Summary
Förmågan att bedöma målengagemang av kandidathämmare i intakta celler är avgörande för läkemedelsupptäckt. Detta protokoll beskriver en 384 väl format cellulära termisk skift assay som tillförlitligt upptäcker cellulära mål engagemang av inhibitorer inriktning antingen vild-typ SHP2 eller dess onkogena varianter.
Abstract
Den Src-homology 2 (SH2) domän-innehållande phosphatase 2 (SHP2), kodas av PTPN11 proto-onkogen, är en nyckelmediator av receptor tyrosin kinas (RTK)-driven cell signalering, främja cell överlevnad och spridning. Dessutom är SHP2 rekryteras av immun kontrollpunkt receptorer att hämma B och T cell aktivering. Aberrant SHP2 funktion har varit inblandad i utveckling, progression, och metastasering av många cancerformer. Faktum är att små molekyler SHP2-hämmare nyligen har gått in i kliniska prövningar för behandling av fasta tumörer med Ras/Raf/ERK-spridningsvägsaktivering, inklusive tumörer med vissa onkogena Ras-mutationer. Den nuvarande klassen av SHP2-hämmare är dock inte effektiv mot shp2-onkogena varianter som förekommer ofta i leukemier, och utvecklingen av specifika små molekyler som riktar sig mot onkogena SHP2 är föremål för aktuell forskning. Ett vanligt problem med de flesta kampanjer drug discovery involvera cytosolic proteiner som SHP2 är att de primära analyser som driver kemiska upptäckt är ofta in vitro-analyser som inte rapporterar cellulära mål engagemang kandidat föreningar. För att ge en plattform för mätning av cellulära mål engagemang, utvecklade vi både vild-typ och mutant SHP2 cellulära termisk skift analyser. Dessa analyser på ett tillförlitligt sätt upptäcka mål engagemang shp2-hämmare i celler. Här tillhandahåller vi ett omfattande protokoll av denna analys, som ger ett värdefullt verktyg för bedömning och karakterisering av SHP2-hämmare.
Introduction
Tyrosin fosforylering spelar en viktig roll i signaltransduktion i celler1,2. Denna post-translational modifiering katalysas av protein tyrosin kinaser (PTKs) och återförs av protein tyrosin fosfataser (PTPs). Därför leder avvikande PTK eller PTP funktion till många ärvda eller förvärvade mänskligasjukdomar 3,4,5,6. Den Src-homology 2 (SH2) domän-innehållande phosphatase 2 (SHP2) är en allmänt uttryckt icke-receptor typ PTP kodas av den proto-onkogene PTPN117 och är en viktig regulator av många fysiologiska processer som innebär signaltransferion genom aktivering av Ras / Raf / ERK, PI3K / Akt, eller JAK / STAT signalering vägar8. Normalt är SHP2-aktiviteten hårt reglerad för att förhindra avvikande signalering. Under basala förhållanden SHP2 är autoinhibited av sin N-terminal SH2 domän, som blockerar tillgång till den aktiva platsen inom den katalytiska fosfatas domänen (Figur 1A)9,10. Vid cellaktivering rekryterar tyrosinfosforylerade bindningsproteiner SHP2, vilket gör att den antar sin aktiva konformation, där den aktiva platsen nu är tillgänglig för sina substrat. I många cancerformer SHP2 aktiviteten är förhöjd. Somatiska gain-of-function (GOF) mutationer i PTPN11 har identifierats främst i leukemier och förhindra bindning av N-SH2 domänen till fosfatas domän, vilket resulterar i konstitutivt aktiva SHP2 (Figur 1B)11. Sett GOF mutationer i PTPN11 är ansvariga för ~ 50% av fallen av Noonans syndrom, en utvecklingsstörning med en ökad risk för malignitet12. I solida tumörer, där PTPN11 mutationer är sällsynta, större nivåer av fosforylerade bindande proteiner leda till förstärkt SHP2 aktivitet (Figur 1C). SHP2 är också viktigt för immun checkpoint signalering, som checkpoint receptorer såsom BTLA eller PD-1 rekrytera SHP2 till defosforylering nyckelsignalering molekyler, förhindra immuncell aktivering13,14,15.
Att rikta ptps med små molekyler har varit en utmaning, eftersom den aktiva platsen för PTPs är mycket bevarad och mycket laddad; hämmare som riktar sig till den aktiva webbplatsen är ofta potenta, men uppvisar dålig selektivitet och oral biotillgänglighet16,17,18,19,20,21,22. Faktum är att många rapporterade SHP2-hämmare lider av dålig selektivitet och brist på effekt i cellerna23. Nyligen har allosteriska hämmare av SHP2 med god potens och utmärkt selektivitet rapporterats (t.ex. shp09924 och RMC-455025) och har väckt förnyat intresse för SHP2-hämmare. Föreningar baserade på SHP099 och RMC-4550 är för närvarande i kliniska fas I-prövningar för att behandla solida tumörer med receptor tyrosin kinas (RTK) utbildningsavsnittpathway aktivering 26,27. Medan banbrytande, dessa föreningar är ineffektiva mot många av shp2 onkogena mutanter som driver leukemogenesis i ett betydande antal blodcancerpatienter28,29,30. Denna brist på potens av SHP099-liknande föreningar mot SHP2 onkogena varianterna härrör från deras unika allosteric mekanism, eftersom de hämmar SHP2 verksamhet genom att binda och stabilisera inaktiva, sluten konformation, som störs i SHP2 mutanter. Vidare, baserat på en färskrapport 31, adaptiva resistensmekanismer hos patienter som behandlats med SHP099-liknande hämmare är ganska tänkbart. Följaktligen är utvecklingen av nästa generations SHP2-hämmare som riktar sig mot dess aktiva, öppna tillstånd ett ämne för intensiv forskning.
