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Cancer Research

SHP2 (PTPN11) द्वारा सेलुलर लक्ष्य सगाई का आकलन फॉस्फेट अवरोधक

Published: July 17, 2020 doi: 10.3791/61457
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Cancer Metabolism & Signaling Networks Program, NCI-Designated Cancer Center, Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute

Summary

अक्षुण्ण कोशिकाओं में उम्मीदवार अवरोधकों द्वारा लक्ष्य सगाई का आकलन करने की क्षमता दवा की खोज के लिए महत्वपूर्ण है । यह प्रोटोकॉल एक 384 अच्छी तरह से प्रारूप सेलुलर थर्मल शिफ्ट परख का वर्णन करता है जो विश्वसनीय रूप से जंगली प्रकार के SHP2 या इसके ऑन्कोजेनिक वेरिएंट को लक्षित करने वाले अवरोधकों के सेलुलर लक्ष्य सगाई का पता लगाता है।

Abstract

पीटीपीएन11 प्रोटो-ऑन्कोजीन द्वारा एन्कोडेड एसआरसी-होमोलॉजी 2 (एसएच 2) डोमेन युक्त फॉस्फेट 2 (एसएचपी2), रिसेप्टर टायरोसिन काइनेज (आरटीके) संचालित सेल सिग्नलिंग, सेल सर्वाइवल और प्रसार को बढ़ावा देने वाला एक प्रमुख मध्यस्थ है। इसके अलावा, SHP2 को बी और टी सेल सक्रियण को बाधित करने के लिए प्रतिरक्षा जांच बिंदु रिसेप्टर्स द्वारा भर्ती किया जाता है। Aberrant SHP2 समारोह के विकास, प्रगति, और कई कैंसर के मेटास्टेसिस में फंसाया गया है । दरअसल, छोटे अणु SHP2 अवरोधकों ने हाल ही में रास/आरएएफ/ईआरके मार्ग सक्रियण के साथ ठोस ट्यूमर के उपचार के लिए नैदानिक परीक्षणों में प्रवेश किया है, जिसमें कुछ ऑन्कोजेनिक रास म्यूटेशन के साथ ट्यूमर शामिल हैं । हालांकि, SHP2 अवरोधकों का वर्तमान वर्ग SHP2 ऑनकोजेनिक वेरिएंट के खिलाफ प्रभावी नहीं है जो ल्यूकेमिया में अक्सर होते हैं, और विशिष्ट छोटे अणुओं का विकास जो ऑन्कोजेनिक SHP2 को लक्षित करते हैं, वर्तमान अनुसंधान का विषय है। SHP2 जैसे साइटोसोलिक प्रोटीन से जुड़े अधिकांश दवा खोज अभियानों के साथ एक आम समस्या यह है कि प्राथमिक परख है कि ड्राइव रासायनिक खोज अक्सर विट्रो परख में है कि उंमीदवार यौगिकों के सेलुलर लक्ष्य सगाई की रिपोर्ट नहीं करते हैं । सेलुलर लक्ष्य सगाई को मापने के लिए एक मंच प्रदान करने के लिए, हम दोनों जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती SHP2 सेलुलर थर्मल शिफ्ट परख विकसित की है । ये परख मज़बूती से कोशिकाओं में SHP2 अवरोधकों के लक्ष्य सगाई का पता लगाने । यहां, हम इस परख का एक व्यापक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं, जो SHP2 अवरोधकों के मूल्यांकन और लक्षण वर्णन के लिए एक मूल्यवान उपकरण प्रदान करता है।

Introduction

1,2कोशिकाओं में सिग्नल ट्रांसडक्शन में टायरोसिन फॉस्फोरिलेशन महत्वपूर्ण भूमिकानिभाताहै । इस पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन को प्रोटीन टायरोसिन किनासेस (पीटीके) द्वारा उत्प्रेरित किया जाता है और प्रोटीन टायरोसिन फॉस्फेट (पीटीपीएस) द्वारा उलट जाता है। इसलिए , एबरंट पीटीके या पीटीपी कार्य से कई वंशानुगत या अधिग्रहीत मानव रोगहोतेहैं 3 ,4,5,,6. एसआरसी-होमोलॉजी 2 (एसएच 2) डोमेन युक्त फॉस्फेटे 2 (SHP2) एक व्यापक रूप से व्यक्त गैर-रिसेप्टर प्रकार पीटीपी प्रोटो-ऑन्कोजीन PTPN11 77 द्वारा इनकोडेड है और कई शारीरिक प्रक्रियाओं का एक प्रमुख नियामक है जिसमें रास/आरएएफ/ईआरके, PI3K/Akt, या जेएके/स्टेटिंग सिग्नल्समार्ग 88 केसक्रियण द्वारा सिग्नल ट्रांसडक्शन शामिल है । आम तौर पर, SHP2 गतिविधि को गुमराह संकेत को रोकने के लिए कसकर विनियमित किया जाता है। बेसल स्थितियों के तहत SHP2 को इसके एन-टर्मिनल एसएच 2 डोमेन द्वारा ऑटोइनहिबिट किया जाता है, जो उत्प्रेरक फॉस्फेट डोमेन(चित्रा 1A)9,,10के भीतर सक्रिय साइट तक पहुंच को अवरुद्ध करता है। सेल एक्टिवेशन पर, टायरोसिन फॉस्फोरिलेटेड बाइंडिंग प्रोटीन SHP2 की भर्ती करते हैं, जिससे यह अपनी सक्रिय संरचना को अपनाता है, जिसमें सक्रिय साइट अब अपने सब्सट्रेट्स के लिए सुलभ है। कई कैंसर में SHP2 गतिविधि ऊंचा है। पीटीपीएन11 में दैहिक लाभ-कार्य (जीओएफ) म्यूटेशन की पहचान मुख्य रूप से ल्यूकेमिया में की गई है और एन-एसएच 2 डोमेन को फॉस्फेट डोमेन में बाध्यकारी होने से रोकती है, जिसके परिणामस्वरूप 11 सक्रिय SHP2(चित्रा 1B)11का गठन किया गया है। PTPN11 में जर्मलाइन GOF उत्परिवर्तन नोआन सिंड्रोम के ~ 50% मामलों के लिए जिम्मेदार हैं,द्रोह 12के बढ़ते जोखिम के साथ एक विकासात्मक विकार। ठोस ट्यूमर में, जहां PTPN11 उत्परिवर्तन दुर्लभ हैं, फॉस्फोरिलेटेड बाध्यकारी प्रोटीन के अधिक से अधिक स्तर बढ़ाया SHP2 गतिविधि(चित्रा 1C)के लिए नेतृत्व करते हैं । एसएचपी2 प्रतिरक्षा चेकपॉइंट सिग्नलिंग के लिए भी महत्वपूर्ण है, क्योंकि चेकपॉइंट रिसेप्टर्स जैसे बीटीएलए या पीडी-1 भर्ती एसएचपी 2 प्रमुख सिग्नलिंग अणुओं को डीफोस्फोरलेट करने के लिए, प्रतिरक्षा कोशिका सक्रियण13,14,,15को रोकता है।,

