Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

تقييم المشاركة المستهدفة الخلوية من قبل SHP2 (PTPN11) مثبطات Phosphatase

Published: July 17, 2020 doi: 10.3791/61457
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Cancer Metabolism & Signaling Networks Program, NCI-Designated Cancer Center, Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute

Summary

إن القدرة على تقييم المشاركة المستهدفة من قبل مثبطات المرشح في الخلايا السليمة أمر بالغ الأهمية لاكتشاف المخدرات. يصف هذا البروتوكول 384 شكل جيد فحص التحول الحراري الخلوي الذي يكشف بشكل موثوق الاشتباك الهدف الخلوي من مثبطات تستهدف إما البرية من نوع SHP2 أو المتغيرات oncogenic لها.

Abstract

وSrc-homology 2 (SH2) المجال التي تحتوي على phosphatase 2 (SHP2), المشفرة من قبل PTPN11 بروتو-oncogene, هو وسيط رئيسي لمستقبلات التيروزين كيناز (RTK) يحركها خلية الإشارات, تعزيز بقاء الخلايا والانتشار. وبالإضافة إلى ذلك، يتم تجنيد SHP2 من قبل مستقبلات نقطة الاختيار المناعية لمنع تنشيط الخلية B و T. وقد تورطت وظيفة SHP2 الشاذ في التنمية, التقدم, و الانبثاث من العديد من أنواع السرطان. في الواقع ، دخلت مثبطات SHP2 جزيء صغير مؤخرا التجارب السريرية لعلاج الأورام الصلبة مع تنشيط مسار راس / راف / ERK ، بما في ذلك الأورام مع بعض الطفرات رأس oncogenic. ومع ذلك، فإن الفئة الحالية من مثبطات SHP2 ليست فعالة ضد المتغيرات على اللوكوجينية SHP2 التي تحدث بشكل متكرر في اللوكيميا، وتطوير جزيئات صغيرة محددة تستهدف SHP2 oncogenic هو موضوع البحوث الحالية. وهناك مشكلة شائعة مع معظم حملات اكتشاف المخدرات التي تنطوي على البروتينات الخلوية مثل SHP2 هو أن المقايسات الأولية التي تدفع اكتشاف الكيميائية وغالبا ما تكون في المختبرات التي لا الإبلاغ عن الاشتباك الهدف الخلوي من المركبات المرشحة. لتوفير منصة لقياس الاشتباك الهدف الخلوية، قمنا بتطوير كل من نوع البرية ومتحول SHP2 المقايسات التحول الحراري الخلوي. هذه المقايسات تكشف بشكل موثوق الاشتباك الهدف من مثبطات SHP2 في الخلايا. هنا، ونحن نقدم بروتوكول شامل من هذا الفحص، الذي يوفر أداة قيمة لتقييم وتوصيف مثبطات SHP2.

Introduction

التيروزين الفسفر يلعب دورا هاما في نقل إشارة في الخلايا1،2. هذا التعديل ما بعد الترجمة هو تحفيزه من قبل كينازات التيروزين البروتين (PTKs) وعكسها من قبل فوسفاتاتات التيروزين البروتين (PTPs). لذلك ، فإن وظيفة PTK أو PTP الشاذة تؤدي إلى العديد من الأمراض البشرية الموروثة أو المكتسبة3و4و5و6. وSrc-homology 2 (SH2) المجال التي تحتوي على phosphatase 2 (SHP2) هو نوع غير مستقبلات أعرب عنها على نطاق واسع PTP PTP من قبل بروتو أونكوجين PTPN117 وهو المنظم الرئيسي للعديد من العمليات الفسيولوجية التي تنطوي على نقل إشارة عن طريق تفعيل راس / راف / ERK ، PI3K / AKT ، أو JAK / STAT إشارات المسارات8. عادة، يتم تنظيم نشاط SHP2 بإحكام من أجل منع الإشارات المنحرفة. تحت الظروف القاعدية SHP2 هو autoinhied من قبل المجال N- المحطة الطرفية SH2، الذي يمنع الوصول إلى الموقع النشط ضمن المجال الفوسفاتيز الحفاز (الشكل 1A)9،10. عند تنشيط الخلية، تقوم بروتينات الربط الفوسفورية التيروزين بتجنيد SHP2، مما يؤدي إلى اعتماد تركيبها النشط، حيث يمكن الوصول إلى الموقع النشط الآن إلى ركائزه. في العديد من أنواع السرطان SHP2 النشاط مرتفع. وقد تم تحديد الطفرات الجسدية كسب من وظيفة (GOF) في PTPN11 أساسا في اللوكيميا ومنع ربط المجال N-SH2 إلى المجال فوسفاتاتيز، مما أدى إلى SHP2 نشط بشكل تأسيسي (الشكل 1B)11. الطفرات GERMLINE GOF في PTPN11 هي المسؤولة عن ~ 50٪ من حالات متلازمة نونان, اضطراب النمو مع زيادة خطر الإصابة بالخطورة12. في الأورام الصلبة، حيث الطفرات PTPN11 نادرة، مستويات أكبر من البروتينات ملزمة الفوسفورية تؤدي إلى تعزيز نشاط SHP2(الشكل 1C). SHP2 مهم أيضا للإشارة نقطة تفتيش المناعة، كما مستقبلات نقطة تفتيش مثل BTLA أو PD-1 تجنيد SHP2 لجزيئات الإشارات الرئيسية ديفوسفوريلا، ومنع تنشيط الخلايا المناعية13،14،15.

