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Bioengineering

कोशिकाओं को संकेत देने के लिए लैमिनिन -111 का एक भग्न माइक्रोस्ट्रक्चर उत्पन्न करना

Published: September 28, 2020 doi: 10.3791/61134
Automatic Translation
1, 2, 3, 3, 3, 4
1Regenerative Medicine Research, Texas Heart Institute, 2Institute of Biomedical Sciences, Federal University of Rio de Janeiro, 3Biological Systems and Engineering, Lawrence Berkeley National Lab, 4Materials Engineering Division, Lawrence Livermore National Lab

Summary

हम फ्रैक्टल गुणों के साथ Ln1 पॉलिमर उत्पन्न करने के लिए तीन तरीकों का वर्णन करते हैं जो कोशिकाओं को अनपोलीमराइज्ड Ln1 की तुलना में अलग-अलग संकेत देते हैं।

Abstract

लैमिनिन -111 (एलएन 1) उपकला, मांसपेशियों और तंत्रिका प्रणालियों में बाह्य मैट्रिक्स का एक अनिवार्य हिस्सा है। हमने पहले प्रदर्शित किया है कि Ln1 का माइक्रोस्ट्रक्चर कोशिकाओं को संकेत देने के तरीके को बदल देता है, संभवतः क्योंकि नेटवर्क में Ln1 असेंबली विभिन्न चिपकने वाले डोमेन को उजागर करती है। इस प्रोटोकॉल में, हम पोलीमराइज्ड एलएन 1 उत्पन्न करने के लिए तीन तरीकों का वर्णन करते हैं।

Introduction

विकास कारकों या साइटोकिन्स के विपरीत, बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) प्रोटीन संरचनात्मक नेटवर्क में इकट्ठा हो सकते हैं। चूंकि ईसीएम शिथिलता कई रोग स्थितियों का एक प्रमुख तत्व है, इसलिए वे तंत्र जिनके द्वारा कोशिकाएं ईसीएम संरचना, माइक्रोस्ट्रक्चर और बायोमैकेनिक्स से संकेतों को समझती हैं और संचारित करती हैं, चिकित्सीय विकास के लिए आकर्षक लक्ष्य हैं। बढ़ते सबूत बताते हैं कि इन नेटवर्कों का माइक्रोस्ट्रक्चर एक प्रमुख भूमिका निभाता है कि ये प्रोटीन कोशिकाओं को कैसे संकेत देते हैं। आज तक, ईसीएम माइक्रोस्ट्रक्चर और सेल फ़ंक्शन के बीच यह संबंध कोलेजन I1, फाइब्रोनेक्टिन2 और फाइब्रिन3 के लिए दिखाया गया है।

लैमिनिन -111 (एलएन 1) एक ट्रिमेरिक, क्रॉस-आकार का प्रोटीन है जो बाह्य मैट्रिक्स का एक प्रमुख संरचनात्मक घटक है जो उपकला कोशिकाओं4, मांसपेशियों की कोशिकाओं5 और तंत्रिका कोशिकाओं6 से संपर्क करता है। स्तन ग्रंथि में, Ln1 दूध उत्पादक कोशिकाओं 7,8,9 में स्तन ग्रंथि उपकला कोशिकाओं के कार्यात्मक भेदभाव के लिए आवश्यक है, और Ln1 ट्यूमर प्रत्यावर्तन10,11 को शामिल करने के लिए महत्वपूर्ण है. Ln1 और अन्य लैमिनिन मांसपेशियों12,13 में कॉर्टिकल एक्टिन नेटवर्क और सरकोलेममा संगठन के विकास के लिए आवश्यक हैं, और तंत्रिका कोशिका प्रवास और न्यूराइट आउटग्रोथ13 के लिए। इस प्रकार, उन तंत्रों को समझना जिनके द्वारा लैमिनिन कोशिकाओं को संकेत देता है, अनुसंधान का एक सक्रिय क्षेत्र है।

Ln1 integrins, syndecans, dystroglycan, LBP-110 और LamR (चित्रा 1 ए) 4,14 सहित रिसेप्टर्स की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए कई चिपकने वाला डोमेन शामिल हैं. E8 टुकड़ा, जिसमें लैमिनिन α1 के सी-टर्मिनस गोलाकार डोमेन शामिल हैं, डिस्ट्रोग्लाइकन और इंटीग्रिन α6β1 और α3β115 को बांधने के लिए आवश्यक है, और यह उपकला कोशिकाओं15,16के कार्यात्मक भेदभाव के लिए आवश्यक है। इसके विपरीत, छोटे हथियार विभिन्न जैविक गतिविधि17 दिखाते हैं, जिसका अर्थ है कि नेटवर्क गठन के बाद इन विभिन्न एलएन 1 डोमेन की मान्यता के लिए उपलब्धता सेल व्यवहार को बदल सकती है।

हमने हाल ही में प्रदर्शित किया है कि एक बहुलक नेटवर्क में व्यवस्थित एलएन 1 भग्न गुणों को प्रदर्शित करता है (यानी, एक संरचना जो कई लंबाई के तराजू में स्वयं समान है)18। भग्न नेटवर्क Ln1, जो इस व्यवस्था19 का अभाव की तुलना में उपकला कोशिकाओं के लिए अलग तरह से संकेत. इस भग्न नेटवर्क एक विशेष विधानसभा संरचना, जहां लंबे हाथ अधिमानतःकोशिकाओं 18 के संपर्क में है इंगित करता है. इस अलग लंबी बांह प्रदर्शन का एक परिणाम के रूप में, उपकला कोशिकाओं अच्छी तरह से संगठित तंग जंक्शनों और actin तनाव फाइबर19 के दमन के साथ दूध उत्पादन कोशिकाओं में कार्यात्मक भेदभाव से गुजरना.