छोटे अणुओं के साथ पीटीपीएस को लक्षित करना एक चुनौती रही है, क्योंकि पीटीपीएस की सक्रिय साइट अत्यधिक संरक्षित और अत्यधिक आवेशित है; सक्रिय स्थल को लक्षित करने वाले अवरोधक अक्सर शक्तिशाली होते हैं, लेकिन खराब चयनशीलता और मौखिक जैव उपलब्धता16, 17,,18,,19,18,20,,,21, 22,प्रदर्शित करतेहैं। दरअसल, कई रिपोर्ट SHP2 अवरोधक गरीब चयनता और कोशिकाओं में प्रभावकारिता की कमी सेपीड़ित 23। हाल ही में, अच्छी शक्ति और उत्कृष्ट चयनशीलता के साथ एसएचपी 2 के एलोस्टेरिक अवरोधकों की सूचना दी गई है (उदाहरण के लिए, एसएचपी0924 और आरएमसी-455025)और एसएचपी 2 अवरोधकों में नए सिरे से रुचि छिड़ गई है। SHP099 और आरएमसी-4550 पर आधारित यौगिक वर्तमान में रिसेप्टर टायरोसिन काइनेज (आरटीके) पाथवे एक्टिवेशन26, 27,27के साथ ठोस ट्यूमर के इलाज के लिए चरण I नैदानिक परीक्षणों में हैं। ग्राउंडब्रेकिंग करते समय, ये यौगिक कई एसएचपी 2 ऑन्कोजेनिक म्यूटेंट के मुकाबले अप्रभावी हैं जो रक्त कैंसर के रोगियों की एक महत्वपूर्ण संख्या में ल्यूकेमोजेनेसिस ड्राइव करते हैं28,29,,30., SHP2 oncogenic वेरिएंट की ओर SHP099 जैसे यौगिकों की शक्ति की यह कमी उनके अद्वितीय एलोस्टेरिक तंत्र से उपजी है, क्योंकि वे निष्क्रिय, बंद संरचना को बाध्यकारी और स्थिर करके SHP2 गतिविधि को रोकते हैं, जो SHP2 म्यूटेंट में बाधित होता है। इसके अलावा, हाल ही में एक रिपोर्ट31के आधार पर, SHP099-जैसे अवरोधकों के साथ इलाज रोगियों में अनुकूली प्रतिरोध तंत्र काफी बोधगम्य हैं । नतीजतन, अगली पीढ़ी के SHP2 अवरोधकों का विकास जो इसके सक्रिय, खुले राज्य को लक्षित करता है, गहन अनुसंधान का विषय है ।

कोशिकाओं में उपन्यास SHP2 अवरोधकों का लक्षण वर्णन नेतृत्व अनुकूलन प्रक्रिया का एक अनिवार्य पहलू है। शारीरिक परिस्थितियों में अवरोधक का गंभीर रूप से, सिद्ध लक्ष्य सगाई आत्मविश्वास का एक अतिरिक्त स्तर प्रदान करती है कि औषधीय रसायन शास्त्र के लिए संसाधनों को कुशल रूप से आशाजनक सेलुलर प्रभावकारिता के साथ यौगिकों पर तैनात किया जाता है। अतीत में, अपने लक्ष्यों के लिए छोटे अणु अवरोधकों के बंधन का आकलन करने के लिए कई तरीके विकसित किए गए हैं, मुख्य रूप से प्रोटीन किनासेस32के लिए। एक SHP2 सेलुलर लक्ष्य सगाई परख विकसित करने के लिए, हम एक सेलुलर थर्मल शिफ्ट परख३३का उपयोग किया । यह परख, प्रोटीन34के लिए इन विट्रो थर्मल शिफ्ट (पीटीएस) परख के समान, लक्ष्य प्रोटीन थर्मल स्थिरता पर नज़र रखता है, जिसे आमतौर पर छोटे अणुओं के बाध्यकारी द्वारा बदल दिया जाता है। मूल परख एक कम थ्रूपुट परख है जो लक्षित प्रोटीन के स्तर की मात्रा निर्धारित करने के लिए एंटीबॉडी का उपयोग करती है। वैकल्पिक रूप से, हमने थर्मल शिफ्ट परख का हाल ही में सूचित संस्करण चुना जो β-गैलेक्टोसिडेस एंजाइम खंड पूरक (ईएफसी) परख(चित्रा 2)35का उपयोग करता है। इन प्रयोगों के लिए, ब्याज का प्रोटीन कोशिकाओं में एन-या सी-टर्मिनल फ्यूजन प्रोटीन के रूप में व्यक्त किया जाता है जिसमें एक उन्नत प्रोलेबल टैग (ईपीएल, β-गैलेक्टोसिडेस का 42 अमीनो एसिड टुकड़ा) होता है। कोशिकाओं को तब 384-अच्छी तरह से पीसीआर संगत प्लेटों में स्थानांतरित किया जाता है और ब्याज के यौगिकों के साथ इनक्यूबेटेड किया जाता है। एक थर्मोसाइकिलर का उपयोग कोशिकाओं के लिए तापमान ढाल लागू करने के लिए किया जाता है, जिसका प्रोटीन उनकी थर्मल स्थिरता के आधार पर तापमान में वृद्धि के रूप में विकृत और समग्र होगा। एक उम्मीदवार यौगिक की रुचि के प्रोटीन को बांधने और स्थिर करने की क्षमता के परिणामस्वरूप उस प्रोटीन की थर्मल स्थिरता में वृद्धि होगी। इसलिए, कोशिकाओं के लाइसिस के बाद, उन टैग प्रोटीन है कि एक उंमीदवार परिसर द्वारा स्थिर किया गया है वाहन नियंत्रण के साथ इनक्यूबेटेड कोशिकाओं के टैग प्रोटीन की तुलना में उच्च तापमान पर समाधान में रहेगा । रिपोर्टर एंजाइम स्वीकारकर्ता (ईए) घुलनशील ईपीएल-टैग किए गए प्रोटीन को पूरक करने में सक्षम है, जिसके परिणामस्वरूप ल्यूमिनेसेंस सब्सट्रेट का उपयोग करके पता लगाने योग्य β-गैलेक्टोसिडेस गतिविधि होती है।

