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Cancer Research

Evaluación del compromiso de objetivos celulares por inhibidores de la fosfatasa SHP2 (PTPN11)

Published: July 17, 2020 doi: 10.3791/61457
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Cancer Metabolism & Signaling Networks Program, NCI-Designated Cancer Center, Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute

Summary

La capacidad de evaluar la participación objetivo de los inhibidores candidatos en las células intactas es crucial para el descubrimiento de fármacos. Este protocolo describe un ensayo de cambio térmico celular de formato de 384 pozos que detecta de forma fiable el compromiso de destino celular de inhibidores dirigidos a SHP2 de tipo salvaje o sus variantes oncogénicas.

Abstract

La fosfatasa 2 (SHP2) que contiene dominio Src-homología 2), codificada por el protooncogene PTPN11, es un mediador clave de la señalización celular impulsada por la tirosina quinasa del receptor (RTK), promoviendo la supervivencia y proliferación celular. Además, SHP2 es reclutado por receptores de punto de control inmune para inhibir la activación de células B y T. La función aberrante SHP2 se ha implicado en el desarrollo, progresión y metástasis de muchos tipos de cáncer. De hecho, los inhibidores de SHP2 de moléculas pequeñas han entrado recientemente en ensayos clínicos para el tratamiento de tumores sólidos con activación de la vía Ras/Raf/ERK, incluidos tumores con algunas mutaciones rasgénicas oncogénicas. Sin embargo, la clase actual de inhibidores SHP2 no es eficaz contra las variantes oncogénicas SHP2 que ocurren con frecuencia en las leucemias, y el desarrollo de moléculas pequeñas específicas que se dirigen a SHP2 oncogénico es objeto de investigación actual. Un problema común con la mayoría de las campañas de descubrimiento de fármacos que involucran proteínas citosólicas como SHP2 es que los ensayos primarios que impulsan el descubrimiento químico son a menudo ensayos in vitro que no reportan la participación de la diana celular de los compuestos candidatos. Para proporcionar una plataforma para medir el compromiso de objetivos celulares, desarrollamos ensayos de desplazamiento térmico celular SHP2 de tipo salvaje y mutante. Estos ensayos detectan de forma fiable la participación objetivo de los inhibidores de SHP2 en las células. Aquí, proporcionamos un protocolo integral de este ensayo, que proporciona una herramienta valiosa para la evaluación y caracterización de los inhibidores de SHP2.

Introduction

La fosforilación de tirosina desempeña un papel importante en la transducción de señales en las células1,2. Esta modificación post-traduccional es catalizada por proteínas tirosina quinasas (PTK) y revertida por proteínas tirosina fosfatasas (PTP). Por lo tanto, la función aberrante PTK o PTP conduce a muchas enfermedades humanas heredadas o adquiridas3,4,5,6. La fosfatasa 2 (SHP2) que contiene dominios Src-homología 2 (SHP2) es un PTP de tipo no receptor ampliamente expresado codificado por el proto-oncogene PTPN117 y es un regulador clave de numerosos procesos fisiológicos que implican la transducción de señales por activación de las vías de señalización Ras/Raf/ERK, PI3K/Akt o JAK/STAT8. Normalmente, la actividad de SHP2 está estrechamente regulada para evitar la señalización aberrante. En condiciones basales, SHP2 es autoinhibitado por su dominio SH2 del terminal N, que bloquea el acceso al sitio activo dentro del dominio catalítico de fosfatasa (Figura 1A)9,10. Tras la activación celular, las proteínas de unión fosforiladas de tirosina reclutan SHP2, lo que hace que adopte su conformación activa, en la que el sitio activo es ahora accesible a sus sustratos. En muchos tipos de cáncer, la actividad de SHP2 es elevada. Las mutaciones somáticas de ganancia de función (GOF) en PTPN11 se han identificado principalmente en las leucemias y evitan la unión del dominio N-SH2 al dominio de la fosfatasa, lo que resulta en SHP2(Figura 1B)11constitutivamente activo. Las mutaciones de Germline GOF en PTPN11 son responsables del 50% de los casos de síndrome de Noonan, un trastorno del desarrollo con un mayor riesgo de neoplasia maligna12. En los tumores sólidos, donde las mutaciones de PTPN11 son raras, mayores niveles de proteínas de unión fosforiladas conducen a una mayor actividad de SHP2 (Figura 1C). SHP2 también es importante para la señalización de puntos de control inmune, ya que los receptores de punto de control como BTLA o PD-1 reclutan SHP2 para desfosforilar moléculas clave de señalización, evitando la activación de células inmunitarias13,,14,,15.