हम शॉर्ट आर्म-शॉर्ट आर्म बाइंडिंग इंटरैक्शन से एलएन 1 नेटवर्क उत्पन्न करने के लिए 3 तरीकों का वर्णन करते हैं, जो एलएन 1 लंबी बांह का उच्च प्रदर्शन दिखाते हैं: 1) अम्लीय बफर के साथ सेल-फ्री असेंबली द्वारा, 2) ग्लाइकोप्रोटीन के साथ सह-इनक्यूबेशन द्वारा, या 3) सेल सतह डिस्ट्रोग्लाइकन के साथ बातचीत करके। ये तीन विधियां तीन अलग-अलग तंत्रों के माध्यम से समान लैमिनिन माइक्रोस्ट्रक्चर उत्पन्न करती हैं, जिससे प्रयोगात्मक डिजाइन में लचीलापन मिलता है। पिछले काम से पता चलता है कि इन तीन तरीकों जैविक मजबूती का प्रतिनिधित्व कर सकता है: स्तन ग्रंथि उपकला में, या तो सेल सतह dystroglycan, ग्लाइकोप्रोटीन, या कृत्रिम रूप से संरचित laminin कार्यात्मक भेदभाव19 प्रेरित कर सकते हैं. इस प्रकार, शोधकर्ता अध्ययन विषय के आधार पर इन विधियों के बीच चयन कर सकते हैं: डिस्ट्रोग्लाइकन व्यक्त कोशिकाएं एलएन -1 माइक्रोस्ट्रक्चर के प्रति कोई संवेदनशीलता नहीं दिखाती हैं, क्योंकि कोशिका झिल्ली में डिस्ट्रोग्लाइकन एक भग्न नेटवर्क 19,20में सही पोलीमराइजेशन को प्रेरित करता है। मैट्रिगेल, लैमिनिन और ग्लाइकोप्रोटीन21 का मिश्रण, एलएन -1 के सबसे किफायती स्रोत का प्रतिनिधित्व करता है, और20 को अलग करने के लिए डिस्ट्रोग्लाइकन नॉकआउट स्तन कोशिकाओं को प्रेरित करने के लिए आवश्यक माइक्रोस्ट्रक्चर प्रदान करता है, लेकिन इसमें प्रोटीन का एक जटिल मिश्रण होता है जिसमें बहुत परिवर्तनशीलता होती है। पॉलीएलएम सबसे स्वच्छ, सबसे न्यूनीकरण प्रणाली का प्रतिनिधित्व करता है जो इस फ़ंक्शन को प्रदान करता है, लेकिन मैट्रिगेल19 की तुलना में स्तन सेल भेदभाव को प्रेरित करने के लिए बढ़ी हुई लागत और कम प्रभावकारिता पर।

इन तीन विधियों में एक भग्न नेटवर्क संरचना है जो प्रसार सीमित एकत्रीकरण 18,19की विशेषता है, और कई प्रयोगात्मक प्रणालियों 22,23,24,25में एकत्रित लेमिनिन की तुलना में परिवर्तित जैविक गतिविधि दिखाती है। इन विधियों का उपयोग कर भविष्य के अध्ययन रिसेप्टर्स और उपकला भेदभाव के लिए आवश्यक संकेत की पहचान और ट्यूमर जैसे असामान्य microenvironments20 में कोशिकाओं में सामान्य सेल मैट्रिक्स बातचीत को बहाल करने के लिए निर्धारित कर सकता है.

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Protocol

1. पिघलना और विभाज्य laminin-111

नोट: शुद्ध लैमिनिन -111 व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है (आमतौर पर मैट्रिगेल के रूप में बेचे जाने वाले ईएचएस मैट्रिक्स से शुद्ध), लेकिन सभी स्रोत बरकरार, नॉनडिग्रेड प्रोटीन प्रदान नहीं करते हैं।

  1. पुष्टि करें कि Ln1 को Ln1 की सोर्सिंग और रनिंग साइज एक्सक्लूजनक्रोमैटोग्राफी 26 या पॉलीक्रिलामाइड जेल वैद्युतकणसंचलन26 द्वारा अपमानित नहीं किया गया है। विकृत Ln1 में 337 kDa, 197 kDa और 177 kDa पर बैंड होने चाहिए, और देशी Ln1 में 711 kDa पर एक ही बैंड होना चाहिए।
  2. पिघलना Ln1 रात भर एक रेफ्रिजरेटर में बर्फ पर, और कम प्रोटीन बाध्यकारी microcentrifuge ट्यूबों में विभाज्य (आमतौर पर संस्कृति ओवरले के लिए 100 μg/ट्यूब पर विभाज्य, या कोटिंग्स के लिए 10 μg) कम प्रोटीन बाध्यकारी युक्तियाँ और बाँझ तकनीक27 का उपयोग कर. विभाज्य फ्रीज करें और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