हमने हाल ही में एक लघुकृत 384-वेल प्रारूप36में जंगली-प्रकार SHP2 (SHP2-WT) और लगातार SHP2 oncogenic संस्करण (SHP2-E76K) के लिए एक मजबूत सेलुलर थर्मल शिफ्ट परख विकसित की है। यहां, हम इस परख के एक विस्तृत प्रोटोकॉल की रिपोर्ट करते हैं, जो कोशिकाओं में SHP2 अवरोधकों द्वारा लक्ष्य सगाई का मज़बूती से पता लगाता है और अवरोधक शक्ति और सेलुलर थर्मल शिफ्ट डेटा के बीच उच्च स्तर के सहसंबंध को दर्शाता है। सामान्य परख कार्यप्रवाह चित्र 3में दर्शाया गया है । हमारा प्लेटफ़ॉर्म एन-टर्मिनल टैग पूर्ण लंबाई ईपीएल-SHP2 फ्यूजन प्रोटीन का उपयोग करता है। इसी पीआईसीपी-ईपीएल-एन-एसएचपी2-डब्ल्यूटीई और पीआईसीपी-ईपीएल-एन-एसएचपी2-ई76के एक्सप्रेशन प्लाज्मिड्स की पीढ़ी के लिए कृपया हमारे हालिया प्रकाशन36का उल्लेख करें। इस परख SHP2 थर्मल प्रोफाइल स्थापित करने और उपस्थिति या अवरोधक की अनुपस्थिति में SHP2 पिघलने तापमान निर्धारित करने के लिए एक थर्मल ढाल का उपयोग किया जा सकता है । एक बार थर्मल प्रोफाइल स्थापित हो जाने के बाद, इसे आइसोथेरल परिस्थितियों में भी किया जा सकता है, जिससे अवरोधक खुराक-प्रतिक्रिया मूल्यांकन की अनुमति मिल सकती है। दोनों प्रकार के प्रयोग नीचे वर्णित हैं।

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Protocol

1. सेल कल्चर और रिएजेंट्स की तैयारी

  1. 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, 1x एंटीबायोटिक/एंटीमायोटिक, 20 mM HEPES, और 1 मीटर सोडियम पायरुवेट के साथ विकास मीडिया की एक 500 मिलीएल बोतल तैयार करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. जमे हुए मूल स्टॉक बोतलों से गल सेलुलर थर्मल शिफ्ट रिएजेंट्स (ईए रिएजेंट, लाइसिस बफर और सब्सट्रेट) ।
  3. 2 एमएल एलिकोट्स के रूप में रिएजेंट्स और बफर को बांटें और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: प्रजनन क्षमता के लिए फ्रीज/गल से बचें और केवल परख प्रक्रिया के लिए आवश्यक अभिकर्मक की मात्रा का उपयोग करें ।

2. एचईके 293T कोशिकाओं का विकास और रखरखाव

  1. क्रायो स्टोरेज से कम मार्ग अनुयायी HEK293T कोशिकाएं प्राप्त करें।
  2. 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2पर विकास मीडिया में HEK293T कोशिकाओं को बनाए रखें।
  3. 1:14 अनुपात में हर 4 दिनों में कोशिकाओं को विभाजित करें।
    नोट: सर्वश्रेष्ठ प्रदर्शन के लिए, HEK293T कोशिकाओं को 25 से अधिक बार पारित करने की अनुमति नहीं है ।

3. क्षणिक ट्रांसफेक्शन के लिए HEK293T सेल तैयारी

  1. अलग HEK293T कोशिकाओं से 16 एमएल प्लेटों से सेल टुकड़ी अभिवाक के 3 एमएल का उपयोग कर।
  2. विकास मीडिया के 12 एमसीएल के साथ तनु। 4 मिनट के लिए 1,400 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र द्वारा कोशिकाओं को ले लीजिए।
  3. 10 एमएल ग्रोथ मीडिया में पैलेट को रिसेल करें। ट्राइपैन ब्लू और सेल काउंटर का उपयोग करके कोशिकाओं की एकाग्रता और व्यवहार्यता को मापें।
  4. प्लेट 7.0 x 105 तेजी से बढ़ रही HEK293T कोशिकाओं को अच्छी तरह से एक 6 अच्छी तरह से सेल संस्कृति प्लेट में ट्रांसफैक्शन से पहले लगभग 24 घंटे।
    नोट: प्रत्येक प्लाज्मिड को संक्रमित होने के लिए एक अच्छी तरह से आरक्षित करें।
  5. 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए इनक्यूबेट, 5% सीओ2.

4. HEK293T कोशिकाओं का ट्रांसफैक्शन

  1. पीआईसीपी-ईपीएल-एन-एसएचपी 2-डब्ल्यूटी या पीआईसीपी-ईपीएल-एन-एसएचपी2-ई76के (~ 200 एनजी/माइक्रोएल) के शुद्ध प्लाज्मिड स्टॉक से 200 माइक्रोन में प्लाज्मिड डीएनए का 2 माइक्रोन पतला ट्रांसफेक्शन बफर।
  2. 4 मिनट के लिए 10 एस और 1,400 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र के लिए भंवर।
  3. पतला डीएनए के लिए ट्रांसफैक्शन रिएजेंट के 4 माइक्रोन जोड़ें। 4 मिनट के लिए 10 एस और 1,400 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र के लिए भंवर।
  4. 10 मिनट के लिए 23 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
  5. इनक्यूबेटर से बढ़ती HEK293T कोशिकाओं युक्त 6 अच्छी तरह से प्लेट निकालें। 6-वेल प्लेट में संलग्न कोशिकाओं में ट्रांसफेक्शन मिश्रण जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए इनक्यूबेट, 5% सीओ2.

5. परख प्लेटों की तैयारी

  1. यौगिकों के डीएमएसओ में 10 एमएम स्टॉक समाधान तैयार करें, जिसका परीक्षण किया जाए।
  2. तत्काल उपयोग के लिए 384-अच्छी तरह से कम मृत मात्रा स्रोत प्लेट में अवरोधक समाधान वितरित करें।
  3. ०.५% से कम DMSO (v/v) के लक्ष्य अंतिम मात्रा में ३८४-अच्छी तरह से वास्तविक समय पीसीआर प्लेटों में एक तरल हैंडलर का उपयोग कर अवरोधकों या वाहन (DMSO) की वांछित मात्रा हाजिर । अक्रिय गैस मिटाने के साथ प्लेट सीलर का उपयोग करके प्लेट को सील करें।
    नोट: अवरोधक खुराक-प्रतिक्रिया परख के लिए, तदनुसार डीएमएसओ को बैकफिल करना सुनिश्चित करें ताकि प्रत्येक अवरोधक एकाग्रता के लिए डीएमएसओ की समान मात्रा का उपयोग किया जा सके। सर्वोत्तम परिणामों के लिए, 23 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटों को स्टोर करें और 24 घंटे के भीतर प्लेटों का उपयोग करें।