وقد كان استهداف PTPs مع جزيئات صغيرة تحديا، وذلك لأن الموقع النشط من PTPs هو الحفاظ على درجة عالية من مشحونة؛ مثبطات التي تستهدف الموقع النشط غالبا ما تكون قوية، ولكن تظهر الانتقائية الفقراء والتوافر البيولوجي عن طريق الفم16،17،18،19،20،21،22. في الواقع، العديد من المثبطات SHP2 ذكرت تعاني من ضعف الانتقائية وعدم الفعالية في الخلايا23. في الآونة الأخيرة، تم الإبلاغ عن مثبطات اللويسترية من SHP2 مع قوة جيدة وانتقائية ممتازة (على سبيل المثال، SHP09924 و RMC-455025) وأثارت اهتماما متجددا في مثبطات SHP2. المركبات على أساس SHP099 و RMC-4550 حاليا في المرحلة الأولى التجارب السريرية لعلاج الأورام الصلبة مع مستقبلات كيناز التيروزين (RTK) تفعيل المسار26,27. في حين وضع حجر الأساس، هذه المركبات غير فعالة ضد العديد من المسوخ SHP2 oncogenic التي تدفع تولد الكرية في عدد كبير من مرضى سرطان الدم28،29،30. هذا النقص في قوة المركبات الشبيهة بـ SHP099 نحو المتغيرات SHP2 oncogenic ينبع من آلية التليسية الفريدة ، لأنها تمنع نشاط SHP2 عن طريق الربط وتثبيت التشكل غير النشط والمغلق ، والذي يتم تعطيله في المسوخ SHP2. علاوة على ذلك, استنادا إلى تقرير31مؤخرا , آليات المقاومة التكيفية في المرضى الذين عولجوا مع مثبطات مثل SHP099 يمكن تصورها تماما. وبالتالي، فإن تطوير الجيل القادم من مثبطات SHP2 التي تستهدف حالته النشطة والمفتوحة هو موضوع بحث مكثف.

توصيف مثبطات SHP2 رواية في الخلايا هو جانب أساسي من عملية تحسين الرصاص. بشكل حاسم، ثبت المشاركة المستهدفة من المانع في ظل الظروف الفسيولوجية يوفر مستوى إضافي من الثقة التي يتم نشرها بكفاءة الموارد للكيمياء الطبية على المركبات مع الكفاءة الخلوية الواعدة. في الماضي، تم تطوير عدة طرق لتقييم ربط مثبطات الجزيئات الصغيرة لأهدافها، في المقام الأول بالنسبة للبروتينكيناز 32. لتطوير SHP2 الخلية الهدف الاشتباك المقايسة، استخدمنا الخلوية التحول الحراريالمقايسة 33. هذا الفحص، على غرار التحول الحراري في المختبر (PTS) للبروتينات34، يراقب الاستقرار الحراري البروتيني المستهدف ، والذي عادة ما يتم تغييره من خلال ربط الجزيئات الصغيرة. المقايسة الأصلية هي تحليل منخفض الإنتاجية يستخدم الأجسام المضادة لتحديد مستويات البروتين المستهدفة. بدلا من ذلك، اخترنا البديل ذكرت مؤخرا من تحليل التحول الحراري الذي يستخدم β-galactosidase إنزيم تكملة جزء (EFC) مقايسة(الشكل 2)35. لهذه التجارب، يتم التعبير عن البروتين من الفائدة في الخلايا كبروتين الانصهار N- أو C-المحطة الطرفية تحمل علامة ProLabel المحسنة (ePL، وهو جزء من الأحماض الأمينية 42 من β-galactosidase). ثم يتم نقل الخلايا إلى 384 جيدا لوحات متوافقة PCR ومحتضنة مع المركبات ذات الفائدة. ويستخدم الدراجات الحرارية لتطبيق تدرج درجة الحرارة على الخلايا، التي البروتينات سوف التكهد والتجميع كما يزيد درجة الحرارة على أساس استقرارها الحراري. إن قدرة المركب المرشح على ربط البروتين الذي يهمه وتثبيته سيؤدي إلى زيادة الاستقرار الحراري لهذا البروتين. لذلك ، بعد تحلل الخلايا ، ستظل البروتينات الموسومة التي استقرت من قبل مركب مرشح في الحل في درجات حرارة أعلى من بروتينات الخلايا الموسومة من الخلايا المحتضنة مع التحكم في السيارة. مراسل إنزيم acceptor (EA) قادر على استكمال البروتينات ذات العلامات ePL القابلة للذوبان ، مما يؤدي إلى نشاط β -galactosidase قابل للكشف باستخدام ركيزة الإنارة.

لقد طورنا مؤخرًا مقايسة حرارية خلوية قوية لـ SHP2 من النوع البري (SHP2-WT) ومتغير SHP2 oncogenic المتكرر (SHP2-E76K) فيتنسيق384-well مصغر. هنا، نحن الإبلاغ عن بروتوكول مفصل من هذا الفحص، الذي يكشف بشكل موثوق الاشتباك المستهدف من قبل مثبطات SHP2 في الخلايا ويظهر درجة عالية من الارتباط بين قوة المانع وبيانات التحول الحراري الخلوي. ويتضح سير العمل في الحسبة العامة في الشكل 3. تستخدم منصتنا بروتينات الاندماج ePL-SHP2 ذات الطول الكامل EPL-SHP2. للحصول على توليد pICP-ePL-N-SHP2-WT وpICP-ePL-N-SHP2-E76K التعبير، يرجى الرجوع إلى نشرنا الأخيرة36. ويمكن إجراء هذا الفحص باستخدام التدرج الحراري لإنشاء SHP2 الملامح الحرارية وتحديد SHP2 ذوبان درجات الحرارة في وجود أو عدم وجود المانع. وبمجرد تحديد الملامح الحرارية، يمكن أيضاً تنفيذها في ظل ظروف متساوية، مما يسمح بتقييم استجابة الجرعة المانعة. ويرد أدناه وصف لكلا النوعين من التجارب.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1- إعداد ثقافة الخلايا والكواشف

  1. صياغة زجاجة 500 مل من وسائل الإعلام النمو مع 10٪ مصل الأبقار الجنين، 1x مضاد حيوي / مضاد للحساسية، 20 مل HEPES، و 1 mM بيروفات الصوديوم. يُخزن عند 4 درجة مئوية.
  2. ذوبان الكواشف الحرارية الخلوية التحول (EA الكاشف، العازلة تحلل، والركيزة) من زجاجات المخزون الأصلي المجمدة.
  3. الاستغناء الكواشف والمخزن المؤقت كما aliquots مل 2 وتخزينها في -20 درجة مئوية.
    ملاحظة: تجنب التجميد/الذوبان لقابلية التكاثر واستخدام هذا الحجم فقط من الكاشف المطلوب لإجراء الفحص.

2. نمو وصيانة خلايا HEK293T

  1. الحصول على انخفاض ممر تنتق خلايا HEK293T من تخزين التبريد.
  2. الحفاظ على خلايا HEK293T في وسائل الإعلام النمو في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2.
  3. تقسيم الخلايا كل 4 أيام في نسبة 1:14.
    ملاحظة: للحصول على أفضل أداء، خلايا HEK293T غير مسموح بتمرير أكبر من 25 مرة.

