en PBS) durante 15 minutos a temperatura ambiente.
4. Polimerización de laminina utilizando células que expresan distroglicanos
- Cultivo de células epiteliales mamarias. Cultivo de células knock-in de distroglicano MepG (DgKI) o células knock-in de distroglicano MepG (DgKO) en DMEM-F12 suplementadas con FBS al 2%, 0,01 mg/ml de insulina, 0,005 μg/ml de EGF, 0,05 mg/ml de gentamicina y 0,05 g/ml de normocina.
- Siembrar células DgKI a 5.000 células/cm2, y sembrar células DgKO a 8.000 células/cm2 debido a diferencias en las tasas de crecimiento. Cultivo a 37 °C en incubadoras humidificadas con cambios de medios cada 2-3 días y pases cada 4-5 días mediante una rigurosa técnica estéril. Cuente las células cuidadosamente con un hemocitómetro o un contador de células automatizado27 para garantizar tasas de crecimiento adecuadas.
- Células semilla para estimulación de laminina a 10.500 células/cm2 en placas de pocillos o placas de fondo de cubreobjetos y cultivo durante 2 días, utilizando células DgKI para generar células fractales Ln1 y DgKO como controles negativos. Descongele Ln-1 suavemente durante la noche en hielo en un refrigerador y luego mezcle con medio de inducción de DMEM-F12 suplementado con 3 μg/ml de prolactina, 2,8 μM de hidrocortisona y 5 μg/ml de insulina. Para una placa de 35 mm, utilice 1 ml de medio de inducción con 50-800 μg de Ln1.
- Si usa Ln1 fluorescente, mezcle en una relación de 50:1 en peso/peso.
- Retire el medio de las células y cúbralo con laminina y medio de inducción de DMEM-F12 suplementado con 3 μg/ml de prolactina, 2,8 μM de hidrocortisona y 5 μg/ml de insulina
- Cultive las células durante 2 días y luego fíjelas con formalina al 10%.
5. Caracterización de la microestructura de la laminina mediante microscopía óptica
- Recoja muestras fijas y lave 3 veces con 1x PBS a temperatura ambiente durante 5 min.
- Bloquear y permeabilizar muestras en 1x PBS con Triton X-100 al 0,5 %, albúmina sérica bovina al 3 %, suero de cabra al 10 % y 40 μg/ml de fragmento de anticuerpo bloqueante antiratón durante 1 h a temperatura ambiente en una cámara humidificada.
NOTA: Triton X-100 es peligroso. Manéjelo con guantes y protección para los ojos y deséchelo adecuadamente. - Mezclar el anticuerpo antilaminina a una dilución de 1:100 con 1x PBS con Triton X-100 al 0,5 % y BSA al 3 % y añadir a las muestras durante 2 h a temperatura ambiente o durante la noche a 4 °C en una cámara humidificada (normalmente se utilizan cajas de puntas con una toallita húmeda de laboratorio en el fondo).
- Retire el anticuerpo primario y lave 3 veces con 1x PBS con Triton X-100 al 0,5 % y BSA al 3 %.
- Añadir un anticuerpo secundario apropiado a una dilución de 1:500 a las muestras en 1x PBS con Triton X-100 al 0,5% y BSA al 3% e incubar a temperatura ambiente en la oscuridad en una cámara humidificada.
- Retire el anticuerpo secundario y lave 3 veces con 1x PBS con Triton X-100 al 0,5 % y BSA al 3 %.
- Para muestras que contengan células, añadir 6 μM de faloidina durante 45 min, seguido de 3 lavados con PBS con Triton X-100 al 0,5% y BSA al 3%, y seguidos de 3 lavados con PBS. A continuación, teñir con 0,1 μg/mL de DAPI en PBS durante 5 minutos.
- Monte las muestras si corresponde.
- Imagen de la estructura ln-1 mediante microscopía confocal de alta resolución. Utilice un microscopio de barrido láser equipado con objetivos de inmersión (inmersión en agua Plan Apochromat 40X/1.1NA o inmersión en aceite Plan Apochromat 63X/1.4NA).