Apuntar a los PTP con moléculas pequeñas ha sido un desafío, porque el sitio activo de los PTP está altamente conservado y altamente cargado; inhibidores que apuntan al sitio activo son a menudo potentes, pero exhiben mala selectividad y biodisponibilidad oral16,17,18,19,20,21,22. De hecho, muchos inhibidores de SHP2 reportados sufren de mala selectividad y falta de eficacia en las células23. Recientemente, se han notificado inhibidores alostéricos de SHP2 con buena potencia y excelente selectividad (por ejemplo, SHP09924 y RMC-455025)y han despertado un renovado interés en los inhibidores de SHP2. Los compuestos basados en SHP099 y RMC-4550 se encuentran actualmente en ensayos clínicos de fase I para tratar tumores sólidos con activación de la vía de tirosina quinasa receptora (RTK)26,,27. Mientras que innovadores, estos compuestos son ineficaces contra muchos de los mutantes oncogénicos SHP2 que impulsan la leukemogénesis en un número significativo de pacientes con cáncer de sangre28,,29,30. Esta falta de potencia de los compuestos similares a SHP099 hacia las variantes oncogénicas SHP2 se deriva de su mecanismo alostérico único, ya que inhiben la actividad de SHP2 al unir y estabilizar la conformación inactiva y cerrada, que se interrumpe en los mutantes SHP2. Además, sobre la base de un informe reciente31,los mecanismos de resistencia adaptativa en pacientes tratados con inhibidores similares a SHP099 son bastante concebibles. En consecuencia, el desarrollo de inhibidores SHP2 de próxima generación que se dirigen a su estado activo y abierto es un tema de intensa investigación.

La caracterización de nuevos inhibidores de SHP2 en las células es un aspecto esencial del proceso de optimización del plomo. Críticamente, el compromiso objetivo probado del inhibidor en condiciones fisiológicas proporciona un nivel adicional de confianza de que los recursos para la química medicinal se despliegan eficientemente en compuestos con eficacia celular prometedora. En el pasado, se han desarrollado varios métodos para evaluar la unión de inhibidores de moléculas pequeñas a sus objetivos, principalmente para las quinasas proteicas32. Para desarrollar un ensayo de compromiso de objetivo celular SHP2, utilizamos un ensayo de desplazamiento térmico celular33. Este ensayo, similar al ensayo de desplazamiento térmico in vitro (PTS) para proteínas34, supervisa la estabilidad térmica de la proteína objetivo, que normalmente se ve alterada por la unión de moléculas pequeñas. El ensayo original es un ensayo de bajo rendimiento que utiliza anticuerpos para cuantificar los niveles de proteína objetivo. Alternativamente, elegimos una variante recientemente reportada del ensayo de cambio térmico que utiliza un ensayo de β-galactosidasa en forma de fragmentos de enzima (EFC)(Figura 2)35. Para estos experimentos, la proteína de interés se expresa en las células como una proteína de fusión N o C-terminal que lleva una etiqueta ProLabel mejorada (ePL, un fragmento de 42 aminoácidos de β-galactosidasa). Las células se transfieren a placas compatibles con PCR de 384 pozos y se incuban con compuestos de interés. Un termociclador se utiliza para aplicar un gradiente de temperatura a las células, cuyas proteínas desnaturalizarán y se agregarán a medida que la temperatura aumenta en función de su estabilidad térmica. La capacidad de un compuesto candidato para unir y estabilizar la proteína de interés resultará en una mayor estabilidad térmica de esa proteína. Por lo tanto, después de la lysis de las células, las proteínas etiquetadas que han sido estabilizadas por un compuesto candidato permanecerán en solución a temperaturas más altas que las proteínas etiquetadas de las células incubadas con el control del vehículo. El aceptador de enzimas reporter (EA) es capaz de complementar las proteínas solubles etiquetadas con ePL, lo que resulta en una actividad detectable β-galactosidasa utilizando un sustrato de luminiscencia.