Karakteriseringen av nya SHP2-hämmare i celler är en väsentlig aspekt av blyoptimeringsprocessen. Kritiskt, beprövade mål engagemang av hämmaren under fysiologiska förhållanden ger en ytterligare nivå av förtroende för att resurser för medicinsk kemi effektivt sätts in på föreningar med lovande cellulär effekt. Tidigare har flera metoder för att bedöma bindningen av små molekylhämmare till sina mål utvecklats, främst för proteinkinaser32. För att utveckla en SHP2 cellulära mål engagemang assay, vi utnyttjade en cellulär termisk förskjutning assay33. Denna analys, liknande in vitro thermal shift (PTS) analys för proteiner34, övervakar målet protein termisk stabilitet, som vanligtvis ändras genom bindning av små molekyler. Den ursprungliga analysen är en låg genomströmning assay som utnyttjar antikroppar för att kvantifiera mål proteinnivåer. Alternativt valde vi en nyligen rapporterad variant av termiska skift analysen som utnyttjar en β-galactosidase enzym fragment komplementering (EFC) analys (Figur 2)35. För dessa experiment, proteinet av intresse uttrycks i celler som en N- eller C-terminal fusion protein som bär en förbättrad ProLabel tagg (ePL, en 42 aminosyra fragment av β-galactosidase). Celler överförs sedan till 384-väl PCR-kompatibla plattor och inkuberas med föreningar av intresse. En termocyklare utnyttjas för att tillämpa en temperaturgradient på cellerna, vars proteiner kommer denaturera och aggregera som temperaturen ökar baserat på deras termiska stabilitet. Förmågan hos en kandidatförening att binda och stabilisera proteinet av intresse kommer att resultera i en ökad termisk stabilitet av detta protein. Efter cellernas lys kommer därför de taggade proteiner som har stabiliserats av en kandidatförening att finnas kvar i lösning vid högre temperaturer än taggade proteiner av celler som inkuberas med fordonskontroll. Reporter enzym acceptor (EA) kan komplettera lösliga ePL-taggade proteiner, vilket resulterar i detekterbara β-galactosidase aktivitet med hjälp av en luminisektion substrat.
Vi utvecklade nyligen en robust cellulär termisk skiftanalys för wild-type SHP2 (SHP2-WT) och en frekvent SHP2 onkogen variant (SHP2-E76K) i en miniatyriserad 384-brunn format36. Här rapporterar vi ett detaljerat protokoll av denna analys, som på ett tillförlitligt sätt upptäcker mål engagemang av SHP2-hämmare i celler och visar en hög grad av korrelation mellan hämmare potens och cellulära termiska skiftdata. Arbetsflödet för allmän analys illustreras i figur 3. Vår plattform använder N-terminally taggade fullängds ePL-SHP2 fusion proteiner. För generering av motsvarande pICP-ePL-N-SHP2-WT och pICP-ePL-N-SHP2-E76K uttryck plasmider, hänvisas till vår senaste publikation36. Denna analys kan utföras med hjälp av en termisk gradient för att upprätta SHP2 termiska profiler och bestämma SHP2 smälttemperaturer i närvaro eller frånvaro av inhibitor. När termiska profiler har fastställts, Det kan också utföras under isotermiska förhållanden, vilket möjliggör inhibitor dos-respons bedömning. Båda typerna av experiment beskrivs nedan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av cellodling och reagenser
- Formulera en 500 mL flaska tillväxt media med 10% fetala nötkreatur serum, 1x antibiotika/antimicotic, 20 mM HEPES och 1 mM natriumpynat. Förvaras vid 4 °C.
- Tina cellulära termiska skiftreagenser (EA-reagens, lysbuffert och substrat) från frysta originallagerflaskor.
- Dosera reagenser och buffert som 2 mL alikvoter och förvara vid -20 °C.
OBS: Undvik att frysa/tina för reproducerbarhet och använd endast den volym reagens som krävs för analysförfarandet.
2. Tillväxt och underhåll av HEK293T-celler
- Erhålla låg passagens adherent HEK293T celler från cryo lagring.
- Underhåll HEK293T-celler i tillväxtmedia vid 37 °C, 5% CO2.
- Dela celler var 4 dagar i en 1:14 förhållande.
OBS: För bästa prestanda är HEK293T-celler inte tillåtna att passage större än 25 gånger.