3. HEK293T إعداد الخلية لtransfet عابرة

  1. فصل خلايا HEK293T من لوحات 16 مل باستخدام 3 مل من كاشف مفرزة الخلية.
  2. تمييع مع 12 مل من وسائل الإعلام النمو. جمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي في 1400 س ز لمدة 4 دقائق.
  3. إعادة تعليق بيليه في وسائل الإعلام نمو 10 مل. قياس تركيز وديموجة الخلايا باستخدام تريبان الأزرق وعداد الخلية.
  4. لوحة 7.0 × 105 تنمو بشكل كبير خلايا HEK293T في بئر في 6 جيدا خلية لوحة ثقافة 24 ساعة قبل transfection.
    ملاحظة: حجز بئر واحد لكل بلازميد أن تكون مصابة.
  5. احتضان لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO2.

4. Transfection من خلايا HEK293T

  1. من مخزون بلازميد المنقى من pICP-ePL-N-SHP2-WT أو pICP-ePL-N-SHP2-E76K (~ 200 نانوغرام/ميكرولتر) تمييع 2 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد إلى 200 ميكرولتر من العازلة عبر.
  2. دوامة لمدة 10 s والطرد المركزي في 1400 × ز لمدة 4 دقائق.
  3. أضف 4 ميكرولتر من كاشف الملوثات عبر الشبكي إلى الحمض النووي المخفف. دوامة لمدة 10 s والطرد المركزي في 1400 × ز لمدة 4 دقائق.
  4. احتضان في 23 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
  5. إزالة 6 جيدا لوحة تحتوي على خلايا HEK293T المتنامية من الحاضنة. أضف مزيج transfection إلى الخلايا المرفقة في لوحة 6-جيدا. احتضان لمدة 24 ساعة في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2.

5. إعداد لوحات فحص

  1. إعداد 10 mM حلول المخزون في DMSO من المركبات ليتم اختبارها.
  2. الاستغناء عن حلول مثبطات في 384-جيدا انخفاض حجم اللوحة المصدر الميت للاستخدام الفوري.
  3. بقعة الحجم المطلوب من مثبطات أو مركبة (DMSO) باستخدام معالج السائل في 384 جيدا في الوقت الحقيقي لوحات PCR في حجم النهائي المستهدف من أقل من 0.5٪ DMSO (V / الخامس). ختم لوحة باستخدام ختم لوحة مع تطهير الغاز الخامل.
    ملاحظة: بالنسبة لمقايسات استجابة الجرعة المانعة، تأكد من ردم DMSO وفقًا لذلك بحيث يتم استخدام كميات متساوية من DMSO لكل تركيز مثبط. للحصول على أفضل النتائج، لوحات تخزين في 23 درجة مئوية واستخدام لوحات داخل 24 ساعة.

6- انفصال الخلايا المُصابة بالعدوى وإعدادها

  1. Preincubate نمو وسائل الإعلام وخلية مفرزة في حمام الماء 37 °C. إزالة الخلايا المُصابة بالعدوى من الحاضنة. تُشعّر الوسائط بلطف من آبار اللوحة.
    ملاحظة: استخدام التعرق جديدة لكل بئر يحتوي على بلازميد مختلف عبر العدوى.
  2. إضافة 0.3 مل من كاشف مفرزة الخلية. صخرة بلطف لوحة ذهابا وإيابا لتغطية سطح لوحة أسفل بدقة. احتضان في 23 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة.
  3. إضافة 1 مل من وسائل الإعلام النمو إلى كل بئر. بلطف ماص وسائل الإعلام والخلايا في البئر ونقلها إلى أنبوب الطرد المركزي فالكون 15 مل. جمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي في 1400 س ز لمدة 4 دقائق.
  4. بلطف ولكن بدقة الطامح قبالة وسائل الإعلام.
    ملاحظة: المتبقية الفينول الأحمر في كاشف مفرزة الخلية يمكن أن تتداخل مع الفحص.
  5. بعناية إعادة تعليق خلية بيليه في 2 مل من وسائل الإعلام النمو. قياس تركيز وديموجة الخلايا باستخدام تريبان الأزرق وعداد الخلية.
    ملاحظة: يجب أن تكون قابلية الخلية > 90% للحصول على أفضل النتائج.
  6. تخفيف الخلايا إلى تركيز 125 الخلايا /μL. على سبيل المثال، بالنسبة لمحسب 5 ميكرولتر هذا هو ~ 625 خلية/ميكرولتر. للحصول على قابلية البقاء الأمثل إبقاء الخلايا في التعليق لمدة لا تزيد عن 2 ساعة.

7. حضانة الخلايا مع مثبطات SHP2

  1. توزيع الخلايا في معقمة وحيد قناة حل الحوض الصغير.
  2. جهاز طرد مركزي 384-جيدا في الوقت الحقيقي لوحة PCR التي تم إعدادها مسبقا من قبل ترسيب مثبطات SHP2 في 2500 × ز لمدة 5 دقائق في 23 درجة مئوية.
  3. إزالة الختم من لوحة المجمع. باستخدام ماصة متعددة القنوات 125 ميكرولتر، أضف 5 ميكرولتر من الخلايا المخففة إلى الآبار المرغوبة.
  4. الطرد المركزي لوحة في 42 × ز لمدة 30 s دون غطاء على لوحة. نعلق غطاء ختم على لوحة بعد نسج لوحة أسفل واحتضان لوحة المقايسة في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2 ل 1 ساعة.

8. إعداد مزيج مُكَدِر الكُشف

  1. إزالة الكمية اللازمة من الكواشف الكشف (كاشف EA، العازلة التحلل، والركيزة) من -20 درجة مئوية تخزين بعد خلايا الطلاء. ذوبان الكواشف في 23 درجة مئوية.
    ملاحظة: للحصول على الراحة في النقل، قم بإعداد وحدة تخزين 1.5x الحجم الإجمالي للخلايا التي تم إيداعها في اللوحة. لا تستخدم الكواشف بعد الاستخدام.
  2. إعداد مزيج رئيسي من الكواشف باستخدام شرط EA-10، والذي يتكون من الكسر المكون وحجم كما يلي: كاشف EA (0.17)، العازلة تحلل (0.17)، الركيزة (0.67).
    ملاحظة: تستند نسب الكاشف إلى تجارب التحسين التي يتم تنفيذها على النحو المحدد في دليل المورد.