Recientemente desarrollamos un robusto ensayo de cambio térmico celular para SHP2 de tipo salvaje (SHP2-WT) y una variante oncogénica SHP2 frecuente (SHP2-E76K) en un formato miniaturizado de 384pozos 36. Aquí, informamos de un protocolo detallado de este ensayo, que detecta de forma fiable el compromiso de destino por parte de los inhibidores de SHP2 en las células y demuestra un alto grado de correlación entre la potencia del inhibidor y los datos de desplazamiento térmico celular. El flujo de trabajo de ensayo general se ilustra en la Figura 3. Nuestra plataforma utiliza proteínas de fusión ePL-SHP2 con la etiqueta N-terminal. Para la generación de los plásmidos de expresión pICP-ePL-N-SHP2-WT y pICP-ePL-N-SHP2-E76K correspondientes, consulte nuestra reciente publicación36. Este ensayo se puede realizar utilizando un gradiente térmico para establecer perfiles térmicos SHP2 y determinar las temperaturas de fusión de SHP2 en presencia o ausencia de inhibidor. Una vez establecidos los perfiles térmicos, también se puede realizar en condiciones isotérmicas, lo que permite la evaluación de la dosis-respuesta del inhibidor. Ambos tipos de experimentos se describen a continuación.

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Protocol

1. Preparación del cultivo celular y reactivos

  1. Formular una botella de 500 ml de medios de crecimiento con 10% de suero bovino fetal, 1x antibiótico/antimético, HEPES de 20 mM y piruvato sódico de 1 mM. Conservar a 4oC.
  2. Descongelar reactivos de desplazamiento térmico celular (reactivo EA, tampón de lysis y sustrato) de botellas de stock originales congeladas.
  3. Dispensar los reactivos y tampón como alícuotas de 2 ml y almacenar a -20 oC.
    NOTA: Evite la congelación/descongelación para la reproducibilidad y utilice únicamente el volumen de reactivo necesario para el procedimiento de ensayo.

2. Crecimiento y mantenimiento de células HEK293T

  1. Obtenga células HEK293T adherentes de paso bajo del almacenamiento criográfico.
  2. Mantener las células HEK293T en medios de crecimiento a 37oC, 5% CO2.
  3. Dividir celdas cada 4 días en una proporción de 1:14.
    NOTA: Para obtener el mejor rendimiento, las celdas HEK293T no pueden pasar más de 25 veces.

3. Preparación celular HEK293T para transfección transitoria

  1. Separe las células HEK293T de placas de 16 ml utilizando 3 ml del reactivo de desprendimiento de células.
  2. Diluir con 12 ml de medios de crecimiento. Recoger las células por centrifugación a 1.400 x g durante 4 min.
  3. Resuspender el pellet en medios de crecimiento de 10 ml. Mida la concentración y viabilidad de las células utilizando el azul tripano y un contador celular.
  4. Placa 7.0 x 105 células HEK293T de crecimiento exponencial por pozo en una placa de cultivo celular de 6 pozos aproximadamente 24 h antes de la transfección.
    NOTA: Reserve un pozo para que cada plásmido sea trans infectado.
  5. Incubar durante 24 h a 37oC, 5% CO2.

4. Transfección de células HEK293T

  1. De un material de plásmido purificado de pICP-ePL-N-SHP2-WT o pICP-ePL-N-SHP2-E76K (200 ng/L) diluir 2 g de ADN plásmido en 200 l de tampón de transfección.
  2. Vórtice para 10 s y centrífuga a 1.400 g durante 4 min.
  3. Añadir 4 l de reactivo de transfección al ADN diluido. Vórtice para 10 s y centrífuga a 1.400 g durante 4 min.
  4. Incubar a 23oC durante 10 min.
  5. Retire de la incubadora la placa de 6 pozos que contiene células HEK293T en crecimiento. Agregue la mezcla de transfección a las celdas conectadas en la placa de 6 pocillos. Incubar durante 24 h a 37oC, 5% CO2.

5. Preparación de placas de ensayo

  1. Preparar soluciones de stock de 10 mM en DMSO de compuestos a probar.
  2. Dispensar soluciones inhibidoras en una placa de fuente de bajo volumen de 384 pozos para su uso inmediato.
  3. Detecte el volumen deseado de inhibidores o vehículos (DMSO) utilizando un manipulador de líquidos en placas PCR en tiempo real de 384 pozos a un volumen final objetivo inferior al 0,5% de DMSO (v/v). Selle la placa con un sellador de placas con purga de gas inerte.
    NOTA: Para los ensayos de dosis-respuesta de inhibidores, asegúrese de rellenar dmSO en consecuencia para que se utilicen cantidades iguales de DMSO para cada concentración de inhibidor. Para obtener los mejores resultados, almacene las placas a 23oC y utilice las placas en un plazo de 24 h.