6. Caracterización de construcciones de laminina a través de la dimensión de conteo de cajas
- Analice las propiedades fractales utilizando los algoritmos de dimensión de recuento de cajas disponibles en las cajas de herramientas de Matlab o en ImageJ. Estos métodos umbralizan las imágenes de laminina y trazan en un gráfico logarítmico el número de cajas que contienen Ln1 en comparación con el tamaño de las cajas. La pendiente de la relación entre estos parámetros es la dimensión de conteo de cajas: las geometrías no fractales tendrán una dimensión de 0, 1 o 2, mientras que las geometrías fractales tienen una dimensión no entera28.
NOTA: Los Ln1 tratados con ácido, tratados con glicoproteínas y unidos a células DgKI tienen una dimensión fractal de recuento de cajas de ~1,7, mientras que el Ln1 de control tiene una dimensión fractal de 2,0.
7. Caracterización de construcciones de laminina mediante microscopía electrónica
- Resuspender las lamininas en medios de cultivo celular y dejar que se adsorban a las obleas de sílice durante 90 min en un ambiente húmedo a 37 °C.
- Fijar matrices en glutaraldehído al 2,5% en tampón de cacodilato de sodio 0,1 M a pH 7,2.
NOTA: El glutaraldehído es peligroso y debe manipularse en una campana extractora con guantes y protección para los ojos y desecharse como residuo peligroso. - Matrices de postfijo en tetróxido de osmio al 1% en tampón cacodilato de sodio 0,1 M a pH 7,2.
NOTA: El tetróxido de osmio es peligroso y debe manipularse en una campana extractora con guantes y protección para los ojos y desecharse adecuadamente. El cacodilato es peligroso y debe manipularse en una campana extractora con guantes y protección para los ojos y desecharse adecuadamente. - Lavar 3 veces en tampón de cacodilato de sodio a pH 7,2.
- Deshidratar con concentraciones crecientes de etanol.
- Recubrimiento catódico de matrices con una fina capa de oro.
- Imagen mediante microscopía electrónica de barrido.
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Representative Results
La laminina-111 es una proteína trimérica con tres dominios autoensamblables al final de sus brazos cortos (Figura 1A). Cuando se tratan adecuadamente, los brazos cortos pueden polimerizarse en una red hexagonal (Figura 1B, 1C), que muestra propiedades fractales agregadas limitadas por difusión a escalas espaciales más grandes (Figura 2). La laminina incubada en tampones de pH neutro que contienen calcio forma pequeños agregados visualizados con un anticuerpo anti-Ln1 (Figura 2A), que tienen una dimensión fractal de recuento de cajas de ~2, lo que indica que no hay fractalidad. Por el contrario, Ln1 incubado en tampón pH4 que contiene calcio (Figura 2B), o en tampón neutro con nidogeno-1 (Figura 2C) forma redes de encaje que llenan el espacio con una dimensión fractal de ~1,7 (Figura 3). Ln1 cultivado con células que expresan distroglicanos forma redes de encaje similares (Figura 2D, el recuadro muestra los núcleos celulares).
Cuando se obtienen imágenes de pH7Ln y polyLM con SEM con una resolución creciente, las diferencias en la microestructura se hacen más evidentes. A baja resolución (Figura 2Ei y v), las redes polyLM parecen más dispersas en comparación con pH7-Ln, y a alta resolución, los agregados de pH7-Ln son evidentes (Figura 2E iv), mientras que en polyLM se puede ver una red hexagonal dispersa a alta resolución (Figura 2E viii).
Figura 1: Antecedentes de Ln1 y método de polimerización: R: Ln1 es una proteína trimérica compleja con múltiples dominios adhesivos (se señalan los sitios de unión de receptores), que puede unirse a una variedad de receptores de integrinas y no integrinas (en negro) y formar redes poliméricas mediante la unión de brazo corto y brazo corto (en bronceado). B: Ln1 puede formar una red hexagonal en presencia de iones de calcio y pH bajo, glicoproteínas como el nidogen-1 o distroglicanos de la superficie celular. C: ejemplo de imagen SEM de Ln1 polimerizado que muestra la red hexagonal y el modelo de ensamblaje de Ln1 propuesto. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Datos representativos de la polimerización de Ln1. A: Agregados de Ln1 en tampones neutros con calcio. Cuando se visualiza con un anticuerpo anti-Ln1, se pueden ver pequeños agregados. B: Ln1 en el tampón ácido que contiene calcio se polimeriza en poliLM, que muestra propiedades fractales. C: La mezcla de Ln1-nidogen-1 (1:1 wt/wt) forma polímeros similares. D: Ln1 en medios de cultivo celular neutros tamponados superpuestos a células que expresan distroglicanos muestra una red de encaje similar. Recuadro: contratinción nuclear que muestra la morfología celular. E: Microscopía electrónica de barrido de redes pH7-Ln y polyLM (método spin down) con resolución creciente. En pH7-Ln, los escaneos de baja resolución (i y ii) muestran fibras relativamente compactas, que se resuelven como agregados en escaneos de alta resolución (iii). polyLM a la misma concentración está mucho más extendido (iv&v), y las exploraciones de alta resolución muestran una red hexagonal que llena el espacio (vii). F: Este cambio microestructural hace que las células epiteliales de la glándula mamaria DgKO se diferencien funcionalmente en células productoras de leche19. i: las células estimuladas por pH7-Ln muestran abundantes fibras de estrés de actina (rojo) y zo-1 desorganizado que contiene uniones estrechas (verde), mientras que ii: las células estimuladas por polyLM contienen menos actina filamentosa total, localización lateral de actina en el límite célula-célula y zo-1 bien organizada que contiene uniones estrechas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Estimación de la dimensión fractal con el método de conteo de cajas. A y B: La imagen en bruto de pH7-Ln y polyLM muestra diferencias en la morfología. C&D: estas imágenes tienen un umbral para dar lugar a una imagen en blanco y negro, E&F: luego se calcula el logaritmo de la relación entre el número de cajas que contienen la imagen y el tamaño de la caja. La pendiente media representa la dimensión de conteo de cajas Fd en la que se calcula. El pH7-Ln tiene una dimensión característica de 2,0, lo que indica que no hay propiedades fractales, mientras que el polyLM tiene una dimensión de ~1,7, lo que indica un proceso de agregación limitado por difusión. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Las lamininas representan un elemento clave de la MEC en los sistemas epiteliales, musculares y de órganos neurales, y se ha demostrado in vitro que desempeñan un papel esencial en la regulación de la diferenciación funcional de las células. Cada vez hay más pruebas de que la estructura de la laminina mostrada a las células regula su señalización y el fenotipo celular resultante15,16, por lo que los métodos para controlar la microestructura de Ln1 deberían ser de interés para los biólogos básicos que trabajan en estos campos, y para los ingenieros de tejidos que buscan recapitular el comportamiento normal in vitro. En términos más generales, se sabe que la microestructura de una variedad de proteínas de la matriz extracelular regula la respuesta biológica y la comprensión de los mecanismos por los cuales la microestructura modula la función celular es un área activa de investigación.
En este trabajo, describimos tres métodos para polimerizar laminina en redes con microestructura fractal característica de agregación limitada por difusión. Se ha demostrado que estos polímeros Ln1 señalan de manera diferente a las células en comparación con Ln1 agregado, posiblemente debido a la alteración de la visualización del dominio adhesivo en las células. Estos tres métodos para controlar la microestructura de Ln1 pueden representar redundancia biológica en el ensamblaje de Ln1, pero esto representa un desafío para el trabajo experimental. El control de la microestructura de Ln1 mediante un tratamiento tampón ácido solo mostrará efectos cuando se agregue a las células knockout de distroglicanos19,20. Por lo tanto, el diseño experimental debe considerar las células y la pureza de Ln1 que se va a utilizar. La Ln1 disponible comercialmente se deriva comúnmente de la matriz EHS, que contiene un alto porcentaje de nidógenos y otras glicoproteínas; Ln1 en la matriz EHS polimeriza correctamente en redes fractales en sistemas tampones neutros. La Ln1 recombinante ha estado disponible comercialmente recientemente, pero es excepcionalmente costosa.
La calidad de la proteína Ln1 es crucial para este trabajo, ya que los fragmentos cortos del brazo pueden bloquear la polimerización. Los fragmentos de brazo corto (es decir, el fragmento E4) interfieren con la formación de la red, ya que cada fragmento induce un vacío en la red29. Datos previos muestran que la inclusión de fragmentos de E4 puede bloquear los fenotipos inducidos por Ln129,30. Del mismo modo, hemos encontrado que la formación de la red se ve interrumpida por pequeñas cantidades de laminina-332 (datos no publicados), que al igual que los fragmentos E4 contienen un solo dominio adhesivo29,30. Por lo tanto, es crucial verificar que Ln1 esté intacto y altamente purificado para eliminar otras especies de laminina antes de comenzar a trabajar.
Si bien estos métodos son relevantes para los investigadores que estudian las interacciones célula-matriz, debe tenerse en cuenta que la familia de las lamininas es muy compleja, ya que involucra 15 miembros conocidos y variantes de empalme adicionales31, y esta familia interactúa con una amplia gama de receptores, glicoproteínas, colágenos y potencialmente factores de crecimiento4. Por lo tanto, el Ln1 polimerizado representa un estado reduccionista que se puede esperar que sea modificado rápidamente por la función celular. Además, los diferentes sistemas de órganos detectan, responden y remodelan las lamininas de manera diferente: hemos demostrado que la unión de la laminina a la actina a través del distroglicano es prescindible para la glándula mamaria19, mientras que el distroglicano es absolutamente necesario para la función de los miocitos32.
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Disclosures
Este trabajo fue realizado bajo los auspicios del Departamento de Energía de los Estados Unidos por el Laboratorio Nacional Lawrence Livermore bajo el contrato DE-AC52-07NA27344. Versión IM LLNL-JRNL-799443.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por Lawrence Livermore National Lab LDRD 18-ERD-062 (a C.R.). Gracias a John Muschler por su amable regalo de las células DgKO y DgKI. Gracias al personal del Laboratorio de Microscopía Electrónica de la Universidad de California en Berkeley por su asesoramiento y asistencia en la preparación de muestras de microscopía electrónica y la recopilación de datos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% formalin | Sigma Aldrich | HT501128 | |
| Anti-Laminin primary antibody | Sigma Aldrich | L9393 | |
| Anti-Rabbit Alexafluor 488 secondary antibody | Thermo | A32731 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9418 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C4901 or similar | |
| Cell Culture Incubator | Thermo | Heracell 150 or similar | |
| Centrifuge for microcentrifuge tubes | Eppendorf | 5418 or similar | |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM 710 or equivalent | |
| Coverslips | Thermo | 25CIR-1 or similar | |
| DMEM-F12, Liquid, High Glucose, +HEPES, L-glutamine, +Phenol red | Thermo | 11330107 | |
| EGF (Epidermal Growth Factor) | Sigma Aldrich | 11376454001 | |
| Fluorescently Labeled Laminin | Cytoskeleton Inc | LMN02 | |
| Gentamicin | VWR | VWRV0304-10G | |
| Glutaraldehyde | Sigma Aldrich | G5882 | |
| HCl | Sigma Aldrich | 320331 or similar | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888-5G | |
| Insulin | Sigma Aldrich | 16634-50mg | |
| MepG Dystroglycan Knockout Cells | LBNL | N/A | |
| NaOH | Sigma Aldrich | S8045 or similar | |
| Normocin | Invivogen | ant-nr-1 | |
| Osmium Tetroxide | Sigma Aldrich | 75633 | |
| Ovine Prolactin | Los Angeles Biomedical Research Institute | Ovine Pituitary Prolactin | |
| Phalloidin | Thermo | A22287 | |
| Phosphate Buffered Saline | Thermo | 10010023 or similar | |
| Purified Laminin-111 | Sigma Aldrich | L2020-1MG | |
| Recombinant human Nidogen-1, carrier free | R&D systems | 2570-ND-050 | |
| Sodium Acetate | Sigma Aldrich | S2889 or similar | |
| Sodium Cacodylate | Sigma Aldrich | C0250 | |
| Sterile filters | Millipore | SLGP033RS or similar | |
| Tris | Sigma Aldrich | 252859 or similar | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Ultra-low protein binding tubes | VWR | 76322-516, 76322-522 or similar | |
| Ultrapure water | Thermo | 15230253 or similar |
References
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