9. النبض الحراري الحراري أو الحرارية التدرج الحراري

  1. برنامج الترموسيل الحراري قادرة على التدرج لتسليم نبض الحرارة.
    1. بالنسبة لتجارب التدرجات الشخصية الحرارية، قم ببرمجة التسوية الحرارية مع المواصفات التالية:
    2. نبض الحرارة: 3 دقيقة درجة حرارة الذوبان المطلوب (تدرج عمودي أو أفقي +/- 15 درجة مئوية؛ مثال 38-68 درجة مئوية موزعة على 24 بئراً تعطي زيادات في درجة الحرارة تبلغ 1.25 درجة مئوية).
  2. خطوة استرداد التوازن: 3 دقيقة 20 درجة مئوية مع سرعة المنحدر = 1 درجة مئوية / الثانية
    1. لتجارب الأيزوات الحرارية إعداد البروتوكول إعداد على النحو التالي:
    2. نبض الحرارة: 3 دقيقة 55 درجة مئوية. خطوة استرداد التوازن: 3 دقيقة 20 درجة مئوية مع سرعة المنحدر = 1 درجة مئوية / الثانية
      ملاحظة: لزيادة إعادة التكاثر، كما أنه يمكن أن يكون من الصعب وضع لوحة بدقة في الوقت الذي يصل درجة الحرارة الحرارية إلى درجة الحرارة المرجوة، وإعداد البرنامج لحساب أسفل 15 s قبل البدء في نبضة 3 دقيقة. لcycler المستخدمة في هذه التجربة انظر جدول المواد، يتم الاحتفاظ الغطاء أثناء نبض الحرارة.

10. تحلل الكشف والقياس

  1. لوحات فحص الملحق مع مزيج سيد الكشف عن التحلل عن طريق إضافة وحدات التخزين المتساوية (5 ميكرولتر) إلى كل بئر ليتم تحليلها باستخدام ماصة متعددة القنوات.
  2. جهاز طرد مركزي لوحة 42 × ز لمدة 30 s. يُحفظ عند درجة حرارة 23 درجة مئوية في الظلام لمدة 30-60 دقيقة.
  3. قياس chemiluminescence باستخدام قارئ microplate قادرة على الكشف عن الإنارة في شكل 384 جيدا. تنفيذ قياس الإنارة مع نوع لوحة ووقت التكامل الأمثل (وقت التكامل 1000 مللي ثانية، تسوية الوقت 0 s). قياس القيم كقيم/قيم ونواتج لمزيد من التحليل.

11 - تحليل البيانات

  1. تحليل بيانات الإنارة باستخدام برنامج رسم بياني وإحصاءات علميين 2D.
  2. توليد ملامح الحرارية من خلال تحليل بيانات الإنارة تطبيع (تطبيع لمراقبة السيارة) باستخدام الانحدار غير الخطية ونموذج بولتزمان sigmoidal.
    ملاحظة: في تجارب الملف الشخصي الحراري، فإن درجة الحرارة المحسوبة V50، وهي نقطة منتصف الطريق بين أسفل المنحنى وأعلىه، تحدد درجة حرارة الذوبان SHP2. في التجارب الحرارية، يحدد EC50 تركيز المانع الذي يعطي استجابة نصف قصوى.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وأسفرت تجربة التدرج الحراري لـ SHP2-WT عن تشكيل حراري خلوي من السيني مع انتقال ضيق للذوبان نموذجي ومتسق للبروتين المطوي (الشكل 4A). SHP2 يتكون من ثلاثة مجالات مستقلة : اثنين من المجالات SH2 والمجال الحفاز(الشكل 1). في ال أتمتة يُسَبّقّ ينقّلّة مغلقة هذا مجالات ذاتية الإقران; الانتقال الذوبان الذي لوحظ في تجربة الملف الشخصي الحراري يعكس هذه الحالة في الخلية. حضانة SHP2-WT مع مثبطات اللوستري SHP099 في 10 μM استقرت SHP2-WT الملف الحراري إلى درجة كبيرة وقابلة للقياس(الشكل 4A). وهذا يعكس وضع الربط المعروف من مثبطات مثل SHP099 التي تعمل بمثابة "الغراء الجزيئي"37 بين المجالات التنظيمية ربط SH2 و subunit الحفاز. الأهم من ذلك، لدينا الخلوية التحول الحراري فحص أكد أن SHP099 يمكن أن تخترق الخلية وربط إلى المسمى SHP2-WT. كما تم تتبع تثبيت SHP2 مع فاعلية المركبات الحرارية مثل SHP099. في 10 μM، وأكثر قوة RMC-4550 (ذكرت IC50 = 0.6 nM) أنتجت درجة أكبر من الاستقرار من SHP099 (ذكرت IC50 = 70 nM) ل SHP2-WT(الشكل 4B).

نلاحظ سلوك مختلف في الملف الشخصي الحراري للمقايسة الاشتباك الهدف مع طفرات oncogenic SHP2-E76K(الشكل 4C). يحتوي الملف الحراري لـ SHP2-E76K على انتقال ذوبان أقل ضيقًا ، مما يعكس عدم الاستقرار الذي تم نقله على الهيكل الثالث لـ SHP2 بواسطة طفرة E76K ، والتي من المعروف أنها تعطل التفاعلات بين مجالات SH2 واللون الفرعي الحفاز. لذلك، تم تخفيض درجة حرارة الذوبان الملاحظة مقارنة ببروتين WT. الأهم من ذلك، عندما احتضنت مع مثبطات اللوستري SHP099 في 10 μM، لوحظ الاستقرار الحراري الهامشية فقط، بما يتفق مع الخصائص المعروفة من SHP099 ومثبطات مماثلة28،29،30.

