Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Vurdere cellulært målengasjement etter SHP2 (PTPN11) Fosfatasehemmere

Published: July 17, 2020 doi: 10.3791/61457
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Cancer Metabolism & Signaling Networks Program, NCI-Designated Cancer Center, Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute

Summary

Evnen til å vurdere målengasjement av kandidathemmere i intakte celler er avgjørende for narkotikaoppdagelse. Denne protokollen beskriver en 384 brønnformat cellulær termisk skift analyse som pålitelig oppdager cellulære mål engasjement av inhibitorer rettet mot enten vill-type SHP2 eller dets onkogene varianter.

Abstract

Src-homology 2 (SH2) domeneholdig fosfatase 2 (SHP2), kodet av PTPN11 proto-onkogen, er en viktig mekler av reseptor tyrosinkinase (RTK)-drevet cellesignalering, fremme celleoverlevelse og spredning. I tillegg rekrutteres SHP2 av immunkontrollpunktreseptorer for å hemme B- og T-celleaktivering. Avvikende SHP2-funksjon har vært innblandet i utvikling, progresjon og metastase av mange kreftformer. Faktisk har små molekyl SHP2-hemmere nylig gått inn i kliniske studier for behandling av faste svulster med Ras / Raf / ERK pathway aktivering, inkludert svulster med noen onkogene Ras mutasjoner. Imidlertid er den nåværende klassen av SHP2-hemmere ikke effektive mot SHP2 onkogene varianter som forekommer ofte i leukemier, og utviklingen av spesifikke små molekyler som retter seg mot onkogene SHP2 er gjenstand for gjeldende forskning. Et vanlig problem med de fleste narkotikaoppdagelseskampanjer som involverer cytosoliske proteiner som SHP2 er at de primære analysene som driver kjemisk oppdagelse ofte er in vitro-analyser som ikke rapporterer det cellulære målengasjementet til kandidatforbindelser. For å gi en plattform for måling av cellulært målengasjement utviklet vi både villtype og mutert SHP2 cellulære termiske skiftanalyser. Disse analysene oppdager pålitelig målengasjement av SHP2-hemmere i celler. Her gir vi en omfattende protokoll for denne analysen, som gir et verdifullt verktøy for vurdering og karakterisering av SHP2-hemmere.

Introduction

Tyrosinfosforylering spiller en viktig rolle i signaltransduksjon i cellene1,2. Denne endringen etter oversettelsen katalyseres av proteintyrosinkinaser (PTKs) og reversert av proteintyrosinfosfataser (PTP). Derfor fører avvikende PTK- eller PTP-funksjon til mange arvelige eller ervervede menneskeligesykdommer 3,,4,,5,,6. Src-homology 2 (SH2) domeneholdig fosfatase 2 (SHP2) er en bredt uttrykt ikke-reseptor type PTP kodet av proto-oncogene PTPN117 og er en viktig regulator av mange fysiologiske prosesser som involverer signaltransduksjon ved aktivering av Ras / Raf / ERK, PI3K/Akt eller JAK/STAT-signalveier8. Normalt er SHP2-aktiviteten tett regulert for å forhindre avvikende signalering. Under basale forhold er SHP2 automatisk oppdaget av sitt N-terminal SH2-domene, som blokkerer tilgangen til det aktive stedet innenfor katalytisk fosfatasedomene (figur 1A)9,10. Ved celleaktivering rekrutterer tyrosinfosforyler bindende proteiner SHP2, noe som får det til å vedta sin aktive konformasjon, der det aktive stedet nå er tilgjengelig for sine substrater. I mange kreftformer SHP2 aktivitet er forhøyet. Somatiske gain-of-function (GOF) mutasjoner i PTPN11 har blitt identifisert hovedsakelig i leukemier og hindre binding av N-SH2 domenet til fosfatasedomenet, noe som resulterer i konstituerende aktiv SHP2 (figur 1B)11. Germline GOF mutasjoner i PTPN11 er ansvarlig for ~ 50% av tilfellene av Noonan syndrom, en utviklingsforstyrrelse med økt risiko for malignitet12. I solide svulster, hvor PTPN11 mutasjoner er sjeldne, fører større nivåer av fosforylertbindende proteiner til forbedret SHP2-aktivitet (figur 1C). SHP2 er også viktig for immun kontrollpunkt signalering, som sjekkpunkt reseptorer som BTLA eller PD-1 rekruttere SHP2 å dephosphorylate viktige signalmolekyler, hindre immuncelle aktivering13,14,15.

Målretting av PTPs med små molekyler har vært en utfordring, fordi det aktive stedet for PTPs er svært bevart og høyt ladet; hemmere som retter seg mot det aktive stedet er ofte potente, men viser dårlig selektivitet og oral biotilgjengelighet16,17,18,19,20,21,22. Faktisk lider mange rapporterte SHP2-hemmere av dårlig selektivitet og mangel på effekt i celler23. Nylig er allosteriske hemmere av SHP2 med god styrke og utmerket selektivitet rapportert (f.eks. SHP09924 og RMC-455025) og har utløst fornyet interesse for SHP2-hemmere. Forbindelser basert på SHP099 og RMC-4550 er for tiden i fase I kliniske studier for å behandle solide svulster med reseptor tyrosin kinase (RTK) pathway aktivering26,27. Mens banebrytende, disse forbindelsene er ineffektive mot mange av SHP2 onkogene mutanter som driver leukemogenese hos et betydelig antall blodkreftpasienter28,29,30. Denne mangelen på styrke av SHP099-lignende forbindelser mot SHP2 onkogene varianter stammer fra deres unike allosteriske mekanisme, da de hemmer SHP2-aktivitet ved å binde og stabilisere den inaktive, lukkede konformasjonen, som forstyrres i SHP2 mutanter. Videre, basert på en fersk rapport31,er adaptive resistensmekanismer hos pasienter behandlet med SHP099-lignende hemmere ganske tenkelige. Følgelig er utviklingen av neste generasjon SHP2-hemmere som retter seg mot sin aktive, åpne tilstand et emne for intens forskning.