6. संक्रमित सेल टुकड़ी और तैयारी

  1. 37 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में प्रीइनक्यूबेट ग्रोथ मीडिया और सेल टुकड़ी रिएजेंट। इनक्यूबेटर से संक्रमित कोशिकाओं को हटा दें। धीरे से थाली के कुओं से मीडिया आकांक्षी ।
    नोट: हर अच्छी तरह से एक अलग संक्रमित प्लाज्मिड शामिल है कि हर अच्छी तरह से के लिए एक नए एस्पिएरेटर का उपयोग करें ।
  2. सेल टुकड़ी रिएजेंट का 0.3 एमएल जोड़ें। थाली की सतह को अच्छी तरह से नीचे कवर करने के लिए प्लेट को धीरे-धीरे आगे-पीछे रॉक करें। 2 मिनट के लिए 23 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
  3. प्रत्येक अच्छी तरह से विकास मीडिया के 1 एमएल जोड़ें। धीरे-धीरे मीडिया और कोशिकाओं को कुएं में पिपेट करें और 15 एमएल फाल्कन सेंट्रलाइज ट्यूब में स्थानांतरित करें। 4 मिनट के लिए 1,400 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र द्वारा कोशिकाओं को ले लीजिए।
  4. धीरे से लेकिन अच्छी तरह से मीडिया से आकांक्षी ।
    नोट: सेल टुकड़ी रिएजेंट में अवशिष्ट फेनोल लाल परख में हस्तक्षेप कर सकते हैं।
  5. ध्यान से विकास मीडिया के 2 एमएल में सेल गोली resuspend। ट्राइपैन ब्लू और सेल काउंटर का उपयोग करके कोशिकाओं की एकाग्रता और व्यवहार्यता को मापें।
    नोट: सर्वश्रेष्ठ परिणामों के लिए सेल व्यवहार्यता और 90% होनी चाहिए।
  6. कोशिकाओं को 125 कोशिकाओं/μL की एकाग्रता के लिए पतला करें। उदाहरण के लिए, एक 5 μL परख के लिए यह ~ 625 कोशिकाओं/ इष्टतम व्यवहार्यता के लिए कोशिकाओं को 2 घंटे से अधिक समय तक निलंबित नहीं रखें।

7. SHP2 अवरोधकों के साथ कोशिकाओं की इनक्यूबेशन

  1. कोशिकाओं को बाँझ एकल चैनल समाधान गर्त में बांटें।
  2. सेंट्रलाइज 384-अच्छी तरह से वास्तविक समय पीसीआर प्लेट जिसे SHP2 अवरोधक जमाव द्वारा 23 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 2,500 x ग्राम पर पहले से तैयार किया गया है।
  3. कंपाउंड प्लेट से सील हटा दें। 125 माइक्रोन मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके, वांछित कुओं में पतला कोशिकाओं के 5 माइक्रोन जोड़ें।
  4. प्लेट पर ढक्कन के बिना 30 एस के लिए 42 x ग्राम पर प्लेट को सेंट्रलाइज करें। प्लेट के नीचे घूमती है और 37 डिग्री सेल्सियस पर परख प्लेट को इनक्यूबेट करने के बाद प्लेट में ढक्कन सील संलग्न करें, 1 घंटे के लिए 5% सीओ2।

8. केमिल्यूमिनेसेंट रिएजेंट मास्टर मिक्स की तैयारी

  1. प्लेटिंग कोशिकाओं के बाद -20 डिग्री सेल्सियस भंडारण से डिटेक्शन रिएजेंट (ईए रिएजेंट, लाइसिस बफर और सब्सट्रेट) की आवश्यक मात्रा निकालें। 23 डिग्री सेल्सियस पर गल रिएजेंट्स।
    नोट: हस्तांतरण में सुविधा के लिए, एक मात्रा तैयार करें जो प्लेट में जमा की गई कोशिकाओं की कुल मात्रा 1.5x है। उपयोग के बाद रिएजेंट्स का पुन: उपयोग न करें।
  2. कंडीशन ईए-10 का उपयोग करके रिएजेंट्स का मास्टर मिश्रण तैयार करें, जिसमें घटक और मात्रा अंश इस प्रकार होते हैं: ईए रिएजेंट (0.17), लाइसिस बफर (0.17), सब्सट्रेट (0.67)।
    नोट: रिएजेंट अनुपात आपूर्तिकर्ता के मैनुअल में निर्दिष्ट अनुकूलन प्रयोगों पर आधारित होते हैं।

9. इसोथर्मल या थर्मल प्रोफाइल ढाल गर्मी पल्स

  1. हीट पल्स की डिलीवरी के लिए रेडिएंट सक्षम थर्मोसाइकिलर प्रोग्राम करें।
    1. थर्मल प्रोफाइल ढाल प्रयोगों के लिए, निम्नलिखित उदाहरण विनिर्देशों के साथ थर्मोसाइकिलर को प्रीप्रोग्राम करें:
    2. हीट पल्स: 3 मिनट वांछित पिघलने का तापमान (ऊर्ध्वाधर या क्षैतिज ढाल +/-15 डिग्री सेल्सियस; उदाहरण 24 कुओं में फैले 38-68 डिग्री सेल्सियस 1.25 डिग्री सेल्सियस की तापमान वृद्धि होती है)।
  2. संतुलन वसूली कदम: रैंप गति के साथ 3 मिनट 20 डिग्री सेल्सियस = 1 डिग्री सेल्सियस/
    1. इसोथर्मल प्रयोगों के लिए इस प्रकार स्थापित प्रोटोकॉल स्थापित किया गया है:
    2. हीट पल्स: 3 मिनट 55 डिग्री सेल्सियस। संतुलन वसूली कदम: रैंप गति के साथ 3 मिनट 20 डिग्री सेल्सियस = 1 डिग्री सेल्सियस /
      नोट: बढ़ी हुई प्रजनन क्षमता के लिए, क्योंकि थर्मोसाइकिलर अपने वांछित तापमान तक पहुंचने के समय प्लेट को ठीक से रखने के लिए मुश्किल हो सकता है, 3 मिनट पल्स की शुरुआत से पहले 15 एस नीचे गिनने के लिए कार्यक्रम स्थापित करें। इस प्रयोग में उपयोग किए जाने वाले थर्मोसाइकिलर के लिए सामग्री की तालिकादेखें, गर्मी नाड़ी के दौरान ढक्कन को रखा जाता है।

10. लाइसिस डिटेक्शन एंड मेजरमेंट

  1. एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके विश्लेषण करने के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से समान मात्रा (5 माइक्रोल) के अलावा लाइसिस डिटेक्शन मास्टर मिक्स के साथ परख प्लेटों को पूरक करें।
  2. 30 एस के लिए प्लेट 42 x ग्राम सेंट्रलाइज करें। 30-60 मिनट के लिए अंधेरे में 23 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  3. 384-अच्छी तरह से प्रारूप में ल्यूमिनेसेंस का पता लगाने में सक्षम माइक्रोप्लेट रीडर का उपयोग करके रसायनीयता को मापें। प्लेट प्रकार और एकीकरण समय अनुकूलित (एकीकरण समय 1000 एमएस, निपटान समय 0 एस) के साथ चमक माप करें। मूल्यों को आगे के विश्लेषण के लिए गिनती/एस और आउटपुट के रूप में मापें ।