يمكن أن يؤثر مستوى التعبير للبروتين الموسومة بـ ePL الذي سيتم فحصه بشكل كبير على كثافة الإشارة. يظهر(الشكل 4D)هي ملفات تعريف حرارية لخلايا SHP2-WT العابرة والمتكاملة بشكل ثابت في ظل ظروف فحص متطابقة. التطبيع من هذه المنحنيات المتباينة يتيح ملامح الحرارية المقارنة (الشكل 4E)، مما يدل على مجموعة واسعة من نظام الكشف EFC. من المهم أن نلاحظ أن لدينا تستخدم على حد سواء transfection عابرة ومستقرة SHP2 التكامل التعبير عن الخلايا مع نتائج مماثلة. لتوليد خطوط الخلايا المستقرة تجدر الإشارة إلى أنه ينبغي استخدام خلايا HEK293 خلايا HEK293T بدلاً من خلايا HEK293T ، حيث أن خلايا HEK293T لديها بالفعل علامة مقاومة النيومايسين من شأنها أن تمنع اختيار الخلايا مع pICP-ePL-N-SHP2 plasmid المتكاملة ، والتي تحتوي على جينات النيوميسين / kanamycin لاختيارها في خلايا الثدييات.

للحصول على قياسات الإستجابة للجرعة المانعة، يمكن للمرء أن يقوم بإجراء المعايرات المركبة على الخلايا في ظل ظروف الأيزوحرارية. للقيام بذلك، نقترح أولا تحديد درجة الحرارة المثلى لهذه القياسات. الاستفادة من قدرة ثيرسيكلر لإنتاج التدرجات الحرارية على محور "قصير" من لوحة 384-جيدا، يمكن إجراء سلسلة من المعايرات الحرارية على لوحة واحدة. ويبين الشكل 5A النتائج التمثيلية لهذا التحسين ل SHP2-WT باستخدام جرعة محدودة من خمس نقاط استجابة RMC-4550. درجات الحرارة التي كانت منخفضة جدا لdenature البروتين أنتجت إشارة عالية التي كانت مستقلة عن المخدرات. وبالمثل، فإن درجات الحرارة العالية جداً لا تمنح قدرة كبيرة على استقرار البروتين للمركب. ومع ذلك، في درجة حرارة مثالية، كما تحددها هذه التجربة، المعايرة متساوي الحرارة باستخدام كامل 10 نقطة جرعة استجابة أسفرت عن ECمفيدة 50 لRMC-4550(الشكل 5B). بالإضافة إلى البيانات التمثيلية المعروضة هنا ، قررنا أن التجارب باستخدام الظروف الأيزوحرارية المثلى يمكن استخدامها لشاشات مثبطات SHP2 رواية بكفاءة لقدرتها على عبور أغشية الخلايا وإشراك هدفها في الخلايا36.

Figure 1
الشكل 1: تنظيم نشاط SHP2.
(أ)وينظم بإحكام SHP2 النشاط في الخلايا العادية. تحت الظروف الأساسية، فإن مجاله N-terminal SH2 يُحبوس في الموقع النشط ضمن نطاق الفوشطاتوز (PTP)، مما يؤدي إلى حدوث عملية تلقائية. يؤدي عامل النمو RTK وتحفيز السيتوكين إلى فسفور التيروزين من بروتينات المحول ، والتي ترتبط بعد ذلك بالمجالات SH2 ، مما يسبب تغييرًا في التشكل حيث يصبح الموقع النشط SHP2 في متناول ركائزه. (B)الطفرات SHP2 Somatic، وكثيرا ما توجد في اللوكيميا، وتقع في واجهة بين المجالات N-SH2 وphosphatase ومنع SHP2 من اعتماد التشكل مغلقة، autoinhibited، مما أدى إلى phosphatase نشط بشكل تأسيسي. (C) في الأورام الصلبة، التضخيم أو فرط التعبير عن عوامل النمو، RTKs، أو محولات السقالات يؤدي إلى تنشيط شاذ من SHP2. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: مبادئ التحول الحراري الخلوي SHP2.
ويستند لدينا تحليل الاشتباك الهدف الخلوي على β galactosidase (β-gal) إنزيم جزء تكملة (EFC) مقايسة. الخلايا (HEK293T)، التعبير عن SHP2 كامل الطول مع علامة الانصهار ePL (42 جزء من الأحماض الأمينية من β غال)، وتعامل مع مركب التحقيق وتخضع لنبض الحرارة قصيرة التي تسبب SHP2 إلى التفتيت وتشكيل مجاميع غير قابلة للذوبان لا يمكن الوصول إليها، مما يجعل علامة ePL لا يمكن الوصول إليها. يمكن ربط محددة من مجمع التحقيق إلى SHP2 تعزيز استقرارها الحراري. الاستقرار الحراري يوفر المزيد من البروتين المستهدف القابل للذوبان مع علامة ePL لتكملة في نظام مراسل انزيم chemiluminescence. المجاميع تؤدي إلى انخفاض التكملة والإنارة. وقد تم تعديل هذا الرقم من المرجع36. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: تدفق عمل معدات SHP2 المصغرة.
الأداء الروتيني للم مقايسة يجعل استخدام المعدات المشار إليها. يتم إعداد لوحات المقايسة باستخدام معالج سائل صوتي يوفر كميات من المركبات النانوية. يمكن إجراء نقل الخلايا يدويا، باستخدام ماصة متعددة القنوات، أو باستخدام موزع السائل التلقائي. يستخدم التكهّن بالنبضات الحرارية دراجات حرارية يمكنها توصيل تدرجات حرارية إلى لوحة 384 بئرًا. يتم استخدام قارئ microplate للكشف عن β غال EFC الفحص chemiluminescence. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: إشراك الهدف الخلوي لمثبطات SHP2 اللويسترية مع بروتينات SHP2-WT و SHP2-E76K.
(أ)بروتين SHP2-WT في وجود مركبة (DMSO، أحمر) أنتجت ملف تعريف حرارية خلوية حسن السلوك مع انتقال ذوبان ضيق يتفق مع بروتين مطوي في حالة autoinhibited. حضانة SHP2-WT التعبير عن الخلايا مع 10 μM SHP099 استقرت البروتين في حالة ملزمة (الأزرق). (ب)الخلوية الهدف الملامح الحرارية الاشتباك من SHP2-WT في غياب (أحمر) أو وجود SHP099 مثل المانع الكلستري RMC-4550 (10 ميكرومتر، الأزرق). أنتجت RMC-4550 زيادة تثبيت الخلوية من SHP2-WT من تلك التي لوحظت ل SHP099. هذه زيادة المسارات المشاركة الهدف مع قوتها الكيميائية الحيوية أكبر. (C) كان لدى متحولة SHP2-E76K منحنى انصهار أقل وضوحًا بما يتفق مع الحالة التي هي إلى حد كبير في الشكل النشط "المفتوح" (أحمر). SHP099 في 10 μM فقط زيادة هامشية SHP2-E76K درجة حرارة ذوبان (الأزرق)، وهو في اتفاق مع تثبيط الكيميائية الحيوية وبيانات فعالية الخلوية. (D)تتوافق إشارة chemiluminescence الملاحظة مع مستوى التعبير عن ePL-SHP2. بالمقارنة مع خلايا HEK293T المصابة بشكل عابر ، كان لدى خلايا HEK293 التي تم فيها دمج SHP2-WT الموسومة ePL بشكل ثابت في الجينوم ، مستوىً مخفضًا من تعبير ePL-SHP2. وبالتالي، أظهرت التشكيلات حرارية الخام غير المنوعة chemiluminesence إشارة الإنارة المتقلصة بشكل كبير لخلايا HEK293 (الزرقاء) مقارنة بالخلايا HEK293 المصابة بشكل عابر (أحمر). ه) التطبيع من البيانات الخام chemiluminescence مستقرة (HEK293) وعابرة عابرة (HEK293T) أنتجت ملامح حرارية مماثلة، مما يدل على حساسية القياسات. تمثل نقاط البيانات وأشرطة الخطأ (±SD) قياسات مكررة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: التفاعل الهدف الخلوي isothermal الجرعة استجابة مقايسة ل SHP2-WT.
(أ)من أجل وضع الظروف المثلى متساوي الحرارة لتقييم المشاركة المستهدفة المعتمدة على الجرعة لمثبطات SHP2، يتم أولاً إجراء تدرج حراري عبر المحور القصير لصفيحة 384-جيداً. وهذا يسمح بتقييم فعال للاستجابات الجرعة خمس نقاط من مثبطات (RMC-4550؛ 0.08-10 μM) لتحديد درجة الحرارة المثلى. (ب) جرعة خلوية كاملة من الجرعات الحرارية (10 نقاط) لRMC-4550 عند درجة حرارة مثالية قدرها 56 درجة مئوية. ويشار إلى الجماعة الأوروبية50 في هذه الدرجة. نقاط البيانات وأشرطة الخطأ (± SD) تمثل قياسات رباعية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