6. Desprendimiento y preparación de células transfectosas

  1. Preincubinar medios de crecimiento y reactivo de desprendimiento celular en un baño de agua de 37oC. Retire las células trans infectadas de la incubadora. Aspirar suavemente los medios de los pozos de la placa.
    NOTA: Utilice un nuevo aspirador para cada pozo que contenga un plásmido trans infectado diferente.
  2. Añadir 0,3 ml del reactivo de desprendimiento de celda. Mece suavemente la placa hacia adelante y hacia atrás para cubrir a fondo la superficie de la parte inferior de la placa. Incubar a 23oC durante 2 min.
  3. Añadir 1 ml de medios de crecimiento a cada pozo. Pipetee suavemente los medios y las células del pozo y transfiera a un tubo centrífugo Falcon de 15 ml. Recoger las células por centrifugación a 1.400 x g durante 4 min.
  4. Aspirar suavemente pero a fondo los medios de comunicación.
    NOTA: El rojo fenol residual en el reactivo de desprendimiento de células puede interferir con el ensayo.
  5. Pellet de células resuspendidas cuidadosamente en 2 ml de medios de crecimiento. Mida la concentración y viabilidad de las células utilizando el azul tripano y un contador celular.
    NOTA: La viabilidad celular debe ser > 90% para obtener mejores resultados.
  6. Diluir las células a una concentración de 125 células/L. Por ejemplo, para un ensayo de 5 l, se trata de 625 celdas/L. Para una viabilidad óptima, mantenga las células en suspensión durante no más de 2 h.

7. Incubación de células con inhibidores de SHP2

  1. Dispensar las células en una solución estéril de un solo canal.
  2. Placa PCR centrífuga en tiempo real de 384 bien que ha sido pre-preparada por la deposición del inhibidor SHP2 a 2.500 x g durante 5 min a 23 oC.
  3. Retire el sello de la placa compuesta. Usando una pipeta multicanal de 125 l, agregue 5 l de las células diluidas a los pozos deseados.
  4. Centrifugar la placa a 42 x g durante 30 s sin tapa en la placa. Coloque un sello de tapa en la placa después de que la placa se hila hacia abajo e incubar la placa de ensayo a 37 oC, 5% deCO2 durante 1 h.

8. Preparación de la mezcla maestra de reactivos quimiominiscentes

  1. Elimine la cantidad necesaria de reactivos de detección (reactivo de EA, tampón de lelisis y sustrato) del almacenamiento de -20 oC después de las células de chapado. Reactivos de descongelación a 23oC.
    NOTA: Para mayor comodidad en la transferencia, prepare un volumen que sea 1,5 veces el volumen total de celdas que se han depositado en la placa. No reutilice los reactivos después de su uso.
  2. Preparar una mezcla maestra de los reactivos utilizando la condición EA-10, que consiste en el componente y la fracción de volumen de la siguiente manera: reactivo de EA (0,17), tampón de lesis (0,17), sustrato (0,67).
    NOTA: Las relaciones de reactivos se basan en experimentos de optimización realizados según lo especificado en el manual del proveedor.

9. Pulso de calor de gradiente isotérmico o térmico

  1. Programe el termociclocidor con capacidad de gradiente para la entrega de pulso de calor.
    1. Para experimentos de gradiente de perfil térmico, preprograme el termociclotro con las siguientes especificaciones de ejemplo:
    2. Pulso de calor: 3 minutos de temperatura de fusión deseada (gradiente vertical u horizontal +/- 15 oC; ejemplo 38-68 oC repartidos en 24 pozos produce incrementos de temperatura de 1,25 oC).
  2. Paso de recuperación de la equilibración: 3 min 20 oC con velocidad de rampa a 1 oC/s
    1. Para experimentos isotérmicos, configure el protocolo configurado de la siguiente manera:
    2. Pulso de calor: 3 min 55oC. Paso de recuperación de la equilibración: 3 min 20 oC con velocidad de rampa a 1 oC/s
      NOTA: Para una mayor reproducibilidad, ya que puede ser difícil colocar la placa con precisión en el momento en que el termociclador alcanza la temperatura deseada, configure el programa para contar 15 s antes de comenzar el pulso de 3 minutos. Para el termociclador utilizado en este experimento ver Tabla de materiales,la tapa se mantiene durante el pulso de calor.

10. Detección y medición de la lysis

  1. Suplemento de placas de ensayo con mezcla maestra de detección de lysis mediante la adición de volúmenes iguales (5 l) a cada pozo a analizar utilizando una pipeta multicanal.
  2. Centrifugar la placa 42 x g para 30 s. Conservar a 23oC en la oscuridad durante 30-60 min.
  3. Mida la quimiuminescencia utilizando un lector de microplacas capaz de detectar luminiscencia en formato de 384 pocóculos. Realice la medición de luminiscencia con el tipo de placa y el tiempo de integración optimizados (tiempo de integración 1000 ms, tiempo de liquidación 0 s). Mida los valores como recuentos/s y salida para su posterior análisis.