2. कम पीएच बफर का उपयोग करके लैमिनिन पोलीमराइजेशन

  1. पॉलीएलएम पोलीमराइजेशन बफर बनाएं: अल्ट्राप्योर पानी में 1 एमएम सीएसीएल2 और 20 एमएम सोडियम एसीटेट का वजन करें और मिलाएं। फिर एचसीएल या एसिटिक एसिड का उपयोग करके पीएच को 4.0 में समायोजित करें। 0.2 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से बाँझ फिल्टर, और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
  2. नियंत्रण पोलीमराइजेशन बफर बनाएं: 1 एमएम कैलसीएल2 और 20 एमएम ट्रिस मिलाएं और आवश्यकतानुसार 10 एन एचसीएल या 12 एन एनएओएच का उपयोग करके पीएच को 7.0 तक समायोजित करें। 0.2 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से बाँझ फिल्टर, और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
    नोट: प्रोटोकॉल यहाँ रोका जा सकता है.
  3. Ln-1 एलिकोट की आवश्यक संख्या को रात भर रेफ्रिजरेटर में पिघलाएं।
  4. बाँझ सेल संस्कृति तकनीक का उपयोग करके, 100 माइक्रोग्राम/एमएल की अंतिम एकाग्रता पर लेमिनिन एलिकोट में उपयुक्त बफर (या तो चरण 2.1 से पॉलीएलएम पोलीमराइजेशन बफर या चरण 2.2 से नियंत्रण पोलीमराइजेशन बफर) जोड़ें और धीरे-धीरे मिलाएं।
  5. यदि विज़ुअलाइज़ेशन के लिए फ्लोरोसेंटली टैग किए गए लैमिनिन का उपयोग कर रहे हैं, तो पुनर्गठन करें और 1:50 wt/wt अनुपात (जैसे 2 μg/100 μg) पर जोड़ें और पाइपिंग द्वारा धीरे से मिलाएं।
    नोट: यदि सेल अटैचमेंट के लिए सब्सट्रेट के रूप में लैमिनिन का उपयोग कर रहे हैं, तो चरण 2.6-2.8 का पालन करें:
  6. इसके तुरंत बाद उपयुक्त बफर में कमजोर पड़ने के बाद, संस्कृति प्लास्टिक या कांच के बने पदार्थ पर लैमिनिन हस्तांतरण और 37 डिग्री सेल्सियस पर एक सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में रात भर सेते हैं। ध्यान दें कि जब कोटिंग coverslips, एक संतुलित ड्रॉप (आम तौर पर, एक 13 मिमी दौर coverslip के लिए 50 माइक्रोन का उपयोग करें) का उत्पादन करने के रूप में के रूप में एक पर्याप्त बड़ी मात्रा जोड़ें, और 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर एक आर्द्र कक्ष में रखना.
  7. बाँझ तकनीक27 का उपयोग करना, 1x फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के साथ धो लें।
  8. तरल को ध्यान से निकालें। सतह को पूरी तरह से सूखने न दें।
    नोट: यदि दूध प्रोटीन प्रेरण के लिए कोशिकाओं को कवर करने के लिए लैमिनिन का उपयोग करते हैं, तो चरण 2.9-2.12 का पालन करें:
  9. संस्कृति स्तन उपकला कोशिकाओं। डीएमईएम-एफ 12 में संस्कृति मेपजी डिस्ट्रोग्लाइकन नॉक इन (डीजीकेआई) या एमईपीजी डिस्ट्रोग्लाइकन नॉकआउट सेल (डीजीकेओ) कोशिकाएं 2% एफबीएस, 0.01 मिलीग्राम / एमएल इंसुलिन, 0.005 माइक्रोग्राम / एमएल ईजीएफ, 0.05 मिलीग्राम / एमएल जेंटामाइसिन, और 0.05 ग्राम / एमएल नॉर्मोसिन के साथ पूरक हैं।
  10. अच्छी तरह से प्लेटों या कवरस्लिप नीचे व्यंजन में 10,500 कोशिकाओं/सेमी2 पर लेमिनिन उत्तेजना के लिए बीज डीजीकेओ और डीजीकेआई कोशिकाएं
  11. 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में पतला लैमिनिन सेते हैं।
  12. अपकेंद्रित्र पॉलीएलएम 20 मिनट के लिए 2,000 x ग्राम पर एलिकोट करता है, लेकिन प्रोटीन संस्थाओं के छोटे आकार के कारण 20 मिनट के लिए 20,000 x ग्राम पर तटस्थ पीएच में अपकेंद्रित्र एलएम और प्रभावी ढंग से इकट्ठा करने के लिए उच्च गति की आवश्यकता होती है।
  13. बाँझ तकनीक27 का उपयोग करना, सतह पर तैरनेवाला धीरे हटा दें, और डीएमईएम-एफ 12 के प्रेरण माध्यम की एक उचित मात्रा में 3 माइक्रोग्राम / एमएल प्रोलैक्टिन, 2.8 माइक्रोन हाइड्रोकार्टिसोन, और 5 माइक्रोग्राम / एमएल इंसुलिन के साथ पूरक पुन: निलंबित करें
  14. कोशिकाओं को उत्तेजित करने के लिए तुरंत सेल संस्कृति माध्यम में लेमिनिन स्थानांतरण। हमने 50-800 μg/mL Ln1 के साथ कोशिकाओं को सफलतापूर्वक उत्तेजित किया है