لقد قدمنا فحص الاشتباك الهدف التي يمكن أن تؤكد الربط المباشر للجزيئات الصغيرة إلى phosphatase SHP2 في الخلايا. يمكن أن تميز المقايسة بين مثبطات التقارب المنخفضة والعالية ، والأهم من ذلك ، تؤكد عدم فاعلية مثبطات اللوسترية من نوع SHP099 لـ GOF oncogenic SHP2-E76K. قوة هذا المقايسة المصغرة هي قدرتها على الاندماج في حملة فحص مثبطات SHP2. إن قدرة المقايسة على تأكيد الربط داخل الخلايا لـ SHP2 من قبل مادة كيميائية غير معروفة هي قدرة مهمة على ضمان إمكانية نشر موارد الفحص بكفاءة. وعموما، فإن البروتوكول المصغر قوي وموثوق به.

ومن الجوانب الهامة في الفحص هو التوقيت؛ يتم الحصول على أفضل النتائج 24 ساعة بعد transfection من خلايا HEK293T. بروتينات SHP2-WT و SHP2-E76K لا تبدو سامة; ومع ذلك، يمكن التعبير طويلة الأجل عالية تقليل حساسية التجربة وتتطلب إعادة الأمثل. المعالجة الدقيقة للخلايا لفصل وإعدادهم للمعايرة هو اعتبار نقدي إضافي. ومع ذلك، أساليب استزراع الخلية القياسية كافية لإنتاج بيانات عالية الجودة. لقد أدرجنا عددا من خطوات الطرد المركزي في سير العمل بسبب حجم صغير المستخدمة في هذا الفحص. هذه الخطوات لها الغرض لضمان الاختلاط الكمي، لذلك من المستحسن الالتزام بالتسارع والوقت للطرد المركزي. من الملاحظة، يمكن أن تعاني الكواشف المُعَسَرة بعد سوء التعامل. لذلك، نوصي بأن يتم اقتباسها وتخزينها مجمدة حتى الاستخدام.

المشكلة الأكثر شيوعا في أداء هذه المقايسة هو غير منتظم (صاخبة) أو انخفاض الإنارة إشارة. لتحديد مصدر هذه المشكلة، فمن الروتيني إجراء تحليل البقعة الغربية على الخلايا الحاملة للعدوى HEK293T باستخدام الأجسام المضادة لمضادات ePL لضمان مستوى التعبير الموثوق بها من SHP2-WT و SHP2-E76K. لقد حصلنا على أفضل النتائج باستخدام بروتوكول الكاشف الموضح في الخطوة 4. مرة واحدة يتم إنشاء ظروف transfection، ويتم الحصول على مخزون واحد من SHP2 التعبير البلازميد، وجدنا أن يكون موثوقا بها للغاية.

يتطلب تطوير الفحص الأمثل من نافذة إشارة chemiluminescent لضمان الحصول على نتائج موثوقة. لتحسين نافذة الفحص ، فإن المعلمة الأكثر أهمية هي صياغة المزيج الرئيسي للكشف عن الكواشف كما هو موضح في دليل المورد. يتم تنفيذ هذا التحسين عن طريق تغيير منهجي في EA كاشف إلى نسبة الركيزة في المزيج الرئيسي، في حين عقد عنصر العازلة تحلل ثابت (أربعة ظروف مختلفة عادة ما تكون كافية لهذا القياس). شرط مع صفر EA الكاشف بمثابة الخلفية. يتم إجراء الفحص كما هو موضح أعلاه، ويتم حساب نسبة الإشارة الملاحظة إلى الخلفية (S/B). يتم الحصول على نتائج موثوقة عندما تكون نسبة S/B >50. شروط المزيج الرئيسي التي تؤدي إشارة عالية بشكل غير عادي هي لتجنب، لأنها سوف تؤدي إلى استنفاد الركيزة chemiluminescence.