3. HEK293T-cellberedning för transient transinfektion
- Lossa HEK293T-celler från 16 mL-plattor med hjälp av 3 mL av cellens lossningsreagens.
- Späd med 12 mL tillväxtmedia. Samla celler genom centrifugering vid 1 400 x g i 4 min.
- Resuspend pelleten i 10 mL tillväxt media. Mät cellernas koncentration och viabilitet med hjälp av trypan blå och en cellräknare.
- Plate 7.0 x 105 exponentiellt växande HEK293T celler per brunn i en 6 väl cell odling plattan ungefär 24 h före transfektion.
OBS: Reservera en brunn för varje plasmid som ska transfekteras. - Inkubera i 24 h vid 37 °C, 5% CO2.
4. Transfektion av HEK293T-celler
- Från ett renat plasmidbestånd av pICP-ePL-N-SHP2-WT eller pICP-ePL-N-SHP2-E76K (~200 ng/μL) späd 2 μg plasmid DNA till 200 μL transfectionbuffert.
- Vortex för 10 s och centrifug vid 1 400 x g i 4 min.
- Tillsätt 4 μL transfektionsreagens till det utspädda DNA:t. Vortex för 10 s och centrifug vid 1 400 x g i 4 min.
- Inkubera vid 23 °C i 10 min.
- Ta bort den 6 brunnsplattan som innehåller växande HEK293T-celler från inkubatorn. Tillsätt transfektionsmixen till de bifogade cellerna i 6-brunnsplattan. Inkubera i 24 h vid 37 °C, 5% CO2.
5. Beredning av analysplattor
- Förbered 10 mM lagerlösningar i DMSO av föreningar som ska testas.
- Dispensera inhibitorlösningar till en 384-brunnsklätt källplatta med låg död volym för omedelbar användning.
- Spot önskad volym av hämmare eller fordon (DMSO) med hjälp av en flytande hanterare i 384-väl realtid PCR plattor på ett mål slutlig volym på mindre än 0,5% DMSO (v / v). Täta plattan med hjälp av en platt sealer med inert gas rensning.
OBS: För inhibitordos-respons-analyser, se till att återfylla DMSO i enlighet med detta så att lika stora mängder DMSO används för varje inhibitorkoncentration. För bästa resultat, förvara plattor vid 23 °C och använd plattor inom 24 h.
6. Transfected cell avlossning och förberedelse
- Preincubate tillväxtmedia och cellavlossningsreagens i ett 37 °C vattenbad. Ta bort transfekterade celler från inkubatorn. Aspirera försiktigt media från plattans brunnar.
OBS: Använd en ny aspirator för varje brunn som innehåller en annan transfekterad plasmid. - Tillsätt 0,3 mL av cellavlossningsreagensen. Gunga försiktigt plattan fram och tillbaka för att noggrant täcka ytan av plattan botten. Inkubera vid 23 °C i 2 min.
- Lägg till 1 mL tillväxtmedia till varje brunn. Försiktigt pipettera media och celler i brunnen och överför till en 15 mL Falcon centrifugrör. Samla celler genom centrifugering vid 1 400 x g i 4 min.
- Försiktigt men grundligt aspirera bort media.
OBS: Rest fenolrött i cellavlossningsreagensen kan störa analysen. - Försiktigt resuspend cell pellet i 2 mL av tillväxt media. Mät cellernas koncentration och viabilitet med hjälp av trypan blå och en cellräknare.
OBS: Cellens bärkraft bör vara > 90% för bästa resultat. - Späd celler till en koncentration av 125 celler/μL. Till exempel, för en 5 μL analys detta är ~ 625 celler / μL. För optimal bärkraft hålla celler i suspension i högst 2 h.
7. Inkubation av celler med SHP2-hämmare
- Dispensera celler i en steril enda kanal lösning tråg.
- Centrifugera 384-brunns-REALTID PCR-platta som har förbereddas av SHP2-hämmare nedfall vid 2 500 x g i 5 min vid 23 °C.
- Avlägsna tätning från föreningsplattan. Med hjälp av en 125 μL flerkanalig pipetter, tillsätt 5 μL av de utspädda cellerna till önskade brunnar.
- Centrifugera plattan vid 42 x g i 30 s utan lock på plattan. Fäst en locktätning på plattan efter att plattan spunnits nedåt och inkubera analysplattan vid 37 °C, 5% CO2 i 1 h.
8. Beredning av chemiluminescent reagens master mix
- Avlägsna den nödvändiga mängden detektionsreagenser (EA-reagens, lysbuffert, och substrat) från -20 °C-lagring efter pläteringsceller. Tina reagenser vid 23 °C.
OBS: För bekvämlighet i överföring, förbereda en volym som är 1,5 x den totala volymen av celler som har deponerats på plattan. Återanvänd inte reagens efter användning. - Bered en mastermix av reagenserna med hjälp av tillstånd EA-10, som består av komponent- och volymfraktion enligt följande: EA-reagens (0,17), lysbuffert (0,17), substrat (0,67).
OBS: Reagensförhållanden baseras på optimeringsexperiment utförda enligt vad som anges i leverantörens manual.
9. Isotermisk eller termisk profilgradient värmepuls
- Programmera lutningsdugliga thermocycler för leverans av värmepuls.
- För termiska profilgradientexperiment förprogrammerar du termocyklaren med följande exempelspecifikationer:
- Värmepuls: 3 min önskad smälttemperatur (vertikal eller horisontell lutning +/- 15 °C; exempel 38-68 °C spridda över 24 brunnar ger temperatursteg på 1,25 °C).
- Jämviktsåtervinningssteg: 3 min 20 °C med ramphastighet = 1 °C/s
- För isotermiska experiment som inrättats protokollet inrättas enligt följande:
- Värmepuls: 3 min 55 °C. Jämviktsåtervinningssteg: 3 min 20 °C med ramphastighet = 1°C/s
OBS: För ökad reproducerbarhet, eftersom det kan vara svårt att placera plattan exakt vid den tidpunkt då termocyklaren når sin önskade temperatur, ställa in programmet för att räkna ner 15 s innan du påbörjar 3 min puls. För den termocyklare som används i detta experiment seTabell över material , hålls locket uppe under värmepulsen.
10. Detektering och mätning av Lys
- Komplettera analysplattor med lysdetektionsglädland genom tillsats av lika stora volymer (5 μL) till varje brunn som ska analyseras med hjälp av en flerkanalig pipett.
- Centrifugera plattan 42 x g i 30 s. Förvaras i 23 °C i mörker i 30-60 min.
- Mät kemjölkscens med hjälp av en mikroplattläsare som kan detektera luminescens i 384-brunnsformat. Utför luminindemätning med plattans typ och integrationstid optimerad (integrationstid 1000 ms, avst.tid 0 s). Mät värden som counts/s och output för vidare analys.
11. Dataanalys
- Analysera luminindedata med hjälp av en vetenskaplig 2D-grafering och statistikprogramvara.
- Generera termiska profiler genom att analysera de normaliserade luminegensdata (normaliserade till fordonets kontroll) med hjälp av ickelinjär regression och en Boltzmann sigmoideal modell.
OBS: I termiska profilexperiment definierar den beräknade V50, den temperatur som är halvvägs mellan botten och toppen av kurvan, smälttemperaturen för SHP2. I isotermiska experiment definierar EC50 koncentrationen av inhibitorn som ger halv-maximal respons.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den termiska gradient experiment för SHP2-WT resulterade i en sigmoidal cellulär termisk profil med en smal smältning övergång som är typisk och konsekvent för ett vikt protein (Figur 4A). SHP2 består av tre oberoende domäner: två SH2-domäner och den katalytiska domänen (Bild 1). I den autoinhibited stängda konformationen dessa domäner själv-associera; den smältande övergång som observerades i termisk profil experiment förmodligen återspeglas detta tillstånd i cellen. Inkubation av SHP2-WT med allosterinhiberaren SHP099 vid 10 μM stabiliserade SHP2-WT termisk profil till en betydande och mätbar grad (Bild 4A). Detta är reflekterande av det kända bindningssättet av SHP099-liknande hämmare som fungerar som "molekylärt lim"37 mellan de reglerande bindande SH2-domänerna och den katalytiska underenheten. Viktigt, vår cellulära termisk skift assay bekräftade att SHP099 kan tränga in i cellen och binda till den märkta SHP2-WT. Stabiliseringen av SHP2 spårade också med styrkan av SHP099-liknande allosteric föreningar. Vid 10 μM producerade den mer potenta RMC-4550 (rapporterad IC50 = 0,6 nM) en högre grad av stabilisering än SHP099 (rapporterad IC50 = 70 nM) för SHP2-WT (Figur 4B).
Vi observerar ett annat beteende i den termiska profilen för målet engagemang analysen med onkogena mutant SHP2-E76K (Figur 4C). Den termiska profilen för SHP2-E76K har en smältande övergång som är mindre smal, vilket återspeglar destabilization förmedlas på den tertiära strukturen av SHP2 av E76K mutationen, som är känd för att störa interaktioner mellan SH2 domäner och den katalytiska subenhet. Därför sänktes den observerade smälttemperaturen jämfört med WT-proteinet. Viktigt, när inkuberas med allosteric inhibitor SHP099 vid 10 μM, endast marginell termisk stabilisering observerades, överensstämmer med kända egenskaper SHP099 och liknande hämmare28,29,30.
Uttrycksnivån för det ePL-taggade protein som ska undersökas kan dramatiskt påverka signalintensiteten. Visas (Bild 4D) är termiska profiler för övergående och stabsintegrerade SHP2-WT-celler under identiska analysförhållanden. Normalisering av dessa olikartade kurvor ger jämförbara termiska profiler (Bild 4E), som anger det breda utbudet av EFC detektionssystemet. Det är viktigt att notera att vi har anställt både transienta transfection och stabil integration SHP2 uttrycker celler med jämförbara resultat. För generering av stabila cellinjer bör det noteras att HEK293 celler snarare än HEK293T celler bör användas, som HEK293T celler redan har en neomycin resistens markör som skulle förhindra urval av celler med integrerad pICP-ePL-N-SHP2 plasmid, som innehåller en neomycin/kanamycin resistens gen för urval i däggdjursceller.
För att erhålla inhibitordos-respons mätningar, kan man utföra sammansatta titrer på celler under isotermiska förhållanden. För att göra det föreslår vi att först bestämma temperaturen optimal för dessa mätningar. Dra nytta av thermocycler förmåga att producera termiska lutningar på den "korta" axeln av en 384-brunns platta, en serie av isotermiska titreringar kan utföras på en enda platta. Figur 5A visar representativa resultat av denna optimering för SHP2-WT med användning av en begränsad fempunktsdos-respons på RMC-4550. Temperaturer som var för låga för att denaturera proteinet producerade en hög signal som var oberoende av läkemedlet. På samma sätt, temperaturer som var för hög ges liten kapacitet för föreningen att stabilisera proteinet. Vid en optimal temperatur, som bestäms av detta experiment, gav dock en isotermisk titrering med hjälp av en full 10-punkts dos-respons en användbar EC50 för RMC-4550 (Figur 5B). Förutom de representativa data som visas här, har vi fastställt att experiment med optimerade isotermiska förhållanden kan användas för att effektivt screena nya SHP2-hämmare för deras förmåga att korsa cellmembran och engagera sitt mål i cellerna36.
Figur 1: Reglering av SHP2-aktivitet.
(A) SHP2 aktivitet är hårt reglerad i normala celler. Under basala förhållanden, dess N-terminal SH2 domän occludes den aktiva platsen inom phosphatase (PTP) domän, vilket resulterar i autoinhibition. RTK-tillväxtfaktor och cytokinstimulering leder till tyrosinfosforylering av adapterproteiner, som sedan binder till SH2-domänerna, vilket orsakar en konformationsförändring som innebär att SHP2-aktiva platsen blir tillgänglig för dess substrat. (B) Somatiska SHP2 mutationer, ofta finns i leukemier, är belägna vid gränssnittet mellan N-SH2 och fosfatas domäner och förhindra SHP2 från att anta den slutna, autoinhibited konformation, vilket resulterar i en kontituivt aktiv fosfatas. (C) I solida tumörer, förstärkning eller överuttryck av tillväxtfaktorer, RTKs, eller byggnadsställningar adaptrar resultera i avvikande aktivering av SHP2. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 2: SHP2 cellulära termiska skiftprinciper.
Vår cellulära mål engagemang analys bygger på en β-galactosidase (β-gal) enzym fragment komplementering (EFC) analys. Celler (HEK293T), som uttrycker fullängds SHP2 med en ePL fusion tagg (42 aminosyrafragment av β-gal), behandlas med en sond förening och utsätts för en kort värmepuls som orsakar SHP2 att denature och bilda otillgängliga olösliga aggregat, vilket gör ePL taggen otillgängliga. Specifik bindning av sondföreningen till SHP2 kan förstärka dess termiska stabilitet. Termisk stabilisering ger mer lösliga mål protein med ePL taggen för komplementering i reportern enzymet chemiluminescence systemet. Aggregaten resulterar i minskad komplementering och lumininde. Denna siffra har ändrats från ref.36. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 3: Miniatyriserat arbetsflöde för SHP2-utrustning.
Rutinmässig prestanda av analysen använder sig av den angivna utrustningen. Analysplattor bereds med hjälp av en akustisk flytande hanterare som levererar nanoliter volymer av föreningar. Cellöverföring kan utföras manuellt, med hjälp av en flerkanalig pipett, eller genom att använda en automatisk vätskeautomat. Värmepuls denaturering använder en termocyklare som kan leverera termiska gradienter till en 384-brunnsplatta. En mikroplatt läsare används för att upptäcka β-gal EFC analys chemiluminescence. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 4: Cellulärt målengagemang av allosteriska SHP2-hämmare med SHP2-WT- och SHP2-E76K-proteiner.
(A) SHP2-WT-proteinet i närvaro av vehiss (DMSO, röd) producerade en väluppfostrad cellulär termisk profil med en smal smältande övergång som överensstämmer med ett vikt protein i autoinhibited tillstånd. Inkubation av SHP2-WT som uttrycker celler med 10 μM SHP099 stabiliserade proteinet i det bundna tillståndet (blå). (B) Cellulära mål engagemang termiska profiler av SHP2-WT i frånvaro (röd) eller närvaro av SHP099-liknande allosteric inhibitor RMC-4550 (10 μM, blå). RMC-4550 gav en ökad cellulär stabilisering av SHP2-WT än vad som observerades för SHP099. Detta ökade mål engagemang spår med sin större biokemiska potens. (C) Den SHP2-E76K mutant hade en mindre uttalad smältkurva överensstämmer med ett tillstånd som är till stor del i den "öppna" aktiv form (röd). SHP099 vid 10 μM ökade endast marginellt SHP2-E76K smälttemperaturen (blå), vilket är överens med biokemisk hämning och data om cellulär effekt. (D) Den observerade chemiluminescence signalen motsvarar uttrycksnivån för ePL-SHP2. Jämfört med transiently transfected HEK293T celler, HEK293 celler där ePL taggade SHP2-WT var stably integreras i arvsmassan, hade en reducerad nivå av ePL-SHP2 uttryck. Följaktligen visade de råa unnormalized chemiluminesence termiska profiler en kraftigt minskad luminegel signal för de stably uttrycker HEK293 celler (blå) jämfört med de transiently transfected HEK293 celler (röd). E) Normalisering av de obearbetade chemiluminescensdata för stabil (HEK293) och transiently transfected (HEK293T) producerade jämförbara termiska profiler, som visar känsligheten för mätningarna. Datapunkter och felstaplar (±SD) representerar dubbletter av mätningar. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 5: Cellulärt målengagemang isotermisk dos-responsanalys för SHP2-WT.
(A) För att upprätta optimala isotermiska tillstånd för att utvärdera det dosberoende målengagemanget för SHP2-hämmare, utförs först en termisk gradient över den korta axeln på en 384-brunnsplatta. Detta möjliggör effektiv bedömning av fempunktsdos-respons av inhibitorer (RMC-4550; 0,08–10 μM) för att identifiera den optimala temperaturen. (B) En fullständig cellulär isotermisk dos-respons (10-punkt) för RMC-4550 vid en optimal temperatur på 56°C. EC50 vid denna temperatur anges. Datapunkter och felstaplar (± SD) representerar fyrdubbla mätningar. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har presenterat ett mål engagemang assay som kan bekräfta direkt bindning av små molekyler till SHP2 fosfatas i celler. Analysen kan diskriminera mellan låg och hög affinitetshämmare och, viktigt, bekräfta en brist på potens av allosteric hämmare av SHP099-typ för GOF onkogena SHP2-E76K mutant. En styrka av denna miniatyriserade analys är dess förmåga att integreras i en SHP2-hämmare screening kampanj. Förmågan hos analysen att bekräfta intracellulär bindning till SHP2 av okänd kemisk materia är en viktig kapacitet att säkerställa att screening resurser effektivt kan sättas in. Sammantaget är det miniatyriserade protokollet robust och tillförlitlig.
En kritisk aspekt av analysen är timing; bästa resultat erhålls 24 h efter transfection av HEK293T-cellerna. ShP2-WT- och SHP2-E76K-proteinerna verkar inte vara giftiga; men långsiktiga höga uttryck skulle kunna minska känsligheten i experimentet och skulle kräva om-optimering. Noggrann hantering av celler att lossna och förbereda dem för analysen är en ytterligare kritisk hänsyn. Standardmetoder för cellodling är dock tillräckliga för att producera högkvalitativa data. Vi har införlivat ett antal centrifugeringen steg i arbetsflödet på grund av de små volymer som utnyttjas i denna analys. Dessa steg har syftet att säkerställa kvantitativ blandning, så följsamhet till accelerationen och tiden för centrifugeringen rekommenderas. Att notera, de analysreagenser kan lida efter dålig hantering. Därför rekommenderar vi att de alikvotas och förvaras frysta tills användning.
Den vanligaste stött problem i utförandet av denna analys är en oberäknelig (bullrig) eller låg lumininde signal. För att fastställa källan till detta problem är det rutin att utföra Western blot analys på transfected HEK293T celler med hjälp av anti-ePL antikroppar för att försäkra en tillförlitlig uttrycksnivå shp2-WT och SHP2-E76K. Vi har fått bästa resultat med hjälp av det reagensprotokoll som beskrivs i steg 4. När transfektion villkor är etablerade, och ett enda lager av SHP2 uttryck plasmid erhålls, har vi funnit analysen vara mycket tillförlitlig.
Assay utveckling kräver optimering av chemiluminescent signalfönstret för att försäkra tillförlitliga resultat erhålls. För att optimera analysfönstret är den mest signifikanta parametern formuleringen av detektionsreagensens master mix enligt beskrivningen i leverantörens manual. Denna optimering utförs genom att systematiskt ändra EA-reagens till substratförhållande i huvudmixen, medan lysbuffertkomponenten hålls konstant (fyra olika förhållanden är vanligtvis tillräckliga för denna mätning). Ett tillstånd med noll EA-reagens fungerar som bakgrund. Analysen utförs enligt ovan, och förhållandet mellan den observerade signalen och bakgrunden (S/B) beräknas. Tillförlitliga resultat erhålls när S/B-förhållandet är >50. Master mix villkor som resulterar i utomordentligt hög signal skall undvikas, eftersom de kommer att resultera i utarmning av chemiluminescence substrat.
En potentiell begränsning av analysen är dess känslighet. Enligt vår erfarenhet, hämmare med minst en låg mikromolar potens i SHP2 fosfatas hämning analyser krävs för att producera mätbara effekter i cellulär termisk skift analysen. Som en allmän riktlinje föreslår vi att först bedöma kandidat föreningar i in vitro PTS analyser med hjälp av rekombinanta SHP236. Baserat på resultat från vår pågående SHP2-hämmare discovery program, en föreningar förmåga att flytta SHP2 smälttemperaturen in vitro spår väl med sin kapacitet att stabilisera (eller ibland destabilisera) SHP2 protein i celler. Intressant nog verkar den relativa stabiliseringen av SHP2-WT av SHP099-liknande allosteriska hämmare vara större än den som orsakas av lika potenta SHP2 aktiva plats-riktade hämmare, sannolikt återspeglar förmågan hos de allosteric hämmare att effektivt stabilisera en fysiologiskt relevant konformation av SHP2-WT protein.
Förutom SHP2-fosfatasen har vi fått erfarenhet av att utveckla cellulära målengagemangsanalyser för andra fosfataser och kinaser. Ett primärt övervägande med ett annat proteinmål är att utnyttja en kombination av positiva och negativa kontrollexperiment för att fastställa analysens giltighet, innan man till fullo åtar sig resurser till tolkningen av ligandbindningsdata. Vidare finns det andra tekniker tillgängliga för bedömning av cellulära mål engagemang. Vi har utforskat ett antal alternativ för SHP2 fosfatas men har funnit denna analys vara mycket användbar i våra ansträngningar. Slutligen är denna analys oberoende av SHP2 enzymatisk aktivitet och därför möjliggör utvärdering och optimering av små molekyler utan hänsyn till deras bindning läge.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några intressekonflikter med innehållet i denna artikel.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Institutes of Health Grant 1R21CA195422 (till L. T.), Epstein Family Foundation Award (till N. D. P.C.), och NCI Cancer Center Support Grant P30CA030199. Dessutom har detta projekt finansierats helt eller delvis med federala medel från National Cancer Institute, National Institutes of Health, under Chemical Biology Consortium Contract No. HHSN261200800001E. Innehållet i denna publikation återspeglar inte nödvändigtvis åsikter eller policyer från Department of Health and Human Services, och nämner inte heller handelsnamn, kommersiella produkter eller organisationer som innebär godkännande av den amerikanska regeringen. Innehållet är enbart författarnas ansvar och representerar inte nödvändigtvis de officiella åsikterna från National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 384-well gradient equipped thermocycler | Eppendorf AG | X50h | |
| 384-well low dead volume microplate Echo qualified | Beckman Coulter, Inc. | LP-0200 | |
| 6-well cell culture plates | Greiner Bio-One | 657 160 | Sterile with lid |
| Antibiotic-Antimycotic (Anti Anti) 100 X | Thermo Fisher Scientific | 15240-062 | |
| Cell counter | Thermo Fisher Scientific | Countess II FL | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium 1X + GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 10566-016 | 500 mL |
| Echo acoustic liquid handler | Beckman Coulter, Inc. | Echo 550 | |
| Electronic multichannel pipette | Thermo Fisher Scientific | E1 ClipTip | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 26140-079 | 500 mL |
| HEPES buffer | Thermo Fisher Scientific | 15630-680 | 100 mL |
| InCell Pulse starter kit | Eurofins DiscoverX Corp. | 94-4007 | Components include EA buffer, lysis buffer, and substrate |
| Microplate reader | Tecan Trading AG | Spark | |
| Single channel solution trough | Thermo Fisher Scientific | S253012005 | |
| Sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360-010 | 100 mM |
| Thermal microplate sealer | Agilent Technologies, Inc. | PlateLoc | |
| Transfection reagents | Polyplus Transfection | jetPRIME | |
| Trypan blue | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| TrypLE Express reagent | Thermo Fisher Scientific | 12605-010 | |
| Twin.tec 384 real-time PCR plates | Eppendorf AG | 30132734 |
References
- Hunter, T. Tyrosine phosphorylation: thirty years and counting. Current Opinion in Cell Biology. 21 (2), 140-146 (2009).
- Alonso, A., et al.
- Cohen, P. Protein kinases-the major drug targets of the twenty-first century. Nature Reviews Drug Discovery. 1 (4), 309 (2002).
- Ferguson, F. M., Gray, N. S.
- Stanford, S. M., Bottini, N. Targeting Tyrosine Phosphatases: Time to End the Stigma. Trends in Pharmacological Sciences. 38 (6), 524-540 (2017).
- Tonks, N. Protein tyrosine phosphatases--from housekeeping enzymes to master regulators of signal transduction. FEBS Journal. 280 (2), 346-378 (2013).
- Chan, R., Feng, G. PTPN11 is the first identified proto-oncogene that encodes a tyrosine phosphatase. Blood. 109 (3), 862-867 (2007).
- Chan, G., Kalaitzidis, D., Neel, B. The tyrosine phosphatase Shp2 (PTPN11) in cancer. Cancer Metastasis Rev. 27 (2), 179-192 (2008).
- Hof, P., Pluskey, S., Dhe-Paganon, S., Eck, M., Shoelson, S. Crystal structure of the tyrosine phosphatase SHP-2. Cell. 92 (4), 441-450 (1998).
- Barford, D., Neel, B. Revealing mechanisms for SH2 domain mediated regulation of the protein tyrosine phosphatase SHP-2. Structure. 6 (3), 249-254 (1998).
- Neel, B. G., Chan, G., Dhanji, S. Handbook of Cell Signaling (Second Edition). 2, Academic Press. Amsterdam. 771-809 (2010).
- Tartaglia, M., et al. Mutations in PTPN11, encoding the protein tyrosine phosphatase SHP-2, cause Noonan syndrome. Nature Genetics. 29 (4), 465-468 (2001).
- Yokosuka, T., et al. Programmed cell death 1 forms negative costimulatory microclusters that directly inhibit T cell receptor signaling by recruiting phosphatase SHP2. Journal of Experimental Medicine. 209 (6), 1201-1217 (2012).
- Okazaki, T., Maeda, A., Nishimura, H., Kurosaki, T., Honjo, T. PD-1 immunoreceptor inhibits B cell receptor-mediated signaling by recruiting src homology 2-domain-containing tyrosine phosphatase 2 to phosphotyrosine. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (24), 13866-13871 (2001).
- Watanabe, N., et al. BTLA is a lymphocyte inhibitory receptor with similarities to CTLA-4 and PD-1. Nature Immunology. 4 (7), 670-679 (2003).
- Bialy, L., Waldmann, H. Inhibitors of protein tyrosine phosphatases: next-generation drugs. Angewandte Chemie International Edition England. 44 (25), 3814-3839 (2005).
- Kumar, S., Liang, F., Lawrence, D., Zhang, Z. Small molecule approach to studying protein tyrosine phosphatase. Methods. 35 (1), 9-21 (2005).
- Tautz, L., Pellecchia, M., Mustelin, T.
- Tautz, L., Mustelin, T. Strategies for developing protein tyrosine phosphatase inhibitors. Methods. 42 (3), 250-260 (2007).
- Vintonyak, V., Antonchick, A., Rauh, D., Waldmann, H. The therapeutic potential of phosphatase inhibitors. Current Opinion in Chemical Biology. 13 (3), 272-283 (2009).
- Barr, A. Protein tyrosine phosphatases as drug targets: strategies and challenges of inhibitor development. Future Medicinal Chemistry. 2 (10), 1563-1576 (2010).
- He, R., Zeng, L., He, Y., Zhang, S., Zhang, Z. Small molecule tools for functional interrogation of protein tyrosine phosphatases. FEBS Journal. 280, 731-750 (2012).
- Tsutsumi, R., Ran, H., Neel, B. G. Off-target inhibition by active site-targeting SHP2 inhibitors. FEBS Open Biology. 8 (9), 1405-1411 (2018).
- Chen, Y. N., et al. Allosteric inhibition of SHP2 phosphatase inhibits cancers driven by receptor tyrosine kinases. Nature. 535 (7610), 148-152 (2016).
- Nichols, R. J., et al. RAS nucleotide cycling underlies the SHP2 phosphatase dependence of mutant BRAF-, NF1- and RAS-driven cancers. Nature Cell Biology. 20 (9), 1064-1073 (2018).
- Clinical Trial NCT03114319. , Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03114319?term=NCT03114319_rank=1 (2019).
- Clinical Trial NCT03634982. , Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03114319?term=NCT03634982_rank=1 (2019).
- Sun, X., et al. Selective inhibition of leukemia-associated SHP2(E69K) mutant by the allosteric SHP2 inhibitor SHP099. Leukemia. 32 (5), 1246-1249 (2018).
- LaRochelle, J. R., et al. Structural reorganization of SHP2 by oncogenic mutations and implications for oncoprotein resistance to allosteric inhibition. Nature Communication. 9 (1), 4508 (2018).
- Padua, R. A. P., et al. Mechanism of activating mutations and allosteric drug inhibition of the phosphatase SHP2. Nature Communication. 9 (1), 4507 (2018).
- Lu, H., et al. Resistance to allosteric SHP2 inhibition in FGFR-driven cancers through rapid feedback activation of FGFR. Oncotarget. 11 (3), 265-281 (2020).
- Smyth, L. A., Collins, I. Measuring and interpreting the selectivity of protein kinase inhibitors. Journal of Chemical Biology. 2 (3), 131-151 (2009).
- Martinez Molina, D., et al. Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay. Science. 341 (6141), 84-87 (2013).
- Ericsson, U., Hallberg, B., Detitta, G., Dekker, N., Nordlund, P. Thermofluor-based high-throughput stability optimization of proteins for structural studies. Analytical Biochemistry. 357 (2), 289-298 (2006).
- McNulty, D. E., et al. A High-Throughput Dose-Response Cellular Thermal Shift Assay for Rapid Screening of Drug Target Engagement in Living Cells, Exemplified Using SMYD3 and IDO1. SLAS Discovery. 23 (1), 34-46 (2018).
- Romero, C., et al. A cellular target engagement assay for the characterization of SHP2 (PTPN11) phosphatase inhibitors. Journal of Biological Chemistry. 295 (9), 2601-2613 (2020).
- Ran, H., Tsutsumi, R., Araki, T., Neel, B. G. Sticking It to Cancer with Molecular Glue for SHP2. Cancer Cell. 30 (2), 194-196 (2016).