3. पृथक ग्लाइकोप्रोटीन का उपयोग करके लैमिनिन पोलीमराइजेशन

  1. पिघलना पुनः संयोजक nidogen-1 और Ln1 धीरे रात भर रेफ्रिजरेटर में बर्फ पर.
  2. कम प्रोटीन बाध्यकारी युक्तियों और ट्यूबों का उपयोग करके और बाँझ तकनीक का उपयोग करके सेल संस्कृति माध्यम में 1: 1 डब्ल्यूटी/डब्ल्यूटी अनुपात में निडोजेन -1 के साथ एलएन 1 मिलाएं। नियंत्रण के रूप में सेल कल्चर माध्यम में शुद्ध Ln1 का उपयोग करें।
  3. यदि विज़ुअलाइज़ेशन के लिए फ्लोरोसेंटली टैग किए गए लैमिनिन का उपयोग कर रहे हैं, तो पुनर्गठन करें और 1:50 wt/wt अनुपात (जैसे, 2 μg/100 μg) पर जोड़ें। धीरे से पाइपिंग द्वारा मिलाएं।
  4. एलएन1-निडोजेन इनक्यूबेट करें या 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेल कल्चर इनक्यूबेटर में एलएन 1 को नियंत्रित करें।
  5. 30 मिनट के लिए 2,000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र Ln1-nidogen copolymers और 30 मिनट के लिए 20,000 x ग्राम पर नियंत्रण Ln1।
  6. धीरे सतह पर तैरनेवाला निकालें और सेल संस्कृति माध्यम में 100-800 माइक्रोग्राम कुल प्रोटीन/एमएल की अंतिम एकाग्रता के लिए फिर से निलंबित करें।
  7. कोशिकाओं को उत्तेजित करने के लिए तुरंत उपयोग करें, या कवरस्लिप में स्थानांतरित करें और आर्द्र सेल संस्कृति इनक्यूबेटरों में 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर पालन करने की अनुमति दें।
  8. कवरस्लिप से संस्कृति माध्यम निकालें, 1x पीबीएस के साथ कवरस्लिप धोएं, और फिर कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए 10% फॉर्मेलिन (यानी, पीबीएस में 4% फॉर्मलाडेहाइड) के साथ ठीक करें।

4. डिस्ट्रोग्लाइकन व्यक्त कोशिकाओं का उपयोग करके लैमिनिन पोलीमराइजेशन

  1. संस्कृति स्तन उपकला कोशिकाओं। डीएमईएम-एफ 12 में संस्कृति मेपजी डिस्ट्रोग्लाइकन नॉक इन (डीजीकेआई) या एमईपीजी डिस्ट्रोग्लाइकन नॉकआउट सेल (डीजीकेओ) कोशिकाएं 2% एफबीएस, 0.01 मिलीग्राम / एमएल इंसुलिन, 0.005 माइक्रोग्राम / एमएल ईजीएफ, 0.05 मिलीग्राम / एमएल जेंटामाइसिन, और 0.05 ग्राम / एमएल नॉर्मोसिन के साथ पूरक हैं।
  2. विकास दर में अंतर के कारण बीज डीजीकेआई कोशिकाएं 5,000 कोशिकाओं/सेमी2 पर, और बीज डीजीकेओ कोशिकाओं को 8,000 कोशिकाओं/सेमी2 पर। मीडिया के साथ आर्द्र इनक्यूबेटरों में 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति हर 2-3 दिनों में बदलती है और कठोर बाँझ तकनीक का उपयोग करके हर 4-5 दिनों में मार्ग बदलती है। उचित विकास दर सुनिश्चित करने के लिए एक हेमोसाइटोमीटर या स्वचालित सेल काउंटर27 के साथ सावधानी से कोशिकाओं की गणना करें।
  3. लेमिनिन उत्तेजना के लिए बीज कोशिकाएं 10,500 कोशिकाओं/सेमी2 अच्छी तरह से प्लेटों में या 2 दिनों के लिए कवरस्लिप नीचे व्यंजन और संस्कृति, नकारात्मक नियंत्रण के रूप में भग्न एलएन 1 और डीजीकेओ कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए डीजीकेआई कोशिकाओं का उपयोग करते हैं। पिघलना Ln-1 धीरे रात भर एक रेफ्रिजरेटर में बर्फ पर, और फिर DMEM-F12 के प्रेरण माध्यम के साथ 3 μg/mL प्रोलैक्टिन, 2.8 माइक्रोन हाइड्रोकार्टिसोन, और 5 μg/mL इंसुलिन के साथ मिलाएं। 35 मिमी डिश के लिए, Ln1 के 50-800 μg के साथ इंडक्शन मीडिया के 1 एमएल का उपयोग करें।
  4. यदि फ्लोरोसेंट Ln1 का उपयोग कर रहे हैं, तो 50:1 wt/wt अनुपात में मिलाएं।
  5. कोशिकाओं से मीडिया निकालें, और 3 माइक्रोग्राम / एमएल प्रोलैक्टिन, 2.8 माइक्रोन हाइड्रोकार्टिसोन, और 5 माइक्रोग्राम / एमएल इंसुलिन के साथ पूरक डीएमईएम-एफ 12 के लेमिनिन और प्रेरण मीडिया के साथ कवर करें
  6. 2 दिनों के लिए संस्कृति कक्षों, और फिर 10% फॉर्मेलिन के साथ तय.

5. ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी के माध्यम से लेमिनिन माइक्रोस्ट्रक्चर की विशेषता

  1. निश्चित नमूने लीजिए और 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 1x पीबीएस के साथ 3 बार धो लें।
  2. एक आर्द्र कक्ष में कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए 0.5% ट्राइटन एक्स-100, 3% गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन, 10% बकरी सीरम, और 40 माइक्रोग्राम/एमएल एंटी-माउस अवरुद्ध एंटीबॉडी टुकड़े के साथ 1x पीबीएस में नमूनों को ब्लॉक और पारगम्य करें।
    नोट: ट्राइटन X-100 खतरनाक है। दस्ताने और आंखों की सुरक्षा के साथ संभालें और उचित रूप से निपटान करें।
  3. 0.5% ट्राइटन एक्स -100 और 3% बीएसए के साथ 1x पीबीएस के साथ 1:100 के कमजोर पड़ने पर एंटी-लेमिनिन एंटीबॉडी मिलाएं और कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए नमूने में जोड़ें या रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर एक आर्द्र कक्ष में (आमतौर पर नीचे गीले प्रयोगशाला पोंछने के साथ टिप बक्से का उपयोग करें)।
  4. प्राथमिक एंटीबॉडी निकालें और 0.5% ट्राइटन एक्स-100 और 3% बीएसए के साथ 1x पीबीएस के साथ 3 बार धो लें।
  5. 0.5% ट्राइटन एक्स-100 और 3% बीएसए के साथ 1x पीबीएस में नमूनों के लिए 1:500 के कमजोर पड़ने पर एक उपयुक्त माध्यमिक एंटीबॉडी जोड़ें और एक आर्द्र कक्ष में अंधेरे में कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
  6. माध्यमिक एंटीबॉडी निकालें और 0.5% ट्राइटन एक्स -100 और 3% बीएसए के साथ 1x पीबीएस के साथ 3 बार धो लें।
  7. कोशिकाओं युक्त नमूनों के लिए, 45 मिनट के लिए 6 माइक्रोन फैलोलाइडिन जोड़ें, इसके बाद पीबीएस के साथ 3 वॉश 0.5% ट्राइटन एक्स -100 और 3% बीएसए के साथ, और पीबीएस के साथ 3 वॉश के बाद। फिर 5 मिनट के लिए पीबीएस में 0.1 माइक्रोग्राम/एमएल डीएपीआई के साथ दाग दें।
  8. यदि उपयुक्त हो तो नमूने माउंट करें।
  9. उच्च रिज़ॉल्यूशन कन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके छवि ln-1 संरचना। विसर्जन उद्देश्यों (जल विसर्जन योजना Apochromat 40X/1.1NA या तेल विसर्जन योजना Apochromat 63X/1.4NA) से लैस लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप का उपयोग करें।

6. बॉक्स गिनती आयाम के माध्यम से लेमिनिन निर्माणों की विशेषता

  1. मैटलैब टूलबॉक्स या इमेजजे में उपलब्ध बॉक्स गिनती आयाम एल्गोरिदम का उपयोग करके भग्न गुणों के लिए विश्लेषण करें। ये विधियां लैमिनिन की छवियों को थ्रेशोल्ड करती हैं और लॉग-लॉग प्लॉट पर बक्से के आकार की तुलना में एलएन 1 युक्त बक्से की संख्या को प्लॉट करती हैं। इन मापदंडों के बीच संबंधों का ढलान बॉक्स-गिनती आयाम है: गैर-भग्न ज्यामिति में 0, 1, या 2 का आयाम होगा, जबकि भग्न ज्यामिति में गैर-पूर्णांक आयाम28 है।
    नोट: एसिड-उपचारित, ग्लाइकोप्रोटीन-उपचारित और डीजीकेआई सेल-संलग्न एलएन 1 सभी में ~ 1.7 का बॉक्स-गिनती भग्न आयाम है, जबकि नियंत्रण एलएन 1 में 2.0 का भग्न आयाम है।

7. इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के माध्यम से लेमिनिन निर्माणों की विशेषता

  1. सेल संस्कृति मीडिया में लेमिनिन को फिर से निलंबित करें और आर्द्र 37 डिग्री सेल्सियस वातावरण में 90 मिनट के लिए सिलिका वेफर्स को सोखने की अनुमति दें।
  2. पीएच 7.2 पर 0.1 एम सोडियम कैकोडाइलेट बफर में 2.5% ग्लूटार्डाल्डिहाइड में मैट्रिसेस को ठीक करें।
    नोट: ग्लूटार्डाल्डिहाइड खतरनाक है और इसे दस्ताने और आंखों की सुरक्षा के साथ धूआं हुड में संभाला जाना चाहिए और खतरनाक कचरे के रूप में निपटाया जाना चाहिए।
  3. पीएच 7.2 पर 0.1 एम सोडियम कैकोडाइलेट बफर में 1% ऑस्मियम टेट्रोक्साइड में पोस्टफिक्स मैट्रिसेस।
    नोट: ऑस्मियम टेट्रोक्साइड खतरनाक है और दस्ताने और आंखों की सुरक्षा के साथ एक धूआं हुड में संभाला जाना चाहिए और उचित रूप से निपटाया जाना चाहिए। कैकोडाइलेट खतरनाक है और दस्ताने और आंखों की सुरक्षा के साथ एक धूआं हुड में संभाला जाना चाहिए और उचित रूप से निपटाया जाना चाहिए।
  4. पीएच 7.2 पर सोडियम कैकोडाइलेट बफर में 3 बार धोएं।
  5. इथेनॉल की बढ़ती सांद्रता के साथ निर्जलीकरण।
  6. सोने की एक पतली परत के साथ स्पटर कोट मैट्रिसेस।
  7. स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके छवि।

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Representative Results

लैमिनिन-111 एक ट्राइमेरिक प्रोटीन है जिसमें इसकी छोटी भुजाओं के अंत में तीन स्व-कोडांतरण डोमेन होते हैं (चित्र 1 ए)। जब उपयुक्त रूप से इलाज किया जाता है, तो छोटी बाहें एक हेक्सागोनल जाली(चित्रा1बी,1सी)में पोलीमराइज़ कर सकती हैं, जो बड़े स्थानिक तराजू (चित्रा 2)पर प्रसार-सीमित कुल भग्न गुणों को प्रदर्शित करती है। कैल्शियम युक्त तटस्थ-पीएच बफ़र्स में इनक्यूबेट किए गए लैमिनिन एक एंटी-एलएन 1 एंटीबॉडी(चित्रा 2ए)के साथ कल्पना किए गए छोटे समुच्चय बनाते हैं, जिसमें ~ 2 के फ्रैक्टल आयाम की गिनती करने वाला बॉक्स होता है, जो कोई भग्न नहीं दर्शाता है। इसके विपरीत, Ln1 कैल्शियम युक्त पीएच4 बफर(चित्रा 2बी)में इनक्यूबेटेड,या निडोजेन-1(चित्रा 2सी)के साथ तटस्थ बफर में ~1.7(चित्रा 3)के भग्न आयाम के साथ लैसी नेटवर्क भरने वाले अंतरिक्ष बनाते हैं। डायस्ट्रोग्लाइकन व्यक्त कोशिकाओं के साथ सुसंस्कृत एलएन 1 समान लैसी नेटवर्क बनाता है (चित्रा 2 डी, इनसेट सेल नाभिक दिखाता है)।

जब pH7Ln और polyLM को बढ़ते रिज़ॉल्यूशन के साथ SEM के साथ चित्रित किया जाता है, तो माइक्रोस्ट्रक्चर में अंतर अधिक स्पष्ट हो जाता है। कम संकल्प (चित्रा 2ई और वी) पर, पॉलीएलएम नेटवर्क पीएच7-एलएन की तुलना में अधिक फैले हुए दिखाई देते हैं, और उच्च रिज़ॉल्यूशन पर, पीएच7-एलएन समुच्चय स्पष्ट होते हैं (चित्र 2ई iv) जबकि एक प्रसार हेक्सागोनल जाली पॉलीएलएम में उच्च संकल्प(चित्रा 2ई viii)पर देखी जा सकती है।

Figure 1
चित्रा 1: एलएन 1 और पोलीमराइजेशन विधि की पृष्ठभूमि: ए: एलएन 1 कई चिपकने वाले डोमेन (रिसेप्टर बाइंडिंग साइटों का उल्लेख किया गया) के साथ एक जटिल ट्राइमेरिक प्रोटीन है, जो विभिन्न प्रकार के इंटीग्रिन और गैर-इंटीग्रिन रिसेप्टर्स (काले रंग में) को बांध सकता है और शॉर्ट आर्म-शॉर्ट आर्म बाइंडिंग (टैन में) द्वारा पॉलिमरिक नेटवर्क बना सकता है। बी: एलएन 1 कैल्शियम आयनों की उपस्थिति में एक हेक्सागोनल जाली बना सकता है और या तो कम पीएच, ग्लाइकोप्रोटीन जैसे निडोजेन -1 या सेल सतह डिस्ट्रोग्लाइकन। सी: उदाहरण बहुलक Ln1 की SEM छवि हेक्सागोनल जाली और प्रस्तावित Ln1 विधानसभा मॉडल दिखा रही है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: एलएन 1 पोलीमराइजेशन के लिए प्रतिनिधि डेटा। ए: Ln1 कैल्शियम के साथ तटस्थ बफ़र्स में समुच्चय। जब एक विरोधी Ln1 एंटीबॉडी के साथ कल्पना की, छोटे समुच्चय देखा जा सकता है. बी: बफर युक्त अम्लीय कैल्शियम में एलएन 1 पॉलीएलएम में पोलीमराइज़ करता है, जो भग्न गुणों को दर्शाता है। C: Ln1- निडोजेन-1 मिश्रण (1:1 wt/wt) समान पॉलिमर बनाता है। डी: तटस्थ बफर सेल संस्कृति मीडिया में Ln1 डिस्ट्रोग्लाइकन व्यक्त कोशिकाओं पर मढ़ा एक समान lacy नेटवर्क से पता चलता है. इनसेट: सेल आकृति विज्ञान दिखा रहा परमाणु काउंटरस्टेनिंग। ई: बढ़ते संकल्प के साथ पीएच 7-एलएन और पॉलीएलएम नेटवर्क (स्पिन डाउन विधि) के इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी को स्कैन करना। पीएच 7-एलएन में, कम रिज़ॉल्यूशन स्कैन (i & ii) अपेक्षाकृत कॉम्पैक्ट फाइबर दिखाते हैं, जो उच्च रिज़ॉल्यूशन स्कैन (iii) में समुच्चय के रूप में हल करते हैं। एक ही एकाग्रता पर polyLM बहुत अधिक फैल गया है (iv&v), और उच्च-रिज़ॉल्यूशन स्कैन एक हेक्सागोनल, अंतरिक्ष भरने वाली जाली (vii) दिखाते हैं। एफ: यह माइक्रोस्ट्रक्चरल परिवर्तन डीजीकेओ स्तन ग्रंथि उपकला कोशिकाओं को कार्यात्मक रूप से दूध उत्पादक कोशिकाओं19 में अंतर करने का कारण बनता है। मैं: पीएच 7-एलएन उत्तेजित कोशिकाओं में प्रचुर मात्रा में एक्टिन तनाव फाइबर (लाल) और अव्यवस्थित ज़ो -1 दिखाते हैं जिसमें तंग जंक्शन (हरा) होता है, जबकि द्वितीय: पॉलीएलएम उत्तेजित कोशिकाओं में कम कुल फिलामेंटस एक्टिन, सेल-सेल सीमा में एक्टिन का पार्श्व स्थानीयकरण और अच्छी तरह से संगठित ज़ो -1 तंग जंक्शनों से युक्त। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: बॉक्स गिनती विधि के साथ भग्न आयाम अनुमान। ए एंड बी: पीएच 7-एलएन और पॉलीएलएम की कच्ची छवि आकृति विज्ञान में अंतर दिखाती है। सी एंड डी: इन छवियों को एक काले और सफेद छवि को जन्म देने के लिए थ्रेसहोल्ड किया जाता है, ई एंड एफ: फिर बॉक्स के आकार के लिए छवि वाले बक्से की संख्या के अनुपात का लॉग गणना की जाती है। औसत ढलान बॉक्स गिनती आयाम का प्रतिनिधित्व करता है एफडी की गणना की जाती है। pH7-Ln सँग 2.0 को विशेषता आयाम छ, कुनै भग्न गुणहरू संकेत गर्दैन, जबकि polyLM मा ~1.7 को आयाम छ, प्रसार सीमित एकत्रीकरण प्रक्रियाको संकेत। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

लैमिनिन उपकला, मांसपेशियों और तंत्रिका अंग प्रणालियों में ईसीएम के एक प्रमुख तत्व का प्रतिनिधित्व करते हैं, और कोशिकाओं के कार्यात्मक भेदभाव को विनियमित करने में आवश्यक भूमिका निभाने के लिए इन विट्रो में दिखाए गए हैं। बढ़ते सबूत इंगित करता है कि कोशिकाओं को प्रदर्शित लेमिनिन की संरचना अपने सिग्नलिंग और परिणामी सेल फेनोटाइप 15,16को नियंत्रित करती है, इस प्रकार Ln1 माइक्रोस्ट्रक्चर को नियंत्रित करने के तरीकों को इन क्षेत्रों में काम कर रहे बुनियादी जीवविज्ञानी के लिए ब्याज की होनी चाहिए, और ऊतक इंजीनियरों के लिए इन विट्रो में सामान्य व्यवहार को पुनरावृत्ति करने की मांग करनी चाहिए। अधिक आम तौर पर, विभिन्न प्रकार के बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन के माइक्रोस्ट्रक्चर को जैविक प्रतिक्रिया को विनियमित करने और उन तंत्रों को समझने के लिए जाना जाता है जिनके द्वारा माइक्रोस्ट्रक्चर सेल फ़ंक्शन को नियंत्रित करता है जो अनुसंधान का एक सक्रिय क्षेत्र है।

इस काम में, हम प्रसार सीमित एकत्रीकरण की विशेषता वाले भग्न माइक्रोस्ट्रक्चर के साथ नेटवर्क में लैमिनिन को पोलीमराइज़ करने के तीन तरीकों का वर्णन करते हैं। इन एलएन 1 पॉलिमर को एकत्रित एलएन 1 की तुलना में कोशिकाओं को अलग-अलग संकेत देने के लिए दिखाया गया है, संभवतः कोशिकाओं को चिपकने वाला डोमेन डिस्प्ले बदलने के कारण। Ln1 माइक्रोस्ट्रक्चर को नियंत्रित करने के लिए ये तीन विधियाँ Ln1 की असेंबली में जैविक अतिरेक का प्रतिनिधित्व कर सकती हैं, लेकिन यह प्रयोगात्मक कार्य के लिए एक चुनौती का प्रतिनिधित्व करती है। अम्लीय बफर उपचार का उपयोग कर Ln1 microstructure को नियंत्रित केवल प्रभाव दिखाएगा जब dystroglycan नॉकआउट कोशिकाओं19,20 में जोड़ा. इस प्रकार, प्रयोगात्मक डिजाइन कोशिकाओं और Ln1 की शुद्धता का उपयोग किया जा करने पर विचार करना चाहिए. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध Ln1 आमतौर पर ईएचएस मैट्रिक्स से प्राप्त होता है, जिसमें निडोगेंस और अन्य ग्लाइकोप्रोटीन का उच्च प्रतिशत होता है; ईएचएस मैट्रिक्स में एलएन 1 तटस्थ बफर सिस्टम में भग्न नेटवर्क में सही ढंग से पोलीमराइज़ करता है। पुनः संयोजक Ln1 हाल ही में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हो गया है लेकिन असाधारण रूप से महंगा है।