Karakteriseringen av nye SHP2-hemmere i celler er et viktig aspekt ved blyoptimaliseringsprosessen. Kritisk, bevist målengasjement av hemmeren under fysiologiske forhold gir et ekstra nivå av tillit til at ressurser for medisinsk kjemi er effektivt utplassert på forbindelser med lovende cellulær effekt. Tidligere har flere metoder for å vurdere bindingen av små molekylhemmere til sine mål blitt utviklet, hovedsakelig for proteinkinaser32. For å utvikle en SHP2 mobilnettet mål engasjement analyse, vi benyttet en cellulær termisk skift analyse33. Denne analysen, lik in vitro termisk skift (PTS) analyse for proteiner34,overvåker målet protein termisk stabilitet, som vanligvis endres ved binding av små molekyler. Den opprinnelige analysen er en lav gjennomstrømningsanalyse som benytter antistoffer for å kvantifisere målproteinnivåer. Alternativt valgte vi en nylig rapportert variant av den termiske skiftanalysen som benytter en β-galaktosidase enzymfragment komplementering (EFC) analyse (figur 2)35. For disse eksperimentene uttrykkes proteinet av interesse i celler som et N- eller C-terminalfusjonsprotein som bærer en forbedret ProLabel-tag (ePL, et 42 aminosyrefragment av β-galaktosidase). Celler overføres deretter til 384-brønns PCR-kompatible plater og inkuberes med forbindelser av interesse. En termocycler brukes til å bruke en temperaturgradient på cellene, hvis proteiner vil denatur og aggregere etter hvert som temperaturen øker basert på deres termiske stabilitet. Evnen til en kandidatforbindelse til å binde og stabilisere proteinet av interesse vil resultere i økt termisk stabilitet av det proteinet. Derfor, etter lysis av cellene, de taggede proteiner som har blitt stabilisert av en kandidat sammensatte vil forbli i løsning ved høyere temperaturer enn merket proteiner av celler inkubert med kjøretøy kontroll. Reporter enzym acceptor (EA) er i stand til å utfylle løselige ePL-merkede proteiner, noe som resulterer i påviselig β-galaktosidase aktivitet ved hjelp av et luminescence substrat.

Vi har nylig utviklet en robust cellulær termisk skift analyse for vill-type SHP2 (SHP2-WT) og en hyppig SHP2 onkogen variant (SHP2-E76K) i en miniatyrisert 384-brønn format36. Her rapporterer vi en detaljert protokoll for denne analysen, som pålitelig oppdager målengasjement av SHP2-hemmere i celler og viser en høy grad av korrelasjon mellom inhibitorstyrke og cellulære termiske skiftdata. Arbeidsflyten for generell analyse er illustrert i figur 3. Vår plattform bruker N-terminalt merket full lengde ePL-SHP2 fusjonproteiner. For generering av tilsvarende pICP-ePL-N-SHP2-WT og pICP-ePL-N-SHP2-E76K uttrykk plasmids, vennligst se vår sistepublikasjon 36. Denne analysen kan utføres ved hjelp av en termisk gradient for å etablere SHP2 termiske profiler og bestemme SHP2 smeltetemperaturer i nærvær eller fravær av inhibitor. Når termiske profiler er etablert, kan det også utføres under isotermiske forhold, slik at inhibitor dose-respons vurdering. Begge typer eksperimenter er beskrevet nedenfor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Utarbeidelse av cellekultur og reagenser

  1. Formuler en 500 ml flaske vekstmedier med 10 % fosterbovinserum, 1x antibiotika/antimikrotisk, 20 mM HEPES og 1 mM natriumpyuvat. Oppbevares ved 4 °C.
  2. Tin cellulære termiske skiftreagenser (EA-reagens, lysisbuffer og substrat) fra frosne originale lagerflasker.
  3. Dispenser reagenser og buffer som 2 ml aliquots og oppbevar ved -20 °C.
    MERK: Unngå frysing/tine for reproduserbarhet og bruk bare det volumet av reagensen som kreves for analyseprosedyren.

2. Vekst og vedlikehold av HEK293T-celler

  1. Få lav passasje tilhenger HEK293T celler fra cryo lagring.
  2. Vedlikehold HEK293T celler i vekstmedier ved 37 °C, 5% CO2.
  3. Del celler hver fjerde dag i et 1:14-forhold.
    MERK: For best ytelse har hek293T-celler ikke lov til å passere større enn 25 ganger.

3. HEK293T celle forberedelse for forbigående transfection

  1. Koble hek293t celler fra 16 ml plater ved hjelp av 3 ml av celleavløsningsreagensen.
  2. Fortynn med 12 ml vekstmedier. Samle celler ved sentrifugering ved 1400 x g i 4 min.
  3. Resuspend pellet i 10 ml vekst media. Mål konsentrasjonen og levedyktigheten til celler ved hjelp av trypan blå og en celleteller.
  4. Plate 7,0 x 105 eksponentielt voksende HEK293T celler per brønn i en 6 brønncellekulturplate ca. 24 timer før transfection.
    MERK: Reserver en brønn for hver plasmid som skal transiseres.
  5. Inkuber i 24 timer ved 37 °C, 5 % CO2.

4. Transinfeksjon av HEK293T-celler

  1. Fra en renset plasmid lager av pICP-ePL-N-SHP2-WT eller pICP-ePL-N-SHP2-E76K (~ 200 ng / μL) fortynne 2 μg plasmid DNA i 200 μL transfection buffer.
  2. Vortex i 10 s og sentrifuge ved 1400 x g i 4 min.
  3. Tilsett 4 μL transfeksjonsreagens til det fortynnede DNA-et. Vortex i 10 s og sentrifuge ved 1400 x g i 4 min.
  4. Inkuber ved 23 °C i 10 min.
  5. Fjern 6 brønnplaten som inneholder voksende HEK293T-celler fra inkubatoren. Tilsett transfeksjonsblandingen til de vedlagte cellene i 6-brønnsplaten. Inkuber i 24 timer ved 37 °C, 5 % CO2.

5. Utarbeidelse av analyseplater

  1. Forbered 10 mM lagerløsninger i DMSO av forbindelser som skal testes.
  2. Dispenser inhibitorløsninger i en 384-brønns lav dødvolumkildeplate for umiddelbar bruk.
  3. Plasser ønsket volum av inhibitorer eller kjøretøy (DMSO) ved hjelp av en væskehåndterer i 384-brønns pcr-plater i sanntid med et mål endelig volum på mindre enn 0,5% DMSO (v / v). Forsegle platen ved hjelp av en platetetningser med inert gassrensing.
    MERK: For inhibitordoseresponsanalyser må du påfylle DMSO tilsvarende slik at like mengder DMSO brukes til hver hemmerkonsentrasjon. For best resultat, oppbevar plater ved 23 °C og bruk plater innen 24 timer.

6. Transfected celleavløsning og forberedelse

  1. Preincubate vekst media og celle avløsning reagens i en 37 °C vannbad. Fjern trans infiserte celler fra inkubatoren. Aspirer forsiktig media fra brønnene på platen.
    MERK: Bruk en ny aspirator for hver brønn som inneholder en annen trans infisert plasmid.
  2. Tilsett 0,3 ml av celleredacheringsreagensen. Rock platen forsiktig frem og tilbake for å dekke overflaten av platebunnen grundig. Inkuber ved 23 °C i 2 min.
  3. Legg til 1 ml vekstmedier i hver brønn. Pipettemedier og celler forsiktig i brønnen og overfør til et 15 ml Falcon sentrifugerør. Samle celler ved sentrifugering ved 1400 x g i 4 min.
  4. Aspirer forsiktig, men grundig av mediene.
    MERK: Gjenværende fenolrød i celleavløsningsreagensen kan forstyrre analysen.
  5. Forsiktig resuspend celle pellet i 2 ml vekst media. Mål konsentrasjonen og levedyktigheten til celler ved hjelp av trypan blå og en celleteller.
    MERK: Celle levedyktighet bør være > 90% for best resultat.
  6. Fortynn celler til en konsentrasjon på 125 celler / μL. For en analyse på 5 μL er dette for eksempel ~625 celler/μL. For optimal levedyktighet holde cellene i suspensjon for ikke mer enn 2 timer.

7. Inkubasjon av celler med SHP2-hemmere

  1. Dispenser celler i en steril enkeltkanals løsning gjennom.
  2. Sentrifuge 384-brønns PCR-plate i sanntid som er forhåndsforberedt ved SHP2-hemmerdeponering ved 2500 x g i 5 min ved 23 °C.
  3. Fjern tetningen fra den sammensatte platen. Bruk en flerkanals pipette på 125 μl, tilsett 5 μL av de fortynnede cellene til ønskede brønner.
  4. Sentrifuger platen ved 42 x g i 30 s uten lokk på platen. Fest en lokkforsegling til platen etter at platen er spunnet ned og inkubere analyseplaten ved 37 °C, 5 % CO2 i 1 time.

8. Tilberedning av chemiluminescerende reagens master mix

  1. Fjern den nødvendige mengden deteksjonsreagenser (EA-reagens, lysisbuffer og substrat) fra -20 °C lagring etter platingceller. Tine reagenser ved 23 °C.
    MERK: For enkelhets skyld i overføringen, klargjør et volum som er 1,5x det totale volumet av celler som er deponert til platen. Ikke bruk reagenser på nytt etter bruk.
  2. Klargjør en hovedblanding av reagensene ved hjelp av tilstanden EA-10, som består av komponent- og volumfraksjon på følgende måte: EA-reagens (0,17), lysisbuffer (0,17), substrat (0,67).
    MERK: Reagensforhold er basert på optimaliseringseksperimenter utført som spesifisert i leverandørens håndbok.

9. Isotermisk eller termisk profil gradient varmepuls

  1. Programmer gradienten som er i stand til termocycler for levering av varmepuls.
    1. For termisk profil gradient eksperimenter, forhåndsprogrammere termocycler med følgende eksempel spesifikasjoner:
    2. Varmepuls: 3 min ønsket smeltetemperatur (vertikal eller horisontal gradient +/- 15 °C; eksempel 38-68 °C spredt over 24 brønner gir temperaturøkninger på 1,25 °C).
  2. Likevektsgjenvinningstrinn: 3 min 20 °C med rampehastighet = 1 °C/s
    1. For isotermiske eksperimenter konfigurerer du protokollen som er konfigurert på følgende måte:
    2. Varmepuls: 3 min 55 °C. Likevektsgjenvinningstrinn: 3 min 20 °C med rampehastighet = 1°C/s
      MERK: For økt reproduserbarhet, da det kan være vanskelig å plassere platen nøyaktig når termocycleren når ønsket temperatur, setter du opp programmet for å telle ned 15 s før du begynner 3 min puls. For termocycleren som brukes i dette eksperimentet, se Materialtabell, lokket holdes oppe under varmepulsen.

10. Lysis deteksjon og måling

  1. Supplere analyseplater med lysis deteksjon master mix ved tilsetning av like volumer (5 μL) til hver brønn som skal analyseres ved hjelp av en flerkanals pipette.
  2. Sentrifuger platen 42 x g for 30 s. Oppbevares ved 23 °C i mørket i 30-60 min.
  3. Mål chemiluminescence ved hjelp av en mikroplateleser som er i stand til å oppdage luminescens i 384-brønnsformat. Utfør luminescence måling med platetype og integreringstid optimalisert (integreringstid 1000 ms, avgjør tid 0 s). Mål verdier som tellinger/s og utgang for videre analyse.

11. Dataanalyse

  1. Analyser luminescence-dataene ved hjelp av en vitenskapelig 2D-graf- og statistikkprogramvare.
  2. Generer termiske profiler ved å analysere de normaliserte luminescence-dataene (normalisert til kjøretøykontrollen) ved hjelp av ikke-lineær regresjon og en Boltzmann sigmoidal modell.
    MERK: I termisk profileksperimenter definerer den beregnede V50, temperaturen som er halvveis mellom bunnen og toppen av kurven, smeltetemperaturen til SHP2. I isotermiske eksperimenter definerer EC50 konsentrasjonen av hemmeren som gir halvmaksimal respons.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Det termiske gradienteksperimentet for SHP2-WT resulterte i en sigmoidal cellulær termisk profil med en smal smelteovergang som er typisk og konsistent for et brettet protein (figur 4A). SHP2 består av tre uavhengige domener: to SH2-domener og det katalytiske domenet (figur 1). I den automatisk lukkede konformasjonen disse domenene selv-associate; smelteovergangen som ble observert i det termiske profileksperimentet, reflekterte antagelig denne tilstanden i cellen. Inkubasjon av SHP2-WT med den allosteriske hemmeren SHP099 ved 10 μM stabiliserte SHP2-WT termisk profil i betydelig og målbar grad (figur 4A). Dette reflekterer den kjente bindingsmodusen til SHP099-lignende hemmere som fungerer som "molekylærlim"37 mellom de regulatoriske bindende SH2-domenene og katalytisk underenhet. Viktigere, vår cellulære termisk skift analyse bekreftet at SHP099 kan trenge inn i cellen og binde til merket SHP2-WT. Stabiliseringen av SHP2 spores også med styrken av SHP099-lignende allosteriske forbindelser. Ved 10 μM produserte den mer potente RMC-4550 (rapportert IC50 = 0,6 nM) en større grad av stabilisering enn SHP099 (rapportert IC50 = 70 nM) for SHP2-WT (figur 4B).

Vi observerer en annen atferd i den termiske profilen til målengasjementsanalysen med den onkogene mutanten SHP2-E76K (figur 4C). Den termiske profilen for SHP2-E76K har en smelteovergang som er mindre smal, noe som gjenspeiler destabiliseringen som formidles på tertiærstrukturen til SHP2 av E76K-mutasjonen, som er kjent for å forstyrre interaksjoner mellom SH2-domenene og katalytisk underenhet. Derfor ble den observerte smeltetemperaturen redusert sammenlignet med WT-proteinet. Viktigere, når inkubert med den allosteriske hemmeren SHP099 ved 10 μM, ble det bare observert marginal termisk stabilisering, i samsvar med de kjente egenskapene til SHP099 og lignende hemmere28,,29,,30.

Uttrykksnivået til det ePL-merkede proteinet som skal undersøkes, kan dramatisk påvirke signalintensiteten. Vist (figur 4D) er termiske profiler for forbigående og stabilt integrerte SHP2-WT-celler under identiske analyseforhold. Normalisering av disse ulike kurvene gir sammenlignbare termiske profiler (figur 4E), noe som indikerer det brede spekteret av EFC-registreringssystemet. Det er viktig å merke seg at vi har ansatt både forbigående transfection og stabil integrasjon SHP2 uttrykke celler med sammenlignbare resultater. For generering av stabile cellelinjer bør det bemerkes at HEK293-celler i stedet for HEK293T-celler skal brukes, da HEK293T-celler allerede har en neomycinmotstandsmarkør som ville forhindre valg av celler med integrert pICP-ePL-N-SHP2 plasmid, som inneholder et neomycin / kanamycinresistensgen for valg i pattedyrceller.

For å oppnå målinger av inhibitordoserespons, kan man utføre sammensatte titreringer på celler under isotermiske forhold. For å gjøre dette foreslår vi først å bestemme temperaturen optimal for disse målingene. Ved å dra nytte av termocycler evnen til å produsere termiske gradienter på den "korte" aksen til en 384-brønns plate, kan en rekke isotermiske titreringer utføres på en enkelt plate. Figur 5A viser representative resultater av denne optimaliseringen for SHP2-WT ved hjelp av en begrenset fempunkts doserespons på RMC-4550. Temperaturer som var for lave til å denatur proteinet produsert et høyt signal som var uavhengig av stoffet. Tilsvarende temperaturer som var for høy gitt liten kapasitet for forbindelsen til å stabilisere proteinet. Men ved en optimal temperatur, som bestemt av dette eksperimentet, ga en isotermisk titrering ved hjelp av en full 10-punkts doserespons en nyttig EC50 for RMC-4550 (figur 5B). I tillegg til de representative dataene som vises her, har vi fastslått at eksperimenter ved hjelp av optimaliserte isotermiske forhold kan brukes til å effektivt screene romanen SHP2-hemmere for deres evne til å krysse cellemembraner og engasjere sitt mål iceller 36.

Figure 1
Figur 1: Regulering av SHP2-aktivitet.
(A) SHP2 aktivitet er tett regulert i normale celler. Under basale forhold okkluderer N-terminal SH2-domenet det aktive stedet innenfor fosfatasedomenet (PTP), noe som resulterer i autohemming. RTK vekstfaktor og cytokinstimulering fører til tyrosinfosforylering av adapterproteiner, som deretter binder seg til SH2-domenene, noe som forårsaker en konformasjonsendring der SHP2 aktive stedet blir tilgjengelig for sine substrater. (B)Somatiske SHP2 mutasjoner, ofte funnet i leukemier, er plassert i grensesnittet mellom N-SH2 og fosfatase domener og hindre SHP2 fra å vedta lukket, autoinhibited konformasjon, noe som resulterer i en utspekulerende aktiv fosfatase. (C)I faste svulster, forsterkning eller overuttrykk av vekstfaktorer, RTKs, eller stillas adaptere resultere i avvikende aktivering av SHP2. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: SHP2 cellulære termiske skiftprinsipper.
Vår cellulære målengasjementsanalyse er basert på en β-galaktosidase (β-gal) enzymfragment komplementering (EFC) analyse. Celler (HEK293T), som uttrykker full lengde SHP2 med en ePL fusion tag (42 aminosyre fragment av β-gal), behandles med en sonde sammensatte og blir utsatt for en kort varmepuls som fører SHP2 til denatur og danne utilgjengelige uoppløselige aggregater, noe som gjør ePL-koden utilgjengelig. Spesifikk binding av probeforbindelsen til SHP2 kan forbedre den termiske stabiliteten. Termisk stabilisering gir mer oppløselig målprotein med ePL-koden for komplementering i reporterenzymets chemiluminescence-system. Aggregater resulterer i redusert komplementasjon og luminescence. Dette tallet er endret fra ref.36. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Miniatyrisert arbeidsflyt for SHP2-utstyr.
Rutinemessig ytelse av analysen gjør bruk av utstyret som er angitt. Analyseplater tilberedes ved hjelp av en akustisk væskebehandling som leverer nanolitervolumer av forbindelser. Celleoverføring kan utføres manuelt, ved hjelp av en flerkanals pipette, eller ved hjelp av en automatisk væskedispenser. Varmepuls denaturation bruker en termocycler som kan levere termiske gradienter til en 384-brønns plate. En mikroplateleser brukes til å oppdage β-gal EFC-analysekjemiluminescens. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Cellulær målengasjement for allosteriske SHP2-hemmere med SHP2-WT- og SHP2-E76K-proteiner.
(A)SHP2-WT-proteinet i nærvær av kjøretøy (DMSO, rød) produserte en veloppdragen cellulær termisk profil med en smal smelteovergang i samsvar med et brettet protein i autohemmet tilstand. Inkubasjon av SHP2-WT som uttrykker celler med 10 μM SHP099 stabiliserte proteinet i bundet tilstand (blå). (B)Termiske termalprofiler for cellulær målengasjement av SHP2-WT i fravær (rød) eller tilstedeværelse av den SHP099-lignende allosteriske hemmeren RMC-4550 (10 μM, blå). RMC-4550 produserte en økt cellulær stabilisering av SHP2-WT enn det som ble observert for SHP099. Dette økte målengasjementet spor med sin større biokjemiske styrke. (C) SHP2-E76K mutant hadde en mindre uttalt smeltekurve i samsvar med en tilstand som i stor grad er i "åpen" aktiv form (rød). SHP099 ved 10 μM økte bare smeltetemperaturen SHP2-E76K (blå), som er i samsvar med biokjemisk hemming og cellulære effektdata. (D)Det observerte kjemiluminescenssignalet tilsvarer uttrykksnivået til ePL-SHP2. Sammenlignet med forbigående trans infiserte HEK293T-celler, hadde HEK293-celler der ePL-merket SHP2-WT ble stabilt integrert i genomet, et redusert nivå av ePL-SHP2-uttrykk. Følgelig viste de rå usnormaliserte chemiluminesence termiske profilene et sterkt redusert luminescenssignal for de stabilt uttrykte HEK293-cellene (blå) sammenlignet med de forbigående trans infiserte HEK293-cellene (rød). E) Normalisering av rå chemiluminescence data for stabil (HEK293) og forbigående trans infisert (HEK293T) produsert sammenlignbare termiske profiler, viser følsomheten av målingene. Datapunkter og feilfelt (±SD) representerer dupliserte målinger. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Mobilmålengasjement er toormal doseresponsanalyse for SHP2-WT.
(A)For å etablere optimale isotermiske forhold for å evaluere det doseavhengige målengasjementet til SHP2-hemmere, utføres en termisk gradient over den korte aksen til en 384-brønns plate først. Dette gjør det mulig å effektiv vurdering av fempunkts doseresponser av inhibitorer (RMC-4550; 0,08–10 μM) for å identifisere optimal temperatur. (B)En full cellulær isotermisk doserespons (10-punkts) for RMC-4550 ved en optimal temperatur på 56 °C. EC50 ved denne temperaturen er indikert. Datapunkter og feilfelt (± SD) representerer quadruplicate målinger. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi har presentert en målengasjementsanalyse som kan bekrefte direkte binding av små molekyler til SHP2 fosfatase i celler. Analysen kan diskriminere mellom lav og høy affinitetshemmere og, viktigst, bekrefte mangel på styrke av allosteriske hemmere av SHP099-typen for GOF onkogen SHP2-E76K mutant. En styrke ved denne miniatyriserte analysen er dens evne til å integreres i en SHP2-hemmerscreeningskampanje. Analysens evne til å bekrefte intracellulær binding til SHP2 av ukjent kjemisk materiale er en viktig kapasitet for å sikre at screeningressurser effektivt kan distribueres. Samlet sett er miniatyrisert protokoll robust og pålitelig.