وهناك قيد محتمل من الفحص هو حساسيته. في تجربتنا, مثبطات مع ما لا يقل عن قوة منخفضة micromolar في SHP2 الفوسفاتاز تثبيط المقايسة مطلوبة لإنتاج تأثيرات قابلة للقياس في مقايسة التحول الحراري الخلوي. كمبدأ توجيهي عام، نقترح أولا لتقييم المركبات المرشحة في المختبرات PTS باستخدام المؤتلف SHP236. استنادا إلى نتائج من برنامج اكتشاف مثبطات SHP2 الجارية لدينا, قدرة المركبات على تحويل درجة حرارة ذوبان SHP2 في مسارات المختبر بشكل جيد مع قدرتها على استقرار (أو زعزعة استقرار في بعض الأحيان) بروتين SHP2 في الخلايا. ومن المثير للاهتمام, الاستقرار النسبي للSHP2-WT من قبل مثبطات اللوستيرية SHP099 مثل يبدو أن تكون أكبر من تلك التي تسببها قوية على قدم المساواة SHP2 مثبطات بالموقع الموجهة, تعكس على الأرجح قدرة مثبطات اللوستيرية لتحقيق الاستقرار الفعال في التشكل ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية من البروتين SHP2-WT.

بالإضافة إلى phosphatase SHP2، اكتسبنا خبرة في تطوير المقايسات إشراك الهدف الخلوية للفوسفاتاتات الأخرى وكينسيس. الاعتبار الرئيسي مع هدف بروتين مختلف هو الاستفادة من مزيج من التجارب التحكم الإيجابية والسلبية لتحديد صحة المقايسة، قبل الالتزام الكامل الموارد لتفسير بيانات ملزمة ليغاند. وعلاوة على ذلك، هناك تكنولوجيات أخرى متاحة لتقييم المشاركة في استهداف الهواتف الخلوية. لقد استكشفنا عددا من البدائل للفوسفاتز SHP2 ولكن وجدت هذا الفحص أن تكون مفيدة للغاية في جهودنا. وأخيراً، هذه المقايسة مستقلة عن النشاط الأنزيمي SHP2، وبالتالي يسمح لتقييم الأمثل من الجزيئات الصغيرة دون النظر إلى وضعها ملزمة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ويعلن المؤلفان أنهما لا يوجد لديهما أي تضارب في المصالح مع محتويات هذه المادة.

Acknowledgments

وقد تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منحة 1R21CA195422 (ل. T.) ، وجائزة مؤسسة إبشتاين الأسرة (إلى N. D. P.C.) ، ومركز NCI دعم مركز P30CA030199. وبالإضافة إلى ذلك، تم تمويل هذا المشروع كليا أو جزئيا بأموال اتحادية من المعهد الوطني للسرطان، والمعاهد الوطنية للصحة، بموجب عقد اتحاد البيولوجيا الكيميائية رقم 1. HHSN261200800001E. لا يعكس محتوى هذا المنشور بالضرورة آراء أو سياسات وزارة الصحة والخدمات الإنسانية، ولا يتضمن ذكر الأسماء التجارية أو المنتجات التجارية أو المنظمات تأييدًا من قبل حكومة الولايات المتحدة. والمحتوى هو مسؤولية المؤلفين وحده ولا يمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
384-well gradient equipped thermocycler Eppendorf AG X50h
384-well low dead volume microplate Echo qualified Beckman Coulter, Inc. LP-0200
6-well cell culture plates Greiner Bio-One 657 160 Sterile with lid
Antibiotic-Antimycotic (Anti Anti) 100 X Thermo Fisher Scientific 15240-062
Cell counter Thermo Fisher Scientific Countess II FL
Dulbecco's Modified Eagle Medium 1X + GlutaMAX Thermo Fisher Scientific 10566-016 500 mL
Echo acoustic liquid handler Beckman Coulter, Inc. Echo 550
Electronic multichannel pipette Thermo Fisher Scientific E1 ClipTip
Fetal bovine serum Thermo Fisher Scientific 26140-079 500 mL
HEPES buffer Thermo Fisher Scientific 15630-680 100 mL
InCell Pulse starter kit Eurofins DiscoverX Corp. 94-4007 Components include EA buffer, lysis buffer, and substrate
Microplate reader Tecan Trading AG Spark
Single channel solution trough Thermo Fisher Scientific S253012005
Sodium pyruvate Thermo Fisher Scientific 11360-010 100 mM
Thermal microplate sealer Agilent Technologies, Inc. PlateLoc
Transfection reagents Polyplus Transfection jetPRIME
Trypan blue Thermo Fisher Scientific T10282
TrypLE Express reagent Thermo Fisher Scientific 12605-010
Twin.tec 384 real-time PCR plates Eppendorf AG 30132734