इस काम के लिए Ln1 प्रोटीन की गुणवत्ता महत्वपूर्ण है क्योंकि छोटे हाथ के टुकड़े पोलीमराइजेशन को अवरुद्ध कर सकते हैं। लघु हाथ के टुकड़े (यानी, E4 टुकड़ा) नेटवर्क गठन में हस्तक्षेप करते हैं क्योंकि प्रत्येक टुकड़ा नेटवर्क29 में एक शून्य को प्रेरित करता है। पिछले डेटा से पता चलता है कि E4 टुकड़े को शामिल करने Ln1 प्रेरित फेनोटाइप 29,30ब्लॉक कर सकते हैं. इसी तरह, हमने पाया है कि नेटवर्क गठन लैमिनिन -332 (अप्रकाशित डेटा) की छोटी मात्रा से बाधित है, जो ई 4 टुकड़ों की तरह एक एकल चिपकने वाला डोमेन29,30 होता है। इस प्रकार, यह जांचना महत्वपूर्ण है कि Ln1 बरकरार है, और काम शुरू करने से पहले अन्य लेमिनिन प्रजातियों को हटाने के लिए अत्यधिक शुद्ध है।

हालांकि ये विधियां सेल-मैट्रिक्स इंटरैक्शन का अध्ययन करने वाले शोधकर्ताओं के लिए प्रासंगिक हैं, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि लैमिनिन परिवार अत्यधिक जटिल है, जिसमें 15 ज्ञात सदस्य और अतिरिक्त ब्याह वेरिएंट31 शामिल हैं, और यह परिवार रिसेप्टर्स, ग्लाइकोप्रोटीन, कोलेजन और संभावित विकास कारकों की एक विस्तृत श्रृंखला के साथ बातचीत करता है4. इस प्रकार, बहुलक एलएन 1 एक न्यूनीकरणवादी स्थिति का प्रतिनिधित्व करता है जिसे सेल फ़ंक्शन द्वारा तेजी से संशोधित होने की उम्मीद की जा सकती है। इसके अलावा, विभिन्न अंग प्रणालियों को अलग-अलग लैमिनिन को समझना, प्रतिक्रिया देना और फिर से तैयार करना: हमने दिखाया है कि डिस्ट्रोग्लाइकन के माध्यम से लैक्टिन को लेमिनिन का जुड़ाव स्तन ग्रंथि19 के लिए अपरिहार्य है, जबकि मायोसाइट फ़ंक्शन32 के लिए डिस्ट्रोग्लाइकन बिल्कुल आवश्यक है।

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Disclosures

यह काम अनुबंध DE-AC52-07NA27344 के तहत लॉरेंस लिवरमोर नेशनल लेबोरेटरी द्वारा अमेरिकी ऊर्जा विभाग के तत्वावधान में किया गया था। आईएम रिलीज एलएलएनएल-जेआरएनएल-799443।

Acknowledgments

इस काम को लॉरेंस लिवरमोर नेशनल लैब एलडीआरडी 18-ईआरडी -062 (सीआर को) द्वारा वित्त पोषित किया गया था। DgKO और DgKI कोशिकाओं के अपने तरह के उपहार के लिए जॉन मस्कलर के लिए धन्यवाद। इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी नमूना तैयार करने और डेटा संग्रह में सलाह और सहायता के लिए कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय बर्कले इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप प्रयोगशाला के कर्मचारियों को धन्यवाद।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% formalin Sigma Aldrich HT501128
Anti-Laminin primary antibody Sigma Aldrich L9393
Anti-Rabbit Alexafluor 488 secondary antibody Thermo A32731
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A9418
CaCl2 Sigma Aldrich C4901 or similar
Cell Culture Incubator Thermo Heracell 150 or similar
Centrifuge for microcentrifuge tubes Eppendorf 5418 or similar
Confocal Microscope Zeiss LSM 710 or equivalent
Coverslips Thermo 25CIR-1 or similar
DMEM-F12, Liquid, High Glucose, +HEPES, L-glutamine, +Phenol red Thermo 11330107
EGF (Epidermal Growth Factor) Sigma Aldrich 11376454001
Fluorescently Labeled Laminin Cytoskeleton Inc LMN02
Gentamicin VWR VWRV0304-10G
Glutaraldehyde Sigma Aldrich G5882
HCl Sigma Aldrich 320331 or similar
Hydrocortisone Sigma-Aldrich H0888-5G
Insulin Sigma Aldrich 16634-50mg
MepG Dystroglycan Knockout Cells LBNL N/A
NaOH Sigma Aldrich S8045 or similar
Normocin Invivogen ant-nr-1
Osmium Tetroxide Sigma Aldrich 75633
Ovine Prolactin Los Angeles Biomedical Research Institute Ovine Pituitary Prolactin
Phalloidin Thermo A22287
Phosphate Buffered Saline Thermo 10010023 or similar
Purified Laminin-111 Sigma Aldrich L2020-1MG
Recombinant human Nidogen-1, carrier free R&D systems 2570-ND-050
Sodium Acetate Sigma Aldrich S2889 or similar
Sodium Cacodylate Sigma Aldrich C0250
Sterile filters Millipore SLGP033RS or similar
Tris Sigma Aldrich 252859 or similar
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100
Ultra-low protein binding tubes VWR 76322-516, 76322-522 or similar
Ultrapure water Thermo 15230253 or similar

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References

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फ्रैक्टल माइक्रोस्ट्रक्चर लैमिनिन -111 एक्स्ट्रासेल्युलर मैट्रिक्स एपिथेलिया मसल न्यूरल सिस्टम Ln1 असेंबली चिपकने वाला डोमेन पॉलिमराइज्ड Ln1
कोशिकाओं को संकेत देने के लिए लैमिनिन -111 का एक भग्न माइक्रोस्ट्रक्चर उत्पन्न करना
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