11. डेटा विश्लेषण

  1. एक वैज्ञानिक 2D रेखांकन और सांख्यिकी सॉफ्टवेयर का उपयोग कर ल्यूमिनेसेंस डेटा का विश्लेषण करें।
  2. नॉनलाइनर प्रतिगमन और बोल्ट्ज़मैन सिग्मोइडल मॉडल का उपयोग करके सामान्यीकृत ल्यूमिनेसेंस डेटा (वाहन नियंत्रण के लिए सामान्यीकृत) का विश्लेषण करके थर्मल प्रोफाइल उत्पन्न करें।
    नोट: थर्मल प्रोफाइल प्रयोगों में, गणना वी50,तापमान जो वक्र के नीचे और शीर्ष के बीच आधा बिंदु है, SHP2 के पिघलने के तापमान को परिभाषित करता है। आइसोथर्मल प्रयोगों में, ईसी50 अवरोधक की एकाग्रता को परिभाषित करता है जो अर्ध-अधिकतम प्रतिक्रिया देता है।

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Representative Results

SHP2-WT के लिए थर्मल ढाल प्रयोग के परिणामस्वरूप एक संकीर्ण पिघलने संक्रमण के साथ एक सिग्मॉयडल सेलुलर थर्मल प्रोफाइल हुआ जो एक मुड़ा हुआ प्रोटीन(चित्र 4 ए)के लिए विशिष्ट और सुसंगत है। SHP2 में तीन स्वतंत्र डोमेन होते हैं: दो एसएच 2 डोमेन और उत्प्रेरक डोमेन(चित्र 1)। ऑटोइनहिबिटेड बंद संरचना में ये डोमेन स्वयं-सहयोगी; थर्मल प्रोफाइल प्रयोग में देखा गया पिघलने वाला संक्रमण संभवतः कोशिका में इस स्थिति को प्रतिबिंबित करता है। 10 माइक्रोनएम में एलोस्टेरिक अवरोधक एसएचपी099 के साथ एसएचपी 2-डब्ल्यूटी के इनक्यूबेशन ने SHP2-WT थर्मल प्रोफाइल को एक महत्वपूर्ण और औसत दर्जे की डिग्री(चित्रा 4A)में स्थिर कर दिया। यह SHP099-जैसे अवरोधकों के ज्ञात बाध्यकारी मोड को प्रतिबिंबित करता है जो नियामक बाध्यकारी एसएच 2 डोमेन और उत्प्रेरक उपइकाइक के बीच "आणविक गोंद"37 के रूप में कार्य करते हैं। महत्वपूर्ण बात, हमारे सेलुलर थर्मल शिफ्ट परख की पुष्टि की है कि SHP099 सेल घुसना और लेबल SHP2-WT के लिए बाध्य कर सकते हैं । SHP2 का स्थिरीकरण भी SHP099 की शक्ति के साथ ट्रैक-जैसे एलोस्टेरिक यौगिकों। 10 माइक्रोनएम पर, अधिक शक्तिशाली आरएमसी-4550 (रिपोर्टआईसी 50 = 0.6 एनएम) ने एसएचपी 2-डब्ल्यूटीटी(चित्रा 4B)के लिए SHP099 (रिपोर्टआईसी 50 = 70 एनएम) की तुलना में अधिक मात्रा में स्थिरीकरण का उत्पादन किया।

हम ऑन्कोजेनिक उत्परिवर्ती SHP2-E76K(चित्रा 4C)के साथ लक्ष्य सगाई परख के थर्मल प्रोफ़ाइल में एक अलग व्यवहार का निरीक्षण करते हैं। SHP2-E76K के लिए थर्मल प्रोफाइल में एक पिघलने वाला संक्रमण है जो कम संकीर्ण है, जो E76K उत्परिवर्तन द्वारा SHP2 की तृतीयक संरचना पर प्रदान किए गए अस्थिरता को दर्शाता है, जो SH2 डोमेन और उत्प्रेरक सबयूनिट के बीच बातचीत को बाधित करने के लिए जाना जाता है। इसलिए डब्ल्यूटी प्रोटीन की तुलना में मनाया गया पिघलने का तापमान कम हो गया। महत्वपूर्ण बात यह है कि जब 10 माइक्रोन में एलोस्टेरिक अवरोधक एसएचपी099 के साथ इनक्यूबेटेड किया गया, तो एसएचपी099 के ज्ञात गुणों और इसी तरह के अवरोधक28,29,,30के अनुरूप केवल सीमांत थर्मल स्थिरीकरण देखा गया।,

जांच की जाने वाली ईपीएल-टैग किए गए प्रोटीन के अभिव्यक्ति स्तर को नाटकीय रूप से सिग्नल तीव्रता को प्रभावित कर सकते हैं। दिखाया गया(चित्रा 4D)समान परख स्थितियों के तहत क्षणिक और स्थिर एकीकृत SHP2-WT कोशिकाओं के लिए थर्मल प्रोफाइल हैं। इन असमान घटता का सामान्यीकरण तुलनीय थर्मल प्रोफाइल(चित्रा 4E)प्रदान करता है, जो ईएफसी डिटेक्शन सिस्टम की विस्तृत श्रृंखला का संकेत देता है। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि हमने तुलनीय परिणामों के साथ कोशिकाओं को व्यक्त करते हुए क्षणिक ट्रांसफेक्शन और स्थिर एकीकरण SHP2 दोनों को नियोजित किया है । स्थिर सेल लाइनों की पीढ़ी के लिए यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि HEK293T कोशिकाओं के बजाय HEK293 कोशिकाओं का उपयोग किया जाना चाहिए, क्योंकि HEK293T कोशिकाओं में पहले से ही एक नियोमाइसिन प्रतिरोध मार्कर है जो एकीकृत पीआईसीपी-ईपीएल-एन-एसएचपी 2 प्लाज्मिड के साथ कोशिकाओं के चयन को रोकेगा, जिसमें स्तनधारी कोशिकाओं में चयन के लिए एक नियोमाइसिन/कानामीसिन प्रतिरोध जीन शामिल है।

अवरोधक खुराक-प्रतिक्रिया माप प्राप्त करने के लिए, कोई भी आइसोथर्मल स्थितियों के तहत कोशिकाओं पर यौगिक टिटरेशन कर सकता है। ऐसा करने के लिए, हम पहले इन मापों के लिए तापमान इष्टतम निर्धारित करने का सुझाव देते हैं। थर्मोसाइकिलर की क्षमता का लाभ उठाते हुए 384-अच्छी प्लेट की "छोटी" धुरी पर थर्मल ग्रेडिएंट का उत्पादन करने के लिए, एक प्लेट पर आइसोथर्मल टिटरेशन की एक श्रृंखला की जा सकती है। चित्रा 5A आरएमसी-4550 की सीमित पांच सूत्री खुराक-प्रतिक्रिया का उपयोग करके SHP2-WT के लिए इस अनुकूलन के प्रतिनिधि परिणाम दिखाता है। तापमान जो प्रोटीन को विकृत करने के लिए बहुत कम थे, ने एक उच्च संकेत का उत्पादन किया जो दवा से स्वतंत्र था। इसी तरह, तापमान है कि बहुत अधिक थे यौगिक के लिए कम क्षमता खर्च करने के लिए प्रोटीन को स्थिर । हालांकि, एक इष्टतम तापमान पर, जैसा कि इस प्रयोग द्वारा निर्धारित किया गया है, एक आइसोथर्मल टिटरेशन ने पूर्ण 10-पॉइंट खुराक-प्रतिक्रिया का उपयोग करतेहुए आरएमसी-4550 (चित्रा 5B)के लिए एक उपयोगी ईसी 50 उत्पीठित किया। यहां दिखाए गए प्रतिनिधि डेटा के अलावा, हमने यह निर्धारित किया है कि अनुकूलित आइसोथर्मल स्थितियों का उपयोग करने वाले प्रयोगों को सेल झिल्ली को पार करने और कोशिकाओं में अपने लक्ष्य को शामिल करने की क्षमता के लिए उपन्यास SHP2 अवरोधकों को कुशलतापूर्वक स्क्रीन करने के लिएनियोजितकिया जा सकता है।

Figure 1
चित्रा 1: SHP2 गतिविधि का विनियमन।
(A)SHP2 गतिविधि को सामान्य कोशिकाओं में कसकर विनियमित किया जाता है। बेसल स्थितियों के तहत, इसका एन-टर्मिनल एसएच 2 डोमेन फॉस्फेट (पीटीपी) डोमेन के भीतर सक्रिय साइट को ऑक्ल्यूड करता है, जिसके परिणामस्वरूप ऑटोइंभितियन होता है। आरटीके विकास कारक और साइटोकिन उत्तेजना एडाप्टर प्रोटीन के टायरोसिन फॉस्फोरिलेशन की ओर ले जाती है, जो तब SH2 डोमेन से बांधती है, जिससे एक अनुरूप परिवर्तन होता है जिससे SHP2 सक्रिय साइट अपने सब्सट्रेट्स के लिए सुलभ हो जाती है। (ख)दैहिक SHP2 उत्परिवर्तन, अक्सर ल्यूकेमिया में पाया जाता है, एन-एसएच 2 और फॉस्फेट डोमेन के बीच इंटरफेस पर स्थित हैं और SHP2 को बंद, ऑटोइनहिबिट संरचना को अपनाने से रोकते हैं, जिसके परिणामस्वरूप एक संविलियन सक्रिय फॉस्फेट होता है। (ग)ठोस ट्यूमर में, विकास कारकों, आरटीके, या मचान एडाप्टर के प्रवर्धन या अतिव्यक्तता के परिणामस्वरूप एसएचपी 2 की गुमराह सक्रियता होती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: SHP2 सेलुलर थर्मल शिफ्ट सिद्धांतों।
हमारे सेलुलर लक्ष्य सगाई परख एक β-galactosidase (β-लड़की) एंजाइम खंड पूरक (ईएफसी) परख पर आधारित है । कोशिकाओं (HEK293T), एक ईपीएल संलयन टैग (β-लड़की के ४२ अमीनो एसिड टुकड़ा) के साथ पूर्ण लंबाई SHP2 व्यक्त, एक जांच यौगिक के साथ इलाज कर रहे है और एक छोटी गर्मी पल्स के अधीन है कि SHP2 denature और दुर्गम अघुलनशील समुच्चय के रूप में, ePL टैग दुर्गम प्रतिपादन के अधीन हैं । SHP2 के लिए जांच यौगिक के विशिष्ट बाध्यकारी अपनी थर्मल स्थिरता को बढ़ा सकते हैं । थर्मल स्थिरीकरण रिपोर्टर एंजाइम केमिल्यूमिनेसेकेंस सिस्टम में पूरकता के लिए ईपीएल टैग के साथ अधिक घुलनशील लक्ष्य प्रोटीन प्रदान करता है। समुच्चय परिणामस्वरूप कम पूरकता और ल्यूमिनेसेंस होता है। इस आंकड़े को रेफरी36से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: लघुकृत SHP2 उपकरण वर्कफ्लो।
परख का नियमित प्रदर्शन इंगित उपकरणों का उपयोग करता है। परख प्लेटें एक ध्वनिक तरल हैंडलर का उपयोग करके तैयार की जाती हैं जो यौगिकों की नैनोलिटर मात्रा बचाती है। सेल ट्रांसफर मैन्युअल रूप से किया जा सकता है, मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके, या स्वचालित तरल डिस्पेंसर का उपयोग करके। हीट पल्स डेनैचेशन एक थर्मोसाइकिलर का उपयोग करता है जो थर्मल ग्रेडिएंट्स को 384-वेल प्लेट में वितरित कर सकता है। एक माइक्रोप्लेट रीडर का उपयोग β-लड़की ईएफसी परख के बारे में पता लगाने के लिए किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: SHP2-WT और SHP2-E76K प्रोटीन के साथ एलोस्टेरिक SHP2 अवरोधकों की सेलुलर लक्ष्य सगाई ।
(क)वाहन (डीएमएसओ, लाल) की उपस्थिति में एसएचपी 2-डब्ल्यूटी प्रोटीन ने ऑटोइनहिबिट्ड राज्य में एक मुड़ा हुआ प्रोटीन के अनुरूप संकीर्ण पिघलने वाले संक्रमण के साथ एक अच्छी तरह से व्यवहार किए जाने वाले सेलुलर थर्मल प्रोफाइल का उत्पादन किया । SHP2-WT के इनक्यूबेशन 10 μM SHP099 के साथ कोशिकाओं को व्यक्त करने के लिए बाध्य राज्य (नीले) में प्रोटीन स्थिर । (ख)SHP2-WT के सेलुलर लक्ष्य सगाई थर्मल प्रोफाइल अनुपस्थिति (लाल) या SHP099 की उपस्थिति की तरह एलोस्टेरिक अवरोधक आरएमसी-४५५० (10 μM, नीला) । आरएमसी-4550 ने एसएचपी099 के लिए मनाए गए SHP2-WT के बढ़ी हुई सेलुलर स्थिरीकरण का उत्पादन किया। यह अपनी अधिक जैव रासायनिक शक्ति के साथ लक्ष्य सगाई पटरियों में वृद्धि हुई है। (ग)SHP2-E76K उत्परिवर्ती एक कम स्पष्ट पिघलने एक राज्य है कि मोटे तौर पर "खुला" सक्रिय रूप (लाल) में है के अनुरूप वक्र था । SHP099 पर 10 μM केवल मामूली SHP2-E76K पिघलने के तापमान (नीला), जो जैव रासायनिक निषेध और सेलुलर प्रभावकारिता डेटा के साथ समझौते में है वृद्धि हुई है । (घ)मनाया गया रसायनिनी संकेत ईपीएल-एसएचपी2 के अभिव्यक्ति स्तर से मेल खाता है। क्षणिक रूप से संक्रमित HEK293T कोशिकाओं की तुलना में, HEK293 कोशिकाओं जिसमें ईपीएल टैग SHP2-WT को जीनोम में स्थिर रूप से एकीकृत किया गया था, ईपीएल-SHP2 अभिव्यक्ति का स्तर कम था। नतीजतन, कच्चे अविमान केमिल्यूमिनेसेंस थर्मल प्रोफाइल ने क्षणिक रूप से संक्रमित HEK293 कोशिकाओं (लाल) की तुलना में हेक 293 कोशिकाओं (नीला) को व्यक्त करने के लिए बहुत कम ल्यूमिनेसेंस सिग्नल दिखाया। ई) स्थिर (HEK293) के लिए कच्चे रसायनीकरण डेटा के सामान्यीकरण और क्षणिक रूप से संक्रमित (HEK293T) ने माप की संवेदनशीलता को दिखाते हुए तुलनीय थर्मल प्रोफाइल का उत्पादन किया। डेटा अंक और त्रुटि सलाखों (±एसडी) डुप्लिकेट माप का प्रतिनिधित्व करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: SHP2-WT के लिए सेलुलर लक्ष्य सगाई isothermal खुराक-प्रतिक्रिया परख ।
(क)SHP2 अवरोधकों की खुराक पर निर्भर लक्ष्य सगाई का मूल्यांकन करने के लिए इष्टतम आइसोथर्मल स्थितियां स्थापित करने के लिए, 384-अच्छी प्लेट की छोटी धुरी में एक थर्मल ढाल पहले किया जाता है। यह इष्टतम तापमान की पहचान करने के लिए अवरोधकों (आरएमसी-4550; 0.08-10 माइक्रोन) के पांच सूत्री खुराक-प्रतिक्रियाओं के कुशल मूल्यांकन की अनुमति देता है। (ख)56 डिग्री सेल्सियस के इष्टतम तापमान पर आरएमसी-4550 के लिए एक पूर्ण सेलुलर आइसोथर्मल डोज-रिस्पांस (10-पॉइंट) । इस तापमान पर ईसी50 दर्शाया गया है। डेटा अंक और त्रुटि सलाखों (± एसडी) चौगुनी माप का प्रतिनिधित्व करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

हमने एक लक्ष्य सगाई परख प्रस्तुत की है जो कोशिकाओं में SHP2 फॉस्फेटे के लिए छोटे अणुओं के प्रत्यक्ष बाध्यकारी की पुष्टि कर सकती है । परख कम और उच्च आत्मीयता अवरोधकों के बीच भेदभाव कर सकते हैं और, महत्वपूर्ण बात, SHP099 के एलोस्टेरिक अवरोधकों द्वारा शक्ति की कमी की पुष्टि-GOF oncogenic SHP2-E76K उत्परिवर्ती के लिए प्रकार । इस लघु परख की एक ताकत अपनी क्षमता के लिए एक SHP2 अवरोधक स्क्रीनिंग अभियान में एकीकृत किया जा रहा है । अज्ञात रासायनिक पदार्थ द्वारा SHP2 के लिए इंट्रासेलुलर बाध्यकारी की पुष्टि करने के लिए परख की क्षमता एक महत्वपूर्ण क्षमता को आश्वस्त करना है कि स्क्रीनिंग संसाधनों को कुशलतापूर्वक तैनात किया जा सकता है । कुल मिलाकर, लघुकृत प्रोटोकॉल मजबूत और विश्वसनीय है।

परख का एक महत्वपूर्ण पहलू समय है; HEK293T कोशिकाओं के ट्रांसफैक्शन के बाद 24 घंटे के सर्वश्रेष्ठ परिणाम प्राप्त किए जाते हैं। SHP2-WT और SHP2-E76K प्रोटीन विषाक्त प्रतीत नहीं होते हैं; हालांकि, दीर्घकालिक उच्च अभिव्यक्ति प्रयोग की संवेदनशीलता को कम कर सकती है और फिर से अनुकूलन की आवश्यकता होगी। परख के लिए उन्हें अलग करने और तैयार करने के लिए कोशिकाओं की सावधानीपूर्वक हैंडलिंग एक अतिरिक्त महत्वपूर्ण विचार है। हालांकि, उच्च गुणवत्ता वाले डेटा का उत्पादन करने के लिए मानक सेल संस्कृति विधियां पर्याप्त हैं। हमने इस परख में उपयोग की जाने वाली छोटी मात्रा के कारण कार्यप्रवाह में कई अपकेंद्री कदमों को शामिल किया है। इन चरणों का उद्देश्य मात्रात्मक मिश्रण को आश्वस्त करना है, इसलिए त्वरण और अपकेंद्रित्र के समय का पालन करने की सिफारिश की जाती है। नोट की, परख reagents गरीब हैंडलिंग के बाद पीड़ित कर सकते हैं । इसलिए, हम अनुशंसा करते हैं कि उन्हें उपयोग तक फ़िरोज़ और संग्रहीत किया जाए।

इस परख के प्रदर्शन में सबसे अधिक समस्या का सामना करना पड़ा एक अनियमित (शोर) या कम चिकनाई संकेत है। इस समस्या के स्रोत का निर्धारण करने के लिए, SHP2-WT और SHP2-E76K के विश्वसनीय अभिव्यक्ति स्तर को आश्वस्त करने के लिए एंटी-ईपीएल एंटीबॉडी का उपयोग करके संक्रमित HEK293T कोशिकाओं पर पश्चिमी दाग विश्लेषण करना नियमित है। हमने चरण 4 में उल्लिखित अभिकर्ता प्रोटोकॉल का उपयोग करके सर्वोत्तम परिणाम प्राप्त किए हैं। एक बार ट्रांसफेक्शन की स्थिति स्थापित हो जाने के बाद, और SHP2 अभिव्यक्ति प्लाज्मिड का एक स्टॉक प्राप्त किया जाता है, हमने परख को अत्यधिक विश्वसनीय पाया है।

परख विकास विश्वसनीय परिणामों को आश्वस्त करने के लिए रसायनीय संकेत खिड़की के अनुकूलन की आवश्यकता है प्राप्त कर रहे हैं। परख खिड़की को अनुकूलित करने के लिए, सबसे महत्वपूर्ण पैरामीटर आपूर्तिकर्ता के मैनुअल में वर्णित डिटेक्शन रिएजेंट मास्टर मिक्स का निर्माण है। यह अनुकूलन मास्टर मिश्रण में ईए रिएजेंट को सब्सट्रेट अनुपात में व्यवस्थित रूप से बदलकर किया जाता है, जबकि लाइसिस बफर घटक को स्थिर रखा जाता है (इस माप के लिए आमतौर पर चार अलग-अलग स्थितियां पर्याप्त होती हैं)। शून्य ईए रिएजेंट के साथ एक शर्त पृष्ठभूमि के रूप में कार्य करती है। परख ऊपर वर्णित के रूप में किया जाता है, और पृष्ठभूमि (एस/बी) के लिए मनाया संकेत के अनुपात की गणना की जाती है । जब एस/बी अनुपात >50 होता है तो विश्वसनीय परिणाम प्राप्त होते हैं। मास्टर मिश्रण की स्थिति है कि असाधारण उच्च संकेत में परिणाम से बचा जाना है, क्योंकि वे रसायनीयनक सब्सट्रेट की कमी में परिणाम होगा ।

परख की एक संभावित सीमा इसकी संवेदनशीलता है। हमारे अनुभव में, सेलुलर थर्मल शिफ्ट परख में मापने योग्य प्रभाव पैदा करने के लिए SHP2 फॉस्फेट अवरोध परख में कम से कम कम माइक्रोमोलर शक्ति के साथ अवरोधकों की आवश्यकता होती है। एक सामान्य दिशानिर्देश के रूप में, हम पहले इन विट्रो पीटीएस में उम्मीदवार यौगिकों का आकलन करने का सुझाव देते हैं, जो रिकॉम्बिनेंट SHP236का उपयोग करके कहते हैं। हमारे चल रहे SHP2 अवरोधक खोज कार्यक्रम से परिणामों के आधार पर, एक यौगिकों के लिए विट्रो में SHP2 पिघलने तापमान बदलाव करने की क्षमता को स्थिर करने की क्षमता के साथ अच्छी तरह से पटरियों (या कई बार अस्थिर) कोशिकाओं में SHP2 प्रोटीन । दिलचस्प बात यह है कि SHP099-जैसे एलोस्टेरिक अवरोधकों द्वारा SHP2-WT का सापेक्ष स्थिरीकरण समान रूप से शक्तिशाली SHP2 सक्रिय साइट-निर्देशित अवरोधकों की वजह से अधिक प्रतीत होता है, जो एसएचपी 2-डब्ल्यूटी प्रोटीन की शारीरिक रूप से प्रासंगिक संरचना को प्रभावी ढंग से स्थिर करने के लिए एलोस्टेरिक अवरोधकों की क्षमता को दर्शाती है।

SHP2 फॉस्फेट के अलावा, हमने अन्य फॉस्फेट और किनेस के लिए सेलुलर लक्ष्य सगाई परख विकसित करने का अनुभव प्राप्त किया है। एक अलग प्रोटीन लक्ष्य के साथ एक प्राथमिक विचार के लिए सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण प्रयोगों के संयोजन का उपयोग करने के लिए परख की वैधता स्थापित करने के लिए, पूरी तरह से ligand बाध्यकारी डेटा की व्याख्या के लिए संसाधनों को प्रतिबद्ध करने से पहले है । इसके अलावा, सेलुलर लक्ष्य सगाई का आकलन करने के लिए अन्य प्रौद्योगिकियां उपलब्ध हैं। हमने SHP2 फॉस्फेट के लिए कई विकल्पों का पता लगाया है लेकिन इस परख को हमारे प्रयासों में अत्यधिक उपयोगी पाया है । अंत में, यह परख SHP2 एंजाइमेटिक गतिविधि से स्वतंत्र है और इसलिए उनके बाध्यकारी मोड के संबंध के बिना छोटे अणुओं के मूल्यांकन और अनुकूलन के लिए अनुमति देता है।

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Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि वे इस लेख की सामग्री के साथ ब्याज का कोई टकराव नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य अनुदान संस्थानों द्वारा समर्थित किया गया था 1R21CA195422 (एल टी के लिए), एपस्टीन परिवार फाउंडेशन पुरस्कार (एन डी पी.C) और एनसीआई कैंसर सेंटर सपोर्ट ग्रांट P30CA030199। इसके अतिरिक्त, इस परियोजना को पूरे या भाग में राष्ट्रीय कैंसर संस्थान, राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों से संघीय धन के साथ वित्त पोषित किया गया है, रासायनिक जीव विज्ञान कंसोर्टियम अनुबंध नहीं के तहत । HHSN261200800001E. इस प्रकाशन की सामग्री जरूरी विचारों या स्वास्थ्य और मानव सेवा विभाग के नीतियों को प्रतिबिंबित नहीं करता है, और न ही व्यापार के नाम, वाणिज्यिक उत्पादों, या संगठनों का उल्लेख करता है अमेरिकी सरकार द्वारा समर्थन मतलब है । सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिम्मेदारी है और जरूरी नहीं कि स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के आधिकारिक विचारों का प्रतिनिधित्व करता है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
384-well gradient equipped thermocycler Eppendorf AG X50h
384-well low dead volume microplate Echo qualified Beckman Coulter, Inc. LP-0200
6-well cell culture plates Greiner Bio-One 657 160 Sterile with lid
Antibiotic-Antimycotic (Anti Anti) 100 X Thermo Fisher Scientific 15240-062
Cell counter Thermo Fisher Scientific Countess II FL
Dulbecco's Modified Eagle Medium 1X + GlutaMAX Thermo Fisher Scientific 10566-016 500 mL
Echo acoustic liquid handler Beckman Coulter, Inc. Echo 550
Electronic multichannel pipette Thermo Fisher Scientific E1 ClipTip
Fetal bovine serum Thermo Fisher Scientific 26140-079 500 mL
HEPES buffer Thermo Fisher Scientific 15630-680 100 mL
InCell Pulse starter kit Eurofins DiscoverX Corp. 94-4007 Components include EA buffer, lysis buffer, and substrate
Microplate reader Tecan Trading AG Spark
Single channel solution trough Thermo Fisher Scientific S253012005
Sodium pyruvate Thermo Fisher Scientific 11360-010 100 mM
Thermal microplate sealer Agilent Technologies, Inc. PlateLoc
Transfection reagents Polyplus Transfection jetPRIME
Trypan blue Thermo Fisher Scientific T10282
TrypLE Express reagent Thermo Fisher Scientific 12605-010
Twin.tec 384 real-time PCR plates Eppendorf AG 30132734

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References

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जोवे में इस महीने अंक 161 सेलुलर लक्ष्य सगाई परख सेलुलर थर्मल शिफ्ट प्रोटीन टायरोसिन फॉस्फेट एसआरसी-होमोलॉजी 2 डोमेन युक्त फॉस्फेट SHP2 PTPN11 एलोस्टेरिक अवरोधक छोटे अणु कैंसर रोधी दवा दवा खोज प्रोटीन दवा बातचीत
SHP2 (PTPN11) द्वारा सेलुलर लक्ष्य सगाई का आकलन फॉस्फेट अवरोधक
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Lambert, L. J., Romero, C.,… More

Lambert, L. J., Romero, C., Sheffler, D. J., Celeridad, M., Cosford, N. D. P., Tautz, L. Assessing Cellular Target Engagement by SHP2 (PTPN11) Phosphatase Inhibitors. J. Vis. Exp. (161), e61457, doi:10.3791/61457 (2020).

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