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hunter, T. Tyrosine phosphorylation: thirty years and counting. Current Opinion in Cell Biology. 21 (2), 140-146 (2009).
  2. Alonso, A., et al. Protein tyrosine phosphatases in the human genome. Cell. 117 (6), 699-711 (2004).
  3. Cohen, P. Protein kinases-the major drug targets of the twenty-first century. Nature Reviews Drug Discovery. 1 (4), 309 (2002).
  4. Ferguson, F. M., Gray, N. S. Kinase inhibitors: the road ahead. Nature Reviews: Drug Discovery. 17 (5), 353-377 (2018).
  5. Stanford, S. M., Bottini, N. Targeting Tyrosine Phosphatases: Time to End the Stigma. Trends in Pharmacological Sciences. 38 (6), 524-540 (2017).
  6. Tonks, N. Protein tyrosine phosphatases--from housekeeping enzymes to master regulators of signal transduction. FEBS Journal. 280 (2), 346-378 (2013).
  7. Chan, R., Feng, G. PTPN11 is the first identified proto-oncogene that encodes a tyrosine phosphatase. Blood. 109 (3), 862-867 (2007).
  8. Chan, G., Kalaitzidis, D., Neel, B. The tyrosine phosphatase Shp2 (PTPN11) in cancer. Cancer Metastasis Rev. 27 (2), 179-192 (2008).
  9. Hof, P., Pluskey, S., Dhe-Paganon, S., Eck, M., Shoelson, S. Crystal structure of the tyrosine phosphatase SHP-2. Cell. 92 (4), 441-450 (1998).
  10. Barford, D., Neel, B. Revealing mechanisms for SH2 domain mediated regulation of the protein tyrosine phosphatase SHP-2. Structure. 6 (3), 249-254 (1998).
  11. Neel, B. G., Chan, G., Dhanji, S. Handbook of Cell Signaling (Second Edition). 2, Academic Press. Amsterdam. 771-809 (2010).
  12. Tartaglia, M., et al. Mutations in PTPN11, encoding the protein tyrosine phosphatase SHP-2, cause Noonan syndrome. Nature Genetics. 29 (4), 465-468 (2001).
  13. Yokosuka, T., et al. Programmed cell death 1 forms negative costimulatory microclusters that directly inhibit T cell receptor signaling by recruiting phosphatase SHP2. Journal of Experimental Medicine. 209 (6), 1201-1217 (2012).
  14. Okazaki, T., Maeda, A., Nishimura, H., Kurosaki, T., Honjo, T. PD-1 immunoreceptor inhibits B cell receptor-mediated signaling by recruiting src homology 2-domain-containing tyrosine phosphatase 2 to phosphotyrosine. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (24), 13866-13871 (2001).
  15. Watanabe, N., et al. BTLA is a lymphocyte inhibitory receptor with similarities to CTLA-4 and PD-1. Nature Immunology. 4 (7), 670-679 (2003).
  16. Bialy, L., Waldmann, H. Inhibitors of protein tyrosine phosphatases: next-generation drugs. Angewandte Chemie International Edition England. 44 (25), 3814-3839 (2005).
  17. Kumar, S., Liang, F., Lawrence, D., Zhang, Z. Small molecule approach to studying protein tyrosine phosphatase. Methods. 35 (1), 9-21 (2005).
  18. Tautz, L., Pellecchia, M., Mustelin, T. Targeting the PTPome in human disease. Expert Opinion in Thereapeutics Targets. 10 (1), 157-177 (2006).
  19. Tautz, L., Mustelin, T. Strategies for developing protein tyrosine phosphatase inhibitors. Methods. 42 (3), 250-260 (2007).
  20. Vintonyak, V., Antonchick, A., Rauh, D., Waldmann, H. The therapeutic potential of phosphatase inhibitors. Current Opinion in Chemical Biology. 13 (3), 272-283 (2009).
  21. Barr, A. Protein tyrosine phosphatases as drug targets: strategies and challenges of inhibitor development. Future Medicinal Chemistry. 2 (10), 1563-1576 (2010).
  22. He, R., Zeng, L., He, Y., Zhang, S., Zhang, Z. Small molecule tools for functional interrogation of protein tyrosine phosphatases. FEBS Journal. 280, 731-750 (2012).
  23. Tsutsumi, R., Ran, H., Neel, B. G. Off-target inhibition by active site-targeting SHP2 inhibitors. FEBS Open Biology. 8 (9), 1405-1411 (2018).
  24. Chen, Y. N., et al. Allosteric inhibition of SHP2 phosphatase inhibits cancers driven by receptor tyrosine kinases. Nature. 535 (7610), 148-152 (2016).
  25. Nichols, R. J., et al. RAS nucleotide cycling underlies the SHP2 phosphatase dependence of mutant BRAF-, NF1- and RAS-driven cancers. Nature Cell Biology. 20 (9), 1064-1073 (2018).
  26. Clinical Trial NCT03114319. , Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03114319?term=NCT03114319_rank=1 (2019).
  27. Clinical Trial NCT03634982. , Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03114319?term=NCT03634982_rank=1 (2019).
  28. Sun, X., et al. Selective inhibition of leukemia-associated SHP2(E69K) mutant by the allosteric SHP2 inhibitor SHP099. Leukemia. 32 (5), 1246-1249 (2018).
  29. LaRochelle, J. R., et al. Structural reorganization of SHP2 by oncogenic mutations and implications for oncoprotein resistance to allosteric inhibition. Nature Communication. 9 (1), 4508 (2018).
  30. Padua, R. A. P., et al. Mechanism of activating mutations and allosteric drug inhibition of the phosphatase SHP2. Nature Communication. 9 (1), 4507 (2018).
  31. Lu, H., et al. Resistance to allosteric SHP2 inhibition in FGFR-driven cancers through rapid feedback activation of FGFR. Oncotarget. 11 (3), 265-281 (2020).
  32. Smyth, L. A., Collins, I. Measuring and interpreting the selectivity of protein kinase inhibitors. Journal of Chemical Biology. 2 (3), 131-151 (2009).
  33. Martinez Molina, D., et al. Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay. Science. 341 (6141), 84-87 (2013).
  34. Ericsson, U., Hallberg, B., Detitta, G., Dekker, N., Nordlund, P. Thermofluor-based high-throughput stability optimization of proteins for structural studies. Analytical Biochemistry. 357 (2), 289-298 (2006).
  35. McNulty, D. E., et al. A High-Throughput Dose-Response Cellular Thermal Shift Assay for Rapid Screening of Drug Target Engagement in Living Cells, Exemplified Using SMYD3 and IDO1. SLAS Discovery. 23 (1), 34-46 (2018).
  36. Romero, C., et al. A cellular target engagement assay for the characterization of SHP2 (PTPN11) phosphatase inhibitors. Journal of Biological Chemistry. 295 (9), 2601-2613 (2020).
  37. Ran, H., Tsutsumi, R., Araki, T., Neel, B. G. Sticking It to Cancer with Molecular Glue for SHP2. Cancer Cell. 30 (2), 194-196 (2016).

Tags

هذا الشهر في JoVE العدد 161 الخلوية الهدف المقايسة المشاركة التحول الحراري الخلوي بروتين التيروزين الفوسفاتيز SRC-homology 2 التي تحتوي على المجال phosphatase SHP2 PTPN11 المانع الالستيري الصغيرة جزيء صغير دواء المضادة للسرطان اكتشاف المخدرات بروتين التفاعل المخدرات بروتين التفاعل المخدرات
تقييم المشاركة المستهدفة الخلوية من قبل SHP2 (PTPN11) مثبطات Phosphatase
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lambert, L. J., Romero, C.,… More

Lambert, L. J., Romero, C., Sheffler, D. J., Celeridad, M., Cosford, N. D. P., Tautz, L. Assessing Cellular Target Engagement by SHP2 (PTPN11) Phosphatase Inhibitors. J. Vis. Exp. (161), e61457, doi:10.3791/61457 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter