Summary
Polimerize edilmemiş Ln1'e kıyasla hücrelere farklı sinyal veren fraktal özelliklere sahip Ln1 polimerleri üretmek için üç yöntem açıklıyoruz.
Abstract
Laminin-111 (Ln1) epitel, kas ve sinir sistemlerinde hücre dışı matriksin önemli bir parçasıdır. Daha önce, Ln1'in mikro yapısının, hücrelere sinyal verme şeklini değiştirdiğini, muhtemelen Ln1'in ağlara montajının farklı yapışkan alanları açığa çıkarması nedeniyle göstermiştik. Bu protokolde, polimerize Ln1 üretmek için üç yöntem açıklıyoruz.
Introduction
Büyüme faktörleri veya sitokinlerin aksine, hücre dışı matriks (ECM) proteinleri yapısal ağlarda birleşebilir. ECM disfonksiyonu birçok hastalık durumunun önemli bir unsuru olduğundan, hücrelerin ECM bileşiminden, mikro yapısından ve biyomekaniğinden gelen sinyalleri algıladığı ve ilettiği mekanizmalar terapötik gelişim için çekici hedeflerdir. Artan kanıtlar, bu ağların mikro yapısının, bu proteinlerin hücrelere nasıl sinyal verdiği konusunda önemli bir rol oynadığını göstermektedir. Bugüne kadar, ECM mikroyapısı ve hücre fonksiyonu arasındaki bu bağlantı, kollajen I1, fibronektin2 ve fibrin3 için gösterilmiştir.
Laminin-111 (Ln1), epitel hücreleri4, kas hücreleri5 ve sinir hücreleri6 ile temas eden hücre dışı matrisin önemli bir yapısal bileşeni olan trimerik, çapraz şekilli bir proteindir. Meme bezinde, Ln1, meme bezi epitel hücrelerinin süt üreten hücrelere 7,8,9 fonksiyonel farklılaşması için gereklidir ve Ln1, tümör geri dönüşünün indüksiyonu için çok önemlidir10,11. Ln1 ve diğer lamininler, kasta kortikal aktin ağlarının ve sarkolemma organizasyonunungelişimi için gereklidir 12,13 ve nöral hücre göçü ve nörit büyümesi13 için gereklidir. Bu nedenle, laminin sinyallerinin hücrelere aktarıldığı mekanizmaları anlamak aktif bir araştırma alanıdır.
Ln1, integrinler, syndekanlar, distroglikan, LBP-110 ve LamR dahil olmak üzere çok çeşitli reseptörler için çoklu yapışkan alanlar içerir (Şekil 1A)4,14. Laminin α1'in c-terminal küresel alanlarını içeren E8 fragmanı, distroglikan ve integrinler α6β1 ve α3β115'in bağlanması için gereklidir ve epitel hücrelerinin fonksiyonel farklılaşması için gereklidir15,16. Buna karşılık, kısa kollar farklı biyolojik aktivitegösterir 17, bu da ağ oluşumundan sonra bu farklı Ln1 alanının tanınmasının hücre davranışını değiştirebileceği anlamına gelir.
Yakın zamanda, polimerik bir ağ halinde düzenlenmiş Ln1'in fraktal özellikler (yani, çoklu uzunluk ölçeklerinde kendine benzer bir yapı) sergilediğini gösterdik.18. Fraktal ağlar, bu düzenlemeden yoksun olan Ln1'e kıyasla epitel hücrelerine farklı sinyal verir19. Bu fraktal ağ, uzun kolun tercihen18 hücrelerine maruz kaldığı belirli bir montaj yapısını gösterir. Bu farklı uzun kol görüntüsünün bir sonucu olarak, epitel hücreleri, iyi organize edilmiş sıkı bağlantılara sahip süt üreten hücrelere fonksiyonel farklılaşmaya ve aktin stres liflerinin baskılanmasına uğrar19.
Ln1 uzun kolunun yüksek bir görüntüsünü gösteren kısa kol-kısa kol bağlanma etkileşimlerinden Ln1 ağları oluşturmak için 3 yöntem açıklıyoruz: 1) asidik tamponlarla hücresiz montaj yoluyla, 2) glikoproteinlerle birlikte inkübasyon yoluyla veya 3) hücre yüzeyi distroglikanı ile etkileşim yoluyla. Bu üç yöntem, deneysel tasarımda esnekliğe izin veren üç farklı mekanizma aracılığıyla benzer laminin mikro yapıları üretir. Önceki çalışmalar, bu üç yöntemin biyolojik sağlamlığı temsil edebileceğini düşündürmektedir: meme bezi epitelinde, hücre yüzeyi distroglikan, glikoproteinler veya yapay olarak yapılandırılmış laminin, fonksiyonel farklılaşmayı indükleyebilir19. Bu nedenle, araştırmacılar çalışma konusuna göre bu yöntemler arasında seçim yapabilirler: distroglikan eksprese eden hücreler, hücre zarındaki distroglikan bir fraktal ağa doğru polimerizasyonu indüklediğinden, Ln-1 mikro yapısına duyarlılık göstermez19,20. Lamininler ve glikoproteinlerin(21) bir karışımı olan Matrigel, Ln-1'in en ekonomik kaynağını temsil eder ve20'yi ayırt etmek için distroglikan nakavt meme hücrelerini indüklemek için gerekli mikro yapıyı sunar, ancak partiden partiye değişkenliğe sahip karmaşık bir protein karışımı içerir. PolyLM, bu işlevi sağlayan en temiz, en indirgemeci sistemi temsil eder, ancak Matrigel19'a kıyasla meme hücresi farklılaşmasını indüklemek için daha yüksek maliyet ve daha düşük etkinlikle.