Et kritisk aspekt ved analysen er timing; de beste resultatene oppnås 24 timer etter transinfeksjon av HEK293T-cellene. SHP2-WT- og SHP2-E76K-proteinene ser ikke ut til å være giftige; Imidlertid kan langsiktig høyt uttrykk redusere følsomheten til eksperimentet og ville kreve re-optimalisering. Forsiktig håndtering av celler for å løsne og forberede dem på analysen er en ekstra kritisk vurdering. Standard cellekulturmetoder er imidlertid tilstrekkelige til å produsere data av høy kvalitet. Vi har innlemmet en rekke sentrifugeringstrinn i arbeidsflyten på grunn av de små volumene som benyttes i denne analysen. Disse trinnene har som formål å sikre kvantitativ blanding, så overholdelse av akselerasjon og tid for sentrifugering anbefales. Vær oppmerksom på at analysereagensene kan lide etter dårlig håndtering. Derfor anbefaler vi at de blir aliquoted og lagret frosset til bruk.

Det vanligste problemet i utførelsen av denne analysen er et uberegnelig (støyende) eller lavt luminescence-signal. For å finne kilden til dette problemet, er det rutine å utføre vestlig flekkanalyse på trans infiserte HEK293T-celler ved hjelp av anti-ePL-antistoffer for å sikre et pålitelig uttrykksnivå av SHP2-WT og SHP2-E76K. Vi har oppnådd de beste resultatene ved hjelp av reagensprotokollen som er skissert i trinn 4. Når transfection forholdene er etablert, og en enkelt lager av SHP2 uttrykk plasmid er oppnådd, har vi funnet analysen å være svært pålitelig.

Analyseutvikling krever optimalisering av det kjemiluminescerende signalvinduet for å sikre at pålitelige resultater oppnås. For å optimalisere analysevinduet er den viktigste parameteren utformingen av deteksjonsreagens masterblandingen som beskrevet i leverandørens håndbok. Denne optimaliseringen utføres ved systematisk å endre EA-reagensen til substratforhold i hovedblandingen, mens lysisbufferkomponenten holdes konstant (fire forskjellige forhold er vanligvis tilstrekkelige for denne målingen). En tilstand med null EA-reagens fungerer som bakgrunn. Analysen utføres som beskrevet ovenfor, og forholdet mellom det observerte signalet til bakgrunn (S/B) beregnes. Pålitelige resultater oppnås når S/B-forholdet er >50. Master mix forhold som resulterer i usedvanlig høyt signal skal unngås, da de vil resultere i uttømming av chemiluminescence substrat.

En potensiell begrensning av analysen er dens følsomhet. Etter vår erfaring er det nødvendig med hemmere med minst lav mikromosestyrke i SHP2 fosfatasehemmingsanalyser for å produsere målbare effekter i den cellulære termiske skiftanalysen. Som en generell retningslinje foreslår vi først å vurdere kandidatforbindelser i in vitro PTS-analyser ved hjelp av rekombinant SHP236. Basert på resultater fra vårt pågående SHP2-inhibitoroppdagelsesprogram, sporer en forbindelser evne til å skifte SHP2 smeltetemperatur in vitro godt med sin evne til å stabilisere (eller noen ganger destabilisere) SHP2-proteinet i celler. Interessant, den relative stabiliseringen av SHP2-WT av SHP099-lignende allosteriske hemmere synes å være større enn det som skyldes like potente SHP2 aktive stedsrettede hemmere, sannsynligvis reflekterer evnen til de allosteriske hemmere å effektivt stabilisere en fysiologisk relevant konformasjon av SHP2-WT protein.

I tillegg til SHP2 fosfatase, har vi fått erfaring med å utvikle cellulære målengasjementsanalyser for andre fosfataser og kinaser. En primær vurdering med et annet proteinmål er å bruke en kombinasjon av positive og negative kontrolleksperimenter for å etablere analysens gyldighet, før de fullt ut forplikter ressurser til tolkningen av ligandbindingsdata. Videre finnes det andre teknologier tilgjengelig for å vurdere mobilmålengasjement. Vi har utforsket en rekke alternativer for SHP2 fosfatase, men har funnet denne analysen å være svært nyttig i vår innsats. Til slutt er denne analysen uavhengig av SHP2 enzymatisk aktivitet og muliggjør derfor evaluering og optimalisering av små molekyler uten hensyn til bindingsmodus.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de ikke har noen interessekonflikter med innholdet i denne artikkelen.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health Grant 1R21CA195422 (til L. T.), Epstein Family Foundation Award (til N. D. P.C.), og NCI Cancer Center Support Grant P30CA030199. I tillegg har dette prosjektet blitt finansiert helt eller delvis med føderale midler fra National Cancer Institute, National Institutes of Health, under Chemical Biology Consortium Contract No. HHSN261200800001E. Innholdet i denne publikasjonen gjenspeiler ikke nødvendigvis synspunktene eller retningslinjene til Department of Health and Human Services, og nevner heller ikke varenavn, kommersielle produkter eller organisasjoner som innebærer godkjenning fra den amerikanske regjeringen. Innholdet er utelukkende forfatternes ansvar og representerer ikke nødvendigvis de offisielle synspunktene til National Institutes of Health.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
384-well gradient equipped thermocycler Eppendorf AG X50h
384-well low dead volume microplate Echo qualified Beckman Coulter, Inc. LP-0200
6-well cell culture plates Greiner Bio-One 657 160 Sterile with lid
Antibiotic-Antimycotic (Anti Anti) 100 X Thermo Fisher Scientific 15240-062
Cell counter Thermo Fisher Scientific Countess II FL
Dulbecco's Modified Eagle Medium 1X + GlutaMAX Thermo Fisher Scientific 10566-016 500 mL
Echo acoustic liquid handler Beckman Coulter, Inc. Echo 550
Electronic multichannel pipette Thermo Fisher Scientific E1 ClipTip
Fetal bovine serum Thermo Fisher Scientific 26140-079 500 mL
HEPES buffer Thermo Fisher Scientific 15630-680 100 mL
InCell Pulse starter kit Eurofins DiscoverX Corp. 94-4007 Components include EA buffer, lysis buffer, and substrate
Microplate reader Tecan Trading AG Spark
Single channel solution trough Thermo Fisher Scientific S253012005
Sodium pyruvate Thermo Fisher Scientific 11360-010 100 mM
Thermal microplate sealer Agilent Technologies, Inc. PlateLoc
Transfection reagents Polyplus Transfection jetPRIME
Trypan blue Thermo Fisher Scientific T10282
TrypLE Express reagent Thermo Fisher Scientific 12605-010
Twin.tec 384 real-time PCR plates Eppendorf AG 30132734