11. Análisis de datos

  1. Analice los datos de luminiscencia utilizando un software científico de gráficos y estadísticas 2D.
  2. Genere perfiles térmicos mediante el análisis de los datos de luminiscencia normalizados (normalizados al control del vehículo) utilizando una regresión no lineal y un modelo sigmoidal Boltzmann.
    NOTA: En los experimentos de perfil térmico, el V50calculado, la temperatura que es el punto intermedio entre la parte inferior y la parte superior de la curva, define la temperatura de fusión de SHP2. En experimentos isotérmicos, EC50 define la concentración del inhibidor que da una respuesta medio máxima.

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Representative Results

El experimento de gradiente térmico para SHP2-WT dio como resultado un perfil térmico celular sigmoidal con una transición de fusión estrecha que es típica y consistente para una proteína plegada (Figura 4A). SHP2 consta de tres dominios independientes: dos dominios SH2 y el dominio catalítico(Figura 1). En la conformación cerrada autoinhibida estos dominios se autoasocian; la transición de fusión que se observó en el experimento de perfil térmico presumiblemente refletió este estado en la célula. La incubación de SHP2-WT con el inhibidor alostérico SHP099 a 10 oM estabilizó el perfil térmico SHP2-WT en un grado significativo y medible (Figura 4A). Esto refleja el modo de unión conocido de inhibidores similares a SHP099 que actúan como "pegamento molecular"37 entre los dominios SH2 de unión regulador y la subunidad catalítica. Es importante destacar que nuestro ensayo de cambio térmico celular confirmó que SHP099 puede penetrar la célula y unirse al SHP2-WT etiquetado. La estabilización de SHP2 también se den seguimiento con la potencia de los compuestos alostéricos similares a SHP099. A 10 m, el RMC-4550 más potente (IC reportado50 a 0,6 nM) produjo un mayor grado de estabilización que SHP099 (IC reportado50 a 70 nM) para SHP2-WT (Figura 4B).

Observamos un comportamiento diferente en el perfil térmico del ensayo de compromiso objetivo con el mutante oncogénico SHP2-E76K (Figura 4C). El perfil térmico para SHP2-E76K tiene una transición de fusión que es menos estrecha, reflejando la desestabilización impartida en la estructura terciaria de SHP2 por la mutación E76K, que se sabe que interrumpe las interacciones entre los dominios SH2 y la subunidad catalítica. Por lo tanto, la temperatura de fusión observada se redujo en comparación con la proteína WT. Es importante destacar que, cuando se incuba con el inhibidor alostériico SHP099 a 10 m, sólo se observó una estabilización térmica marginal, consistente con las propiedades conocidas de SHP099 e inhibidores similares28,,29,,30.

El nivel de expresión de la proteína etiquetada por ePL que se va a sondear puede influir dramáticamente en la intensidad de la señal. Se muestran (Figura 4D) son perfiles térmicos para células SHP2-WT integradas transitorias y estables en condiciones de ensayo idénticas. La normalización de estas curvas dispares permite perfiles térmicos comparables (Figura 4E), lo que indica la amplia gama del sistema de detección EFC. Es importante tener en cuenta que hemos empleado tanto la transfección transitoria como la integración estable de células expresantes SHP2 con resultados comparables. Para la generación de líneas celulares estables, cabe señalar que se deben utilizar células HEK293 en lugar de células HEK293T, ya que las células HEK293T ya tienen un marcador de resistencia a la neomicina que impediría la selección de células con plásmido pICP-ePL-N-SHP2 integrado, que contiene un gen de resistencia a la neomicina/kanamicina para su selección en células de mamíferos.

Para obtener mediciones de dosis-respuesta de inhibidores, se pueden realizar valoraciones compuestas en las células en condiciones isotérmicas. Para ello, sugerimos determinar primero la temperatura óptima para estas mediciones. Aprovechando la capacidad del termociclo para producir gradientes térmicos en el eje "corto" de una placa de 384 pocillos, se puede realizar una serie de valoraciones isotérmicas en una sola placa. La Figura 5A muestra los resultados representativos de esta optimización para SHP2-WT utilizando una respuesta limitada de dosis de cinco puntos de RMC-4550. Las temperaturas que eran demasiado bajas para desnaturalizar la proteína produjeron una señal alta que era independiente de la droga. Del mismo modo, las temperaturas que eran demasiado altas ofrecían poca capacidad para que el compuesto estabilizara la proteína. Sin embargo, a una temperatura óptima, según lo determinado por este experimento, una valoración isotérmica utilizando una respuesta de dosis completa de 10 puntos produjo una EC50 útil para RMC-4550(Figura 5B). Además de los datos representativos que se muestran aquí, hemos determinado que los experimentos que utilizan condiciones isotérmicas optimizadas se pueden emplear para examinar eficientemente nuevos inhibidores de SHP2 por su capacidad para cruzar membranas celulares y comprometer su objetivo en las células36.

Figure 1
Figura 1: Regulación de la actividad de SHP2.
(A) La actividad SHP2 está estrechamente regulada en células normales. En condiciones basales, su dominio SH2 del terminal N ocluye el sitio activo dentro del dominio de fosfatasa (PTP), lo que resulta en autoinhibición. El factor de crecimiento RTK y la estimulación de la citoquina conducen a la fosforilación de tirosina de las proteínas adaptadoras, que luego se unen a los dominios SH2, causando un cambio conformacional por el cual el sitio activo SHP2 se vuelve accesible a sus sustratos. (B) Las mutaciones de Somatic SHP2, que frecuentemente se encuentran en las leucemias, se encuentran en la interfaz entre los dominios N-SH2 y fosfatasa e impiden que SHP2 adopte la conformación cerrada, autoinhibitada, lo que resulta en una fosfatasa constitutivamente activa. (C) En tumores sólidos, amplificación o sobreexpresión de factores de crecimiento, RTKs o adaptadores de andamios dan lugar a una activación aberrante de SHP2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Principios de cambio térmico celular SHP2.
Nuestro ensayo de compromiso de objetivo celular se basa en un ensayo de β-galactosidasa (β-gal) de fragmentos de enzimas (EFC). Las células (HEK293T), que expresan SHP2 de longitud completa con una etiqueta de fusión ePL (42 fragmentos de aminoácidos de β-gal), se tratan con un compuesto de sonda y se someten a un breve pulso de calor que hace que SHP2 desnaturaliza y forme agregados insolubles inaccesibles, haciendo que la etiqueta ePL sea inaccesible. La unión específica del compuesto de la sonda a SHP2 puede mejorar su estabilidad térmica. La estabilización térmica proporciona una proteína diana más soluble con la etiqueta ePL para su complementación en el sistema de quimioluminiscencia enzimática del reportero. Los agregados reducen la complementación y la luminiscencia. Esta cifra se ha modificado a partir de la referencia36. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Flujo de trabajo de equipos SHP2 miniaturizados.
El rendimiento rutinario del ensayo hace uso del equipo indicado. Las placas de ensayo se preparan utilizando un manipulador de líquido acústico que proporciona volúmenes de nanolitros de compuestos. La transferencia de celdas se puede realizar manualmente, utilizando una pipeta multicanal, o utilizando un dispensador automático de líquidos. La desnaturalización del pulso de calor utiliza un termociclador que puede entregar gradientes térmicos a una placa de 384 pocillos. Se utiliza un lector de microplacas para detectar la quimimiminiscencia del ensayo EFC de β galones. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Compromiso de objetivo celular de inhibidores alostéricos SHP2 con proteínas SHP2-WT y SHP2-E76K.
(A) La proteína SHP2-WT en presencia de vehículo (DMSO, rojo) produjo un perfil térmico celular bien portado con una transición de fusión estrecha consistente con una proteína plegada en estado autoinhibitado. La incubación de células de expresión SHP2-WT con 10 m SHP099 estabilizó la proteína en estado de unión (azul). (B) Perfiles térmicos de compromiso de objetivo celular de SHP2-WT en ausencia (rojo) o presencia del inhibidor alostérico similar a SHP099 RMC-4550 (10 m, azul). RMC-4550 produjo una mayor estabilización celular de SHP2-WT que la observada para SHP099. Este mayor compromiso objetivo realiza un seguimiento con su mayor potencia bioquímica. (C) El mutante SHP2-E76K tenía una curva de fusión menos pronunciada consistente con un estado que está en gran parte en la forma activa "abierta" (rojo). SHP099 a 10 m sólo aumentó marginalmente la temperatura de fusión SHP2-E76K (azul), que está de acuerdo con la inhibición bioquímica y los datos de eficacia celular. (D) La señal de quimiluminiscencia observada corresponde al nivel de expresión de ePL-SHP2. En comparación con las células HEK293T trans infectadas transitoriamente, las células HEK293 en las que la ePL etiquetada SHP2-WT se integró de forma estable en el genoma, tenían un nivel reducido de expresión ePL-SHP2. En consecuencia, los perfiles térmicos de quimiuminesencia no normalizados en bruto mostraron una señal de luminiscencia muy reducida para las células HEK293 (azul) que expresan de forma estable en comparación con las células HEK293 transfectadas transitoriamente (rojo). E) La normalización de los datos de quimiuminescencia en bruto para estables (HEK293) y trans infectados transitoriamente (HEK293T) produjo perfiles térmicos comparables, mostrando la sensibilidad de las mediciones. Los puntos de datos y las barras de error (±SD) representan mediciones duplicadas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Ensayo de dosis-respuesta isotérmica de compromiso de objetivo celular para SHP2-WT.
(A) Con el fin de establecer condiciones isotérmicas óptimas para evaluar el compromiso objetivo dependiente de la dosis de los inhibidores SHP2, se realiza por primera vez un gradiente térmico a través del eje corto de una placa de 384 pozos. Esto permite una evaluación eficiente de las respuestas a la dosis de cinco puntos de los inhibidores (RMC-4550; 0,08–10 oM) para identificar la temperatura óptima. (B) Una dosis-respuesta isotérmica celular completa (10 puntos) para RMC-4550 a una temperatura óptima de 56oC. Se indica la EC50 a esta temperatura. Los puntos de datos y las barras de error (± SD) representan medidas cuadrúplicas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Hemos presentado un ensayo de compromiso objetivo que puede confirmar la unión directa de moléculas pequeñas a la fosfatasa SHP2 en las células. El ensayo puede discriminar entre inhibidores de baja y alta afinidad y, lo que es más importante, confirmar la falta de potencia por parte de los inhibidores alostéricos del tipo SHP099 para el mutante SHP2-E76K oncogénico DEL GOF. Una fortaleza de este ensayo miniaturizado es su capacidad para integrarse en una campaña de detección de inhibidores de SHP2. La capacidad del ensayo para confirmar la unión intracelular a SHP2 por materia química desconocida es una capacidad importante para asegurar que los recursos de cribado puedan desplegarse de manera eficiente. En general, el protocolo miniaturizado es robusto y fiable.

Un aspecto crítico del ensayo es el tiempo; mejores resultados se obtienen 24 h después de la transfección de las células HEK293T. Las proteínas SHP2-WT y SHP2-E76K no parecen ser tóxicas; sin embargo, la alta expresión a largo plazo podría reducir la sensibilidad del experimento y requeriría una re-optimización. Un manejo cuidadoso de las células para separarlas y prepararlas para el ensayo es una consideración crítica adicional. Sin embargo, los métodos de cultivo celular estándar son suficientes para producir datos de alta calidad. Hemos incorporado una serie de pasos de centrifugación en el flujo de trabajo debido a los pequeños volúmenes utilizados en este ensayo. Estos pasos tienen el propósito de asegurar la mezcla cuantitativa, por lo que se recomienda la adherencia a la aceleración y el tiempo de centrifugación. Cabe destacar que los reactivos del ensayo pueden sufrir después de un manejo deficiente. Por lo tanto, recomendamos que se alicuen y se almacenen congelados hasta su uso.

El problema más comúnmente encontrado en el rendimiento de este ensayo es una señal errática (ruidosa) o de baja luminiscencia. Para determinar el origen de este problema, es rutinario realizar análisis de manchas occidentales en células HEK293T transfectosas utilizando anticuerpos anti-ePL para asegurar un nivel de expresión confiable de SHP2-WT y SHP2-E76K. Hemos obtenido los mejores resultados utilizando el protocolo de reactivos descrito en el paso 4. Una vez establecidas las condiciones de transfección, y se obtiene un solo stock de plásmido de expresión SHP2, hemos encontrado que el ensayo es altamente confiable.

El desarrollo del ensayo requiere la optimización de la ventana de señal quimiominioscente para asegurar que se obtengan resultados confiables. Para optimizar la ventana de ensayo, el parámetro más significativo es la formulación de la mezcla maestra de reactivos de detección como se describe en el manual del proveedor. Esta optimización se realiza cambiando sistemáticamente la relación de reactivo de EA a sustrato en la mezcla maestra, mientras que el componente tampón de la lysis se mantiene constante (cuatro condiciones diferentes suelen ser suficientes para esta medición). Una condición con cero reactivo ea sirve como fondo. El ensayo se realiza como se ha descrito anteriormente, y se calcula la relación de la señal observada con el fondo (S/B). Los resultados fiables se obtienen cuando la relación S/B es >50. Se deben evitar las condiciones de mezcla maestras que dan lugar a una señal extraordinariamente alta, ya que darán lugar al agotamiento del sustrato de quimiuminescencia.

Una posible limitación del ensayo es su sensibilidad. En nuestra experiencia, los inhibidores con al menos una potencia micromolar baja en los ensayos de inhibición de la fosfatasa SHP2 son necesarios para producir efectos medibles en el ensayo de cambio térmico celular. Como pauta general, sugerimos evaluar primero los compuestos candidatos en ensayos in vitro de PTS utilizando SHP236recombinante . Según los resultados de nuestro programa de descubrimiento de inhibidores SHP2 en curso, una capacidad de compuestos para cambiar la temperatura de fusión de SHP2 in vitro rastrea bien con su capacidad para estabilizar (o a veces desestabilizar) la proteína SHP2 en las células. Curiosamente, la estabilización relativa de SHP2-WT por inhibidores alostéricos similares a SHP099 parece ser mayor que la causada por inhibidores activos de SHP2 dirigidos por SHP2, probablemente reflejando la capacidad de los inhibidores alostéricos para estabilizar eficazmente una conformación fisiológicamente relevante de la proteína SHP2-WT.

Además de la fosfatasa SHP2, hemos adquirido experiencia en el desarrollo de ensayos de compromiso de objetivos celulares para otras fosfatasas y quinasas. Una consideración principal con un objetivo proteico diferente es utilizar una combinación de experimentos de control positivo y negativo para establecer la validez del ensayo, antes de comprometer completamente los recursos a la interpretación de los datos de unión de ligandos. Además, hay otras tecnologías disponibles para evaluar el compromiso de objetivos celulares. Hemos explorado una serie de alternativas para la fosfatasa SHP2, pero hemos encontrado que este ensayo es muy útil en nuestros esfuerzos. Por último, este ensayo es independiente de la actividad enzimática de SHP2 y, por lo tanto, permite la evaluación y optimización de moléculas pequeñas sin tener en cuenta su modo de unión.

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Disclosures

Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses con el contenido de este artículo.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por la Beca de los Institutos Nacionales de Salud 1R21CA195422 (a L. T.), el Premio de la Fundación de la Familia Epstein (a N. D. P.C.), y la Beca de Apoyo al Centro Oncológico NCI P30CA030199. Además, este proyecto ha sido financiado total o parcialmente con fondos federales del Instituto Nacional del Cáncer, Institutos Nacionales de Salud, bajo el Contrato No. del Consorcio de Biología Química. HHSN261200800001E. El contenido de esta publicación no refleja necesariamente las opiniones o políticas del Departamento de Salud y Servicios Humanos, ni la mención de nombres comerciales, productos comerciales u organizaciones implica la aprobación por parte del Gobierno de los Estados Unidos. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales de los Institutos Nacionales de Salud.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
384-well gradient equipped thermocycler Eppendorf AG X50h
384-well low dead volume microplate Echo qualified Beckman Coulter, Inc. LP-0200
6-well cell culture plates Greiner Bio-One 657 160 Sterile with lid
Antibiotic-Antimycotic (Anti Anti) 100 X Thermo Fisher Scientific 15240-062
Cell counter Thermo Fisher Scientific Countess II FL
Dulbecco's Modified Eagle Medium 1X + GlutaMAX Thermo Fisher Scientific 10566-016 500 mL
Echo acoustic liquid handler Beckman Coulter, Inc. Echo 550
Electronic multichannel pipette Thermo Fisher Scientific E1 ClipTip
Fetal bovine serum Thermo Fisher Scientific 26140-079 500 mL
HEPES buffer Thermo Fisher Scientific 15630-680 100 mL
InCell Pulse starter kit Eurofins DiscoverX Corp. 94-4007 Components include EA buffer, lysis buffer, and substrate
Microplate reader Tecan Trading AG Spark
Single channel solution trough Thermo Fisher Scientific S253012005
Sodium pyruvate Thermo Fisher Scientific 11360-010 100 mM
Thermal microplate sealer Agilent Technologies, Inc. PlateLoc
Transfection reagents Polyplus Transfection jetPRIME
Trypan blue Thermo Fisher Scientific T10282
TrypLE Express reagent Thermo Fisher Scientific 12605-010
Twin.tec 384 real-time PCR plates Eppendorf AG 30132734

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References

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Evaluación del compromiso de objetivos celulares por inhibidores de la fosfatasa SHP2 (PTPN11)
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