Bu üç yöntem, difüzyon sınırlı agregasyonun18,19 karakteristik fraktal ağ yapısına sahiptir ve çoklu deney sistemlerinde 22,23,24,25 agrega laminine kıyasla değişmiş biyolojik aktivite gösterir. Bu yöntemleri kullanan gelecekteki çalışmalar, epitelyal farklılaşma için gerekli reseptörleri ve sinyalleri tanımlayabilir ve tümörler gibi anormal mikro ortamlardaki20 hücrelerde normal hücre-matris etkileşimlerini geri yüklemeyi belirleyebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Çözülme ve alikot laminin-111
NOT: Saflaştırılmış laminin-111 ticari olarak temin edilebilir (tipik olarak Matrigel olarak satılan EHS matrisinden saflaştırılır), ancak tüm kaynaklar bozulmamış, bozulmamış protein sağlamaz.
- Ln1 ve çalışan boyut dışlama kromatografisi26 veya poliakrilamid jel elektroforezi26 ile Ln1'in bozulmadığını doğrulayın. Denatüre Ln1, 337 kDa, 197 kDa ve 177 kDa'da bantlara sahip olmalı ve doğal Ln1, 711 kDa'da tek bir banda sahip olmalıdır.
- Ln1'i gece boyunca buzdolabında buz üzerinde çözdürün ve düşük protein bağlayıcı mikrosantrifüj tüplerine (tipik olarak kültür kaplamaları için 100 μg / tüpte veya kaplamalar için 10 μg'da alikot) düşük protein bağlama uçları ve steril teknik kullanarak27. Bitkileri dondurun ve -80 °C'de saklayın.
2. Düşük pH tamponları kullanarak laminin polimerizasyonu
- PolyLM polimerizasyon tamponu yapın: 1 mM CaCl2 ve 20 mM sodyum asetatı ultra saf suda tartın ve karıştırın. Ardından HCl veya asetik asit kullanarak pH'ı 4.0'a ayarlayın. 0,2 μm filtreden steril filtre ve 4 ° C'de saklayın.
- Kontrol polimerizasyon tamponu yapın: 1 mM CalCl2 ve 20 mM Tris'i karıştırın ve gerektiğinde 10 N HCl veya 12 N NaOH kullanarak pH'ı 7.0'a ayarlayın. 0,2 μm filtreden steril filtre ve 4 ° C'de saklayın.
NOT: Protokol burada duraklatılabilir. - Gerekli sayıda Ln-1 alikotunu bir gece buzdolabında çözdürün.
- Steril hücre kültürü tekniğini kullanarak, 100 μg/mL'lik bir nihai konsantrasyonda laminin alikotlara uygun tamponu (adım 2.1'den poliLM polimerizasyon tamponu veya adım 2.2'den kontrol polimerizasyon tamponu) ekleyin (yani 0.5 mL ila 50 μg alikot ekleyin) ve pipetleme ile hafifçe karıştırın.
- Görselleştirme için floresan etiketli laminin kullanıyorsanız, sulandırın ve ağırlıkça 1:50 oranında (örn. 2 μg/100 μg) ekleyin ve pipetleyerek hafifçe karıştırın.
NOT: Hücre bağlantısı için substrat olarak lamininler kullanıyorsanız, 2.6-2.8 adımlarını izleyin: - Uygun tamponda seyreltildikten hemen sonra, lamininleri kültür plastiğine veya cam eşyalara aktarın ve gece boyunca 37 °C'de bir hücre kültürü inkübatöründe inkübe edin. Lamelleri kaplarken, dengeli bir damla oluşturacak kadar büyük bir hacim ekleyin (tipik olarak, 13 mm'lik yuvarlak bir lamel için 50 μL kullanın) ve gece boyunca 37 °C'de nemlendirilmiş bir odada tutun.
- Steril teknik27 kullanarak, 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın.
- Sıvıyı dikkatlice çıkarın. Yüzeyin tamamen kurumasına izin vermeyin.
NOT: Süt proteini indüksiyonu için hücreleri kaplamak için lamininler kullanıyorsanız, 2.9-2.12 adımlarını izleyin: - Kültür meme epitel hücreleri. % 2 FBS, 0.01 mg / mL insülin, 0.005 μg / mL EGF, 0.05 mg / mL gentamisin ve 0.05 g / mL normosin ile desteklenmiş DMEM-F12'deki MepG distroglikan knock in (DgKI) veya MepG distroglikan nakavt hücreleri (DgKO) hücreleri.
- Tohum DgKO ve DgKI hücreleri, 10.500 hücre/cm2'de laminin stimülasyonu için kuyucuk plakalarında veya lamel alt tabaklarında
- Seyreltilmiş lamininleri bir hücre kültürü inkübatöründe 37 °C'de 30 dakika inkübe edin.
- PolyLM alikotlarını 20 dakika boyunca 2.000 x g'da santrifüjleyin, ancak protein varlıklarının daha küçük boyutu ve etkili bir şekilde toplamak için daha yüksek hızlara ihtiyaç duyulması nedeniyle LM'yi 20 dakika boyunca 20.000 x g'da nötr pH'da santrifüjleyin.
- Steril teknik27 kullanarak, süpernatanı nazikçe çıkarın ve 3 μg/mL prolaktin, 2.8 μM hidrokortizon ve 5 μg/mL insülin ile desteklenmiş DMEM-F12'nin uygun bir hacimde indüksiyon ortamında yeniden süspanse edin
- Hücreleri uyarmak için laminini hemen hücre kültürü ortamına aktarın. 50-800 μg/mL Ln1 ile hücreleri başarıyla uyardık
3. İzole edilmiş glikoproteinler kullanılarak laminin polimerizasyonu
- Rekombinant nidogen-1 ve Ln1'i gece boyunca buzdolabında buz üzerinde hafifçe çözdürün.
- Düşük protein bağlayıcı uçlar ve tüpler kullanarak ve steril teknik kullanarak hücre kültürü ortamında Ln1'i ağırlıkça 1: 1 oranında nidogen-1 ile karıştırın. Kontrol olarak hücre kültürü ortamında saf Ln1 kullanın.
- Görselleştirme için floresan etiketli laminin kullanıyorsanız, sulandırın ve ağırlıkça 1:50 oranında ekleyin (örn., 2 μg/100 μg). Pipetleme ile yavaşça karıştırın.
- Ln1-nidogen inkübe edin veya Ln1'i bir hücre kültürü inkübatöründe 37 ° C'de 30 dakika inkübe edin.
- Ln1-nidogen kopolimerlerini 2.000 x g'da 30 dakika santrifüjleyin ve kontrol Ln1'i 20.000 x g'de 30 dakika santrifüjleyin.
- Süpernatanı nazikçe çıkarın ve hücre kültürü ortamında 100-800 μg toplam protein / mL'lik bir nihai konsantrasyona kadar yeniden süspanse edin.
- Hücreleri uyarmak için hemen kullanın veya lamellere aktarın ve nemlendirilmiş hücre kültürü inkübatörlerinde 37 ° C'de gece boyunca yapışmasına izin verin.
- Lamellerden kültür ortamını çıkarın, lamelleri 1x PBS ile yıkayın ve ardından oda sıcaklığında 15 dakika boyunca %10 formalin (yani PBS'de %4 formaldehit) ile sabitleyin.
4. Distroglikan eksprese eden hücreler kullanılarak laminin polimerizasyonu
- Kültür meme epitel hücreleri. % 2 FBS, 0.01 mg / mL insülin, 0.005 μg / mL EGF, 0.05 mg / mL gentamisin ve 0.05 g / mL normosin ile desteklenmiş DMEM-F12'deki MepG distroglikan knock in (DgKI) veya MepG distroglikan nakavt hücreleri (DgKO) hücreleri.
- Büyüme oranlarındaki farklılıklar nedeniyle 5.000 hücre/cm2'de DgKI hücrelerini ve 8.000 hücre/cm2'de DgKO hücrelerini tohumlayın. Nemlendirilmiş inkübatörlerde 37 °C'de kültür, her 2-3 günde bir değişir ve titiz bir steril teknik kullanılarak her 4-5 günde bir geçer. Uygun büyüme oranlarını sağlamak için hücreleri bir hemositometre veya otomatik hücre sayacı27 ile dikkatlice sayın.
- Negatif kontroller olarak fraktal Ln1 ve DgKO hücreleri oluşturmak için DgKI hücrelerini kullanarak, 2 gün boyunca kuyucuk plakalarında veya lamel alt tabaklarında ve kültürde 10.500 hücre/cm2'de laminin stimülasyonu için tohum hücreleri. Ln-1'i bir buzdolabında buz üzerinde gece boyunca hafifçe çözdürün ve ardından 3 μg / mL prolaktin, 2.8 μM hidrokortizon ve 5 μg / mL insülin ile desteklenmiş DMEM-F12'nin indüksiyon ortamı ile karıştırın. 35 mm'lik bir tabak için, 50-800 μg Ln1 içeren 1 mL indüksiyon ortamı kullanın.
- Floresan Ln1 kullanıyorsanız, ağırlıkça 50:1 oranında karıştırın.
- Ortamı hücrelerden çıkarın ve 3 μg/mL prolaktin, 2.8 μM hidrokortizon ve 5 μg/mL insülin ile desteklenmiş DMEM-F12'nin laminin ve indüksiyon ortamıyla kaplayın
- Hücreleri 2 gün boyunca kültürleyin ve daha sonra% 10 formalin ile sabitleyin.
5. Laminin mikroyapısının optik mikroskopi ile karakterizasyonu
- Sabit numuneleri toplayın ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 1x PBS ile 3 kez yıkayın.
- Nemlendirilmiş bir odada oda sıcaklığında 1 saat boyunca %0.5 Triton X-100, %3 sığır serum albümini, %10 keçi serumu ve 40 μg/mL anti-fare bloke edici antikor fragmanı ile 1x PBS'de numuneleri bloke edin ve geçirgenleştirin.
NOT: Triton X-100 tehlikelidir. Eldiven ve göz koruması ile tutun ve uygun şekilde atın. - Anti-laminin antikorunu 1:100 oranında 1x PBS ile %0.5 Triton X-100 ve %3 BSA ile karıştırın ve numunelere oda sıcaklığında 2 saat veya gece boyunca nemlendirilmiş bir odada 4 °C'de ekleyin (tipik olarak altta ıslak bir laboratuvar mendili olan uç kutuları kullanın).
- Birincil antikoru çıkarın ve% 0.5 Triton X-100 ve% 3 BSA ile 1x PBS ile 3 kez yıkayın.
- % 0.5 Triton X-100 ve% 3 BSA ile 1x PBS'deki örneklere 1:500 seyreltmede uygun bir ikincil antikor ekleyin ve oda sıcaklığında karanlıkta nemlendirilmiş bir odada inkübe edin.
- İkincil antikoru çıkarın ve% 0.5 Triton X-100 ve% 3 BSA ile 1x PBS ile 3 kez yıkayın.
- Hücre içeren numuneler için, 45 dakika boyunca 6 μM phalloidin ekleyin, ardından% 0.5 Triton X-100 ve% 3 BSA ile PBS ile 3 yıkama ve ardından PBS ile 3 yıkama yapın. Daha sonra PBS'de 0.1 μg/mL DAPI ile 5 dakika boyayın.
- Uygunsa numuneleri monte edin.
- Yüksek çözünürlüklü konfokal mikroskopi kullanan görüntü ln-1 yapısı. Daldırma objektifleri ile donatılmış bir lazer tarama mikroskobu kullanın (suya daldırma Plan Apochromat 40X/1.1NA veya yağa daldırma Plan Apochromat 63X/1.4NA).
6. Kutu sayma boyutu ile laminin yapılarının karakterizasyonu
- Matlab araç kutularında veya ImageJ'de bulunan kutu sayma boyut algoritmalarını kullanarak fraktal özellikleri analiz edin. Bu yöntemler, laminin eşik görüntülerini ve bir log-log üzerine çizer, kutuların boyutuna kıyasla Ln1 içeren kutu sayısını çizer. Bu parametreler arasındaki ilişkinin eğimi kutu sayma boyutudur: fraktal olmayan geometrilerin boyutu 0, 1 veya 2 iken, fraktal geometrilerin tamsayı olmayan boyutu28 olacaktır.
NOT: Asitle muamele edilmiş, glikoprotein ile muamele edilmiş ve DgKI hücresine bağlı Ln1'in tümü ~1.7'lik bir kutu sayma fraktal boyutuna sahipken, kontrol Ln1'in fraktal boyutu 2.0'dır.
7. Elektron mikroskobu ile laminin yapılarının karakterizasyonu
- Hücre kültürü ortamında lamininleri yeniden süspanse edin ve nemli 37 °C ortamda 90 dakika boyunca silika gofretlere adsorbe edilmesine izin verin.
- Matrisleri pH 7.2'de 0.1 M sodyum kakodilat tamponunda %2.5 glutaraldehit içinde sabitleyin.
NOT: Gluteraldehit tehlikelidir ve çeker ocakta eldiven ve göz koruması ile kullanılmalı ve tehlikeli atık olarak atılmalıdır. - pH 7.2'de 0.1 M sodyum kakodilat tamponunda %1 osmiyum tetroksit içinde sonek matrisleri.
NOT: Osmiyum tetroksit tehlikelidir ve çeker ocakta eldiven ve göz koruması ile kullanılmalı ve uygun şekilde atılmalıdır. Kakodilat tehlikelidir ve çeker ocakta eldiven ve göz koruması ile kullanılmalı ve uygun şekilde atılmalıdır. - pH 7.2'de sodyum kakodilat tamponunda 3 kez yıkayın.
- Artan etanol konsantrasyonları ile dehidrat.
- İnce bir altın tabakası ile matrisleri püskürtün.
- Taramalı elektron mikroskobu kullanılarak görüntü.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Laminin-111, kısa kollarının ucunda kendi kendine birleşen üç alana sahip trimerik bir proteindir (Şekil 1A). Uygun şekilde işlendiğinde, kısa kollar, daha büyük uzamsal ölçeklerde difüzyonla sınırlı agrega fraktal özellikleri gösteren altıgen bir kafes (Şekil 1B,1C) halinde polimerize olabilir (Şekil 2). Kalsiyum içeren nötr-pH tamponlarında inkübe edilen laminin, bir anti-Ln1 antikoru ile görselleştirilen küçük agregalar oluşturur (Şekil 2A), ~2'lik bir kutu sayma fraktal boyutuna sahip olan ve fraktalite olmadığını gösterir. Buna karşılık, kalsiyum içeren pH4 tamponunda (Şekil 2B) veya nidogen-1 (Şekil 2C) ile nötr tamponda inkübe edilen Ln1, fraktal boyutu ~1.7 olan boşluk dolduran dantelli ağlar oluşturur (Şekil 3). Distroglikan eksprese eden hücrelerle kültürlenen Ln1, benzer dantelli ağlar oluşturur (Şekil 2D, ekte hücre çekirdeklerini gösterir).
pH7Ln ve polyLM SEM ile artan çözünürlükte görüntülendiğinde, mikroyapıdaki farklılıklar daha belirgin hale gelir. Düşük çözünürlükte (Şekil 2Ei ve v), poliLM ağları pH7-Ln'ye kıyasla daha yayılmış görünür ve yüksek çözünürlükte pH7-Ln agregaları belirgindir (Şekil 2E iv), oysa poliLM'de yüksek çözünürlükte yayılmış altıgen bir kafes görülebilir (Şekil 2E viii).
Şekil 1: Ln1'in arka planı ve polimerizasyon yöntemi: C: Ln1, çeşitli integrin ve integrin olmayan reseptörleri (siyah) bağlayabilen ve kısa kol-kısa kol bağlanmasıyla (bronz olarak) polimerik ağlar oluşturabilen, çoklu yapışkan alanlara (reseptör bağlanma bölgeleri not edilmiştir) sahip karmaşık bir trimerik proteindir. B: Ln1, kalsiyum iyonları ve düşük pH, nidogen-1 gibi glikoproteinler veya hücre yüzeyi distroglikanının varlığında altıgen bir kafes oluşturabilir. C: altıgen kafesi ve önerilen Ln1 montaj modelini gösteren polimerize Ln1'in örnek SEM görüntüsü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Ln1 polimerizasyonu için temsili veriler. C: Ln1, kalsiyum içeren nötr tamponlarda toplanır. Bir anti-Ln1 antikoru ile görüntülendiğinde, küçük agregalar görülebilir. B: Asidik kalsiyum içeren tampondaki Ln1, fraktal özellikler gösteren poliLM'ye polimerize olur. C: Ln1-nidogen-1 karışımı (ağırlıkça 1:1 ağırlıkça) benzer polimerler oluşturur. D: Distroglikan eksprese eden hücreler üzerine bindirilmiş nötr tamponlu hücre kültürü ortamındaki Ln1, benzer bir dantelli ağ gösterir. Ek: hücre morfolojisini gösteren nükleer karşı boyama. E: pH7-Ln ve polyLM ağlarının (spin down yöntemi) artan çözünürlükle taramalı elektron mikroskobu. PH7-Ln'de, düşük çözünürlüklü taramalar (i ve ii), yüksek çözünürlüklü taramalarda (iii) agrega olarak çözülen nispeten kompakt lifler gösterir. Aynı konsantrasyondaki polyLM çok daha fazla yayılır (iv&v) ve yüksek çözünürlüklü taramalar altıgen, boşluk dolduran bir kafes (vii) gösterir. F: Bu mikroyapısal değişiklik, DgKO meme bezi epitel hücrelerinin fonksiyonel olarak süt üreten hücrelere farklılaşmasına neden olur19. i: pH7-Ln ile uyarılan hücreler bol miktarda aktin stres lifi (kırmızı) ve sıkı bağlantılar içeren düzensiz zo-1 (yeşil) gösterirken, ii: poliLM ile uyarılan hücreler daha az toplam filamentli aktin içerir, aktinin hücre-hücre sınırına lateral lokalizasyonu ve iyi organize edilmiş zo-1 sıkı bağlantılar içerir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Kutu sayma yöntemi ile fraktal boyut tahmini. A&B: pH7-Ln ve polyLM'nin ham görüntüsü morfolojide farklılıklar gösterir. C&D: bu görüntüler siyah beyaz bir görüntüye yol açacak şekilde eşiklenir, E&F: daha sonra görüntüyü içeren kutu sayısının kutunun boyutuna oranının günlüğü hesaplanır. Ortalama eğim, Fd'nin hesaplandığı kutu sayma boyutunu temsil eder. pH7-Ln, fraktal özellik olmadığını gösteren 2.0'lık bir karakteristik boyuta sahipken, poliLM, difüzyonla sınırlı bir agregasyon sürecinin göstergesi olan ~1.7'lik bir boyuta sahiptir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Lamininler, epitel, kas ve nöral organ sistemlerinde ECM'nin önemli bir unsurunu temsil eder ve in vitro hücrelerin fonksiyonel farklılaşmasını düzenlemede önemli roller oynadığı gösterilmiştir. Artan kanıtlar, hücrelere gösterilen laminin yapısının, sinyalizasyonunu ve sonuçta ortaya çıkan hücre fenotipini15,16 düzenlediğini göstermektedir, bu nedenle Ln1 mikroyapısını kontrol etme yöntemleri, bu alanlarda çalışan temel biyologların ve in vitro normal davranışı özetlemek isteyen doku mühendislerinin ilgisini çekmelidir. Daha genel olarak, çeşitli hücre dışı matriks proteinlerinin mikro yapısının biyolojik yanıtı düzenlediği bilinmektedir ve mikroyapının hücre fonksiyonunu modüle ettiği mekanizmaları anlamak aktif bir araştırma alanıdır.
Bu çalışmada, laminini, difüzyon sınırlı agregasyonun fraktal mikro yapı karakteristiğine sahip ağlara polimerize etmek için üç yöntem açıklıyoruz. Bu Ln1 polimerlerinin, potansiyel olarak hücrelere değişen yapışkan alan gösterimi nedeniyle, toplanmış Ln1'e kıyasla hücrelere farklı sinyal verdiği gösterilmiştir. Ln1 mikroyapısını kontrol etmek için bu üç yöntem, Ln1'in montajında biyolojik fazlalığı temsil edebilir, ancak bu deneysel çalışma için bir zorluk teşkil eder. Asidik tampon tedavisi kullanılarak Ln1 mikroyapısının kontrol edilmesi, yalnızca distroglikan nakavt hücrelerineeklendiğinde etki gösterecektir 19,20. Bu nedenle, deneysel tasarım, kullanılacak hücreleri ve Ln1'in saflığını dikkate almalıdır. Ticari olarak temin edilebilen Ln1, yaygın olarak yüksek oranda nidogen ve diğer glikoproteinler içeren EHS matrisinden türetilir; EHS matrisindeki Ln1, nötr tamponlu sistemlerde fraktal ağlara doğru şekilde polimerize olur. Rekombinant Ln1 yakın zamanda ticari olarak kullanıma sunulmuştur, ancak son derece maliyetlidir.
Ln1 protein kalitesi bu iş için çok önemlidir, çünkü kısa kol parçaları polimerizasyonu engelleyebilir. Kısa kol parçaları (yani, E4 parçası), her parça ağda bir boşluğa neden olduğu için ağ oluşumuna müdahale eder29. Önceki veriler, E4 fragmanlarının dahil edilmesinin Ln1 kaynaklı fenotipleri bloke edebileceğini göstermektedir29,30. Benzer şekilde, ağ oluşumunun, E4 fragmanları gibi tek bir yapışkan alan29,30 içeren küçük miktarlarda laminin-332 (yayınlanmamış veriler) tarafından bozulduğunu bulduk. Bu nedenle, çalışmaya başlamadan önce Ln1'in sağlam olduğunu ve diğer laminin türlerini çıkarmak için yüksek oranda saflaştırıldığını kontrol etmek çok önemlidir.
Bu yöntemler hücre-matris etkileşimlerini inceleyen araştırmacılarla ilgili olsa da, laminin ailesinin oldukça karmaşık olduğu, bilinen 15 üyeyi ve ek ekleme varyantlarını31 içerdiği ve bu ailenin çok çeşitli reseptörler, glikoproteinler, kollajenler ve potansiyel olarak büyüme faktörleri ile etkileşime girdiği belirtilmelidir4. Bu nedenle, polimerize Ln1, hücre fonksiyonu tarafından hızla değiştirilmesi beklenebilecek indirgemeci bir durumu temsil eder. Ayrıca, farklı organ sistemleri lamininleri farklı şekilde algılar, bunlara yanıt verir ve yeniden şekillendirir: lamininin distroglikan yoluyla aktine bağlanmasının meme bezi19 için vazgeçilebilir olduğunu, oysa distroglikanın miyosit fonksiyonu32 için kesinlikle gerekli olduğunu gösterdik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Bu çalışma, ABD Enerji Bakanlığı'nın himayesinde, Lawrence Livermore Ulusal Laboratuvarı tarafından DE-AC52-07NA27344 Sözleşmesi kapsamında gerçekleştirilmiştir. IM sürümü LLNL-JRNL-799443.
Acknowledgments
Bu çalışma Lawrence Livermore Ulusal Laboratuvarı LDRD 18-ERD-062 (C.R.'ye) tarafından finanse edildi. John Muschler'e DgKO ve DgKI hücrelerine verdiği nazik hediye için teşekkürler. Elektron mikroskobu numunesi hazırlama ve veri toplama konusunda tavsiye ve yardım için California Üniversitesi Berkeley Elektron Mikroskobu Laboratuvarı personeline teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% formalin | Sigma Aldrich | HT501128 | |
| Anti-Laminin primary antibody | Sigma Aldrich | L9393 | |
| Anti-Rabbit Alexafluor 488 secondary antibody | Thermo | A32731 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9418 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C4901 or similar | |
| Cell Culture Incubator | Thermo | Heracell 150 or similar | |
| Centrifuge for microcentrifuge tubes | Eppendorf | 5418 or similar | |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM 710 or equivalent | |
| Coverslips | Thermo | 25CIR-1 or similar | |
| DMEM-F12, Liquid, High Glucose, +HEPES, L-glutamine, +Phenol red | Thermo | 11330107 | |
| EGF (Epidermal Growth Factor) | Sigma Aldrich | 11376454001 | |
| Fluorescently Labeled Laminin | Cytoskeleton Inc | LMN02 | |
| Gentamicin | VWR | VWRV0304-10G | |
| Glutaraldehyde | Sigma Aldrich | G5882 | |
| HCl | Sigma Aldrich | 320331 or similar | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888-5G | |
| Insulin | Sigma Aldrich | 16634-50mg | |
| MepG Dystroglycan Knockout Cells | LBNL | N/A | |
| NaOH | Sigma Aldrich | S8045 or similar | |
| Normocin | Invivogen | ant-nr-1 | |
| Osmium Tetroxide | Sigma Aldrich | 75633 | |
| Ovine Prolactin | Los Angeles Biomedical Research Institute | Ovine Pituitary Prolactin | |
| Phalloidin | Thermo | A22287 | |
| Phosphate Buffered Saline | Thermo | 10010023 or similar | |
| Purified Laminin-111 | Sigma Aldrich | L2020-1MG | |
| Recombinant human Nidogen-1, carrier free | R&D systems | 2570-ND-050 | |
| Sodium Acetate | Sigma Aldrich | S2889 or similar | |
| Sodium Cacodylate | Sigma Aldrich | C0250 | |
| Sterile filters | Millipore | SLGP033RS or similar | |
| Tris | Sigma Aldrich | 252859 or similar | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Ultra-low protein binding tubes | VWR | 76322-516, 76322-522 or similar | |
| Ultrapure water | Thermo | 15230253 or similar |
References
- Carey, S. P., Kraning-Rush, C. M., Williams, R. M., Reinhart-King, C. A. Biophysical control of invasive tumor cell behavior by extracellular matrix microarchitecture. Biomaterials. 33 (16), 4157-4165 (2012).
- Wang, K., et al. Stiffening and unfolding of early deposited-fibronectin increase proangiogenic factor secretion by breast cancer-associated stromal cells. Biomaterials. 54, 63-71 (2015).
- Bruekers, S. M. C., et al. Fibrin-fiber architecture influences cell spreading and differentiation. Cell Adhesion & Migration. 10 (5), 495-504 (2016).
- Yurchenco, P. D. Integrating Activities of Laminins that Drive Basement Membrane Assembly and Function. Curr Top Membr. 76, 1-30 (2015).
- Colognato, H., Winkelmann, D. A., Yurchenco, P. D. Laminin Polymerization Induces a Receptor-Cytoskeleton Network. The Journal of Cell Biology. 145 (3), 619-631 (1999).
- Powell, S. K., Kleinman, H. K. Neuronal laminins and their cellular receptors. International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 29 (3), 401-414 (1997).
- Li, M. L., et al. Influence of a reconstituted basement membrane and its components on casein gene expression and secretion in mouse mammary epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (1), 136-140 (1987).
- Fiore, A., et al. Laminin-111 and the Level of Nuclear Actin Regulate Epithelial Quiescence via Exportin-6. Cell Rep. 19 (10), 2102-2115 (2017).
- Inman, J. L., Robertson, C., Mott, J. D., Bissell, M. J. Mammary gland development: cell fate specification, stem cells and the microenvironment. Development. 142 (6), 1028-1042 (2015).
- Weaver, V. M., et al. Reversion of the malignant phenotype of human breast cells in three-dimensional culture and in vivo by integrin blocking antibodies. Journal of Cell Biology. 137 (1), 231-245 (1997).
- Furuta, S., Ren, G., Mao, J. -H., Bissell, M. J. Laminin signals initiate the reciprocal loop that informs breast-specific gene expression and homeostasis by activating NO, p53 and microRNAs. eLife. 7, 26148 (2018).
- Brown, S. C., et al. Dystrophic phenotype induced in vitro by antibody blockade of muscle alpha-dystroglycan-laminin interaction. Journal of Cell Science. 112 (2), 209 (1999).
- Calof, A. L., Campanero, M. R., O'Rear, J. J., Yurchenco, P. D., Landert, A. D. Domain-specific activation of neuronal migration and neurite outgrowth-promoting activities of laminin. Neuron. 13 (1), 117-130 (1994).
- Li, S., et al. Laminin-sulfatide binding initiates basement membrane assembly and enables receptor signaling in Schwann cells and fibroblasts. The Journal of Cell Biology. 169 (1), 179-189 (2005).
- Sonnenberg, A., et al. Integrin recognition of different cell-binding fragments of laminin (P1, E3, E8) and evidence that alpha 6 beta 1 but not alpha 6 beta 4 functions as a major receptor for fragment E8. The Journal of Cell Biology. 110 (6), 2145-2155 (1990).
- Sorokin, L., Sonnenberg, A., Aumailley, M., Timpl, R., Ekblom, P. Recognition of the laminin E8 cell-binding site by an integrin possessing the alpha 6 subunit is essential for epithelial polarization in developing kidney tubules. The Journal of Cell Biology. 111 (3), 1265-1273 (1990).
- Horejs, C. -M., et al. Biologically-active laminin-111 fragment that modulates the epithelial-to-mesenchymal transition in embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (16), 5908-5913 (2014).
- Hochman-Mendez, C., Cantini, M., Moratal, D., Salmeron-Sanchez, M., Coelho-Sampaio, T. A Fractal Nature for Polymerized Laminin. PLOS ONE. 9 (10), 109388 (2014).
- Kent, A. J., et al. The microstructure of laminin-111 compensates for dystroglycan loss in mammary epithelial cells in downstream expression of milk proteins. Biomaterials. 218, 119337 (2019).
- Weir, M. L., et al. Dystroglycan loss disrupts polarity and beta-casein induction in mammary epithelial cells by perturbing laminin anchoring. Journal of Cell Science. 119, Pt 19 4047-4058 (2006).
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
- Palmero, C. Y., et al. The follicular thyroid cell line PCCL3 responds differently to laminin and to polylaminin, a polymer of laminin assembled in acidic pH. Molecular and Cellular Endocrinology. 376 (1), 12-22 (2013).
- Hochman-Mendez, C., Lacerda de Menezes, J. R., Sholl-Franco, A., Coelho-Sampaio, T.
- Leal-Lopes, C., Grazioli, G., Mares-Guia, T. R., Coelho-Sampaio, T., Sogayar, M. C. Polymerized laminin incorporation into alginate-based microcapsules reduces pericapsular overgrowth and inflammation. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 13 (10), 1912-1922 (2019).
- Paccola Mesquita, F. C., Hochman-Mendez, C., Morrissey, J., Sampaio, L. C., Taylor, D. A. Laminin as a Potent Substrate for Large-Scale Expansion of Human Induced Pluripotent Stem Cells in a Closed Cell Expansion System. Stem Cells International. 2019, 9 (2019).
- Walker, J. M. The Protein Protocols Handbook. Walker, J. M. , Humana Press. 61-67 (2002).
- Freshney, R. I. Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Techniques. 7th edition. , John Wiley and Sons. (2016).
- Mandelbrot, B. The Fractal Geometry of Nature. , WH Freedman and Company. (1982).
- Schittny, J. C., Yurchenco, P. D. Terminal short arm domains of basement membrane laminin are critical for its self-assembly. Journal of Cell Biology. 110 (3), 825-832 (1990).
- Schuger, L., Yurchenco, P., Relan, N. K., Yang, Y. Laminin fragment E4 inhibition studies: basement membrane assembly and embryonic lung epithelial cell polarization requires laminin polymerization. International Journal of Developmental Biology. 42 (2), 217-220 (1998).
- Colognato, H., Yurchenco, P. D. Form and function: the laminin family of heterotrimers. Developmental Dynamics. 218 (2), 213-234 (2000).
- Kabaeva, Z., Meekhof, K. E., Michele, D. E. Sarcolemma instability during mechanical activity in Large myd cardiac myocytes with loss of dystroglycan extracellular matrix receptor function. Human Molecular Genetics. 20 (17), 3346-3355 (2011).