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hunter, T. Tyrosine phosphorylation: thirty years and counting. Current Opinion in Cell Biology. 21 (2), 140-146 (2009).
  2. Alonso, A., et al. Protein tyrosine phosphatases in the human genome. Cell. 117 (6), 699-711 (2004).
  3. Cohen, P. Protein kinases-the major drug targets of the twenty-first century. Nature Reviews Drug Discovery. 1 (4), 309 (2002).
  4. Ferguson, F. M., Gray, N. S. Kinase inhibitors: the road ahead. Nature Reviews: Drug Discovery. 17 (5), 353-377 (2018).
  5. Stanford, S. M., Bottini, N. Targeting Tyrosine Phosphatases: Time to End the Stigma. Trends in Pharmacological Sciences. 38 (6), 524-540 (2017).
  6. Tonks, N. Protein tyrosine phosphatases--from housekeeping enzymes to master regulators of signal transduction. FEBS Journal. 280 (2), 346-378 (2013).
  7. Chan, R., Feng, G. PTPN11 is the first identified proto-oncogene that encodes a tyrosine phosphatase. Blood. 109 (3), 862-867 (2007).
  8. Chan, G., Kalaitzidis, D., Neel, B. The tyrosine phosphatase Shp2 (PTPN11) in cancer. Cancer Metastasis Rev. 27 (2), 179-192 (2008).
  9. Hof, P., Pluskey, S., Dhe-Paganon, S., Eck, M., Shoelson, S. Crystal structure of the tyrosine phosphatase SHP-2. Cell. 92 (4), 441-450 (1998).
  10. Barford, D., Neel, B. Revealing mechanisms for SH2 domain mediated regulation of the protein tyrosine phosphatase SHP-2. Structure. 6 (3), 249-254 (1998).
  11. Neel, B. G., Chan, G., Dhanji, S. Handbook of Cell Signaling (Second Edition). 2, Academic Press. Amsterdam. 771-809 (2010).
  12. Tartaglia, M., et al. Mutations in PTPN11, encoding the protein tyrosine phosphatase SHP-2, cause Noonan syndrome. Nature Genetics. 29 (4), 465-468 (2001).
  13. Yokosuka, T., et al. Programmed cell death 1 forms negative costimulatory microclusters that directly inhibit T cell receptor signaling by recruiting phosphatase SHP2. Journal of Experimental Medicine. 209 (6), 1201-1217 (2012).
  14. Okazaki, T., Maeda, A., Nishimura, H., Kurosaki, T., Honjo, T. PD-1 immunoreceptor inhibits B cell receptor-mediated signaling by recruiting src homology 2-domain-containing tyrosine phosphatase 2 to phosphotyrosine. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (24), 13866-13871 (2001).
  15. Watanabe, N., et al. BTLA is a lymphocyte inhibitory receptor with similarities to CTLA-4 and PD-1. Nature Immunology. 4 (7), 670-679 (2003).
  16. Bialy, L., Waldmann, H. Inhibitors of protein tyrosine phosphatases: next-generation drugs. Angewandte Chemie International Edition England. 44 (25), 3814-3839 (2005).
  17. Kumar, S., Liang, F., Lawrence, D., Zhang, Z. Small molecule approach to studying protein tyrosine phosphatase. Methods. 35 (1), 9-21 (2005).
  18. Tautz, L., Pellecchia, M., Mustelin, T. Targeting the PTPome in human disease. Expert Opinion in Thereapeutics Targets. 10 (1), 157-177 (2006).
  19. Tautz, L., Mustelin, T. Strategies for developing protein tyrosine phosphatase inhibitors. Methods. 42 (3), 250-260 (2007).
  20. Vintonyak, V., Antonchick, A., Rauh, D., Waldmann, H. The therapeutic potential of phosphatase inhibitors. Current Opinion in Chemical Biology. 13 (3), 272-283 (2009).
  21. Barr, A. Protein tyrosine phosphatases as drug targets: strategies and challenges of inhibitor development. Future Medicinal Chemistry. 2 (10), 1563-1576 (2010).
  22. He, R., Zeng, L., He, Y., Zhang, S., Zhang, Z. Small molecule tools for functional interrogation of protein tyrosine phosphatases. FEBS Journal. 280, 731-750 (2012).
  23. Tsutsumi, R., Ran, H., Neel, B. G. Off-target inhibition by active site-targeting SHP2 inhibitors. FEBS Open Biology. 8 (9), 1405-1411 (2018).
  24. Chen, Y. N., et al. Allosteric inhibition of SHP2 phosphatase inhibits cancers driven by receptor tyrosine kinases. Nature. 535 (7610), 148-152 (2016).
  25. Nichols, R. J., et al. RAS nucleotide cycling underlies the SHP2 phosphatase dependence of mutant BRAF-, NF1- and RAS-driven cancers. Nature Cell Biology. 20 (9), 1064-1073 (2018).
  26. Clinical Trial NCT03114319. , Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03114319?term=NCT03114319_rank=1 (2019).
  27. Clinical Trial NCT03634982. , Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03114319?term=NCT03634982_rank=1 (2019).
  28. Sun, X., et al. Selective inhibition of leukemia-associated SHP2(E69K) mutant by the allosteric SHP2 inhibitor SHP099. Leukemia. 32 (5), 1246-1249 (2018).
  29. LaRochelle, J. R., et al. Structural reorganization of SHP2 by oncogenic mutations and implications for oncoprotein resistance to allosteric inhibition. Nature Communication. 9 (1), 4508 (2018).
  30. Padua, R. A. P., et al. Mechanism of activating mutations and allosteric drug inhibition of the phosphatase SHP2. Nature Communication. 9 (1), 4507 (2018).
  31. Lu, H., et al. Resistance to allosteric SHP2 inhibition in FGFR-driven cancers through rapid feedback activation of FGFR. Oncotarget. 11 (3), 265-281 (2020).
  32. Smyth, L. A., Collins, I. Measuring and interpreting the selectivity of protein kinase inhibitors. Journal of Chemical Biology. 2 (3), 131-151 (2009).
  33. Martinez Molina, D., et al. Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay. Science. 341 (6141), 84-87 (2013).
  34. Ericsson, U., Hallberg, B., Detitta, G., Dekker, N., Nordlund, P. Thermofluor-based high-throughput stability optimization of proteins for structural studies. Analytical Biochemistry. 357 (2), 289-298 (2006).
  35. McNulty, D. E., et al. A High-Throughput Dose-Response Cellular Thermal Shift Assay for Rapid Screening of Drug Target Engagement in Living Cells, Exemplified Using SMYD3 and IDO1. SLAS Discovery. 23 (1), 34-46 (2018).
  36. Romero, C., et al. A cellular target engagement assay for the characterization of SHP2 (PTPN11) phosphatase inhibitors. Journal of Biological Chemistry. 295 (9), 2601-2613 (2020).
  37. Ran, H., Tsutsumi, R., Araki, T., Neel, B. G. Sticking It to Cancer with Molecular Glue for SHP2. Cancer Cell. 30 (2), 194-196 (2016).

Tags

Denne måneden i JoVE utgave 161 cellulær målengasjement analyse cellulær termisk skift protein tyrosin fosfatase Src-homology 2 domeneholdig fosfatase SHP2 PTPN11 allosterisk hemmer lite molekyl kreft narkotika narkotika funn protein narkotika interaksjon
Vurdere cellulært målengasjement etter SHP2 (PTPN11) Fosfatasehemmere
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lambert, L. J., Romero, C.,… More

Lambert, L. J., Romero, C., Sheffler, D. J., Celeridad, M., Cosford, N. D. P., Tautz, L. Assessing Cellular Target Engagement by SHP2 (PTPN11) Phosphatase Inhibitors. J. Vis. Exp. (161), e61457, doi:10.3791/61457 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter