Summary
Способность оценивать целевое участие ингибиторов-кандидатов в нетронутых клетках имеет решающее значение для обнаружения наркотиков. Этот протокол описывает 384 хорошо формат клеточного теплового сдвига анализ, который надежно обнаруживает клеточной целевой взаимодействия ингибиторов ориентации либо дикого типа SHP2 или его онкогенных вариантов.
Abstract
Src-гомология 2 (SH2) домен-содержащих фосфатазы 2 (SHP2), закодированный PTPN11 прото-онкоген, является ключевым посредником рецептора тирозин киназы (RTK) управляемых клеточной сигнализации, содействие выживанию клеток и распространения. Кроме того, SHP2 набирается рецепторами иммунной точки проверки для ингибирования активации B и Т-клеток. Аномальные функции SHP2 был вовлечен в развитие, прогрессирование и метастазы многих видов рака. Действительно, небольшие молекулы SHP2 ингибиторы недавно вступили в клинические испытания для лечения твердых опухолей с Ras / Raf / ERK активации пути, в том числе опухолей с некоторыми онкогенных мутаций Рас. Тем не менее, текущий класс ингибиторов SHP2 не эффективен против онкогенных вариантов SHP2, которые часто встречаются при лейкемии, и развитие конкретных малых молекул, нацеленных на онкогенный SHP2, является предметом текущих исследований. Распространенной проблемой большинства кампаний по открытию лекарств с участием цитозоловых белков, таких как SHP2, является то, что первичные анализы, которые управляют химическим открытием, часто являются анализами в пробирке, которые не сообщают о клеточном целевом участии соединений кандидатов. Чтобы обеспечить платформу для измерения активности клеточных целевых, мы разработали как дикий тип, так и мутант SHP2 сотовых тепловых сдвиг анализов. Эти анализы надежно обнаруживают целевое взаимодействие ингибиторов SHP2 в клетках. Здесь мы предоставляем всеобъемлющий протокол этого анализа, который является ценным инструментом для оценки и характеристики ингибиторов SHP2.
Introduction
Тирозин фосфорилирование играет важную роль в трансдукции сигнала вклетках 1,,2. Эта пост-трансляционная модификация катализуется белковых тирозин-киназами (ПТК) и обращена вспять белковых тирозинфосфатов (ПТП). Таким образом, аномальные функции ПТК или ПТП приводит к многим наследственным или приобретенным заболеваниям человека3,,4,,5,,6. Src-гомология 2 (SH2) домен-содержащий фосфатазы 2 (SHP2) является широко выраженным не-рецептор типа PTP кодируется прото-онкоген PTPN117 и является ключевымрегулятором многочисленных физиологических процессов, которые включают трансдукции сигнала путем активации Ras/ Raf/ ERK, PI3K/Akt, или JAK/STATсигнализации пути 8. Как правило, активность SHP2 жестко регулируется для предотвращения аномальной сигнализации. В базальных условиях SHP2 автоматически блокируется своим N-терминалом SH2 домена, который блокирует доступ к активному сайту в области каталитической фосфатазы(рисунок 1A)9,10. После активации клеток, тирозин фосфорилированные связывающие белки набирают SHP2, заставляя его принять его активную конформацию, в которой активный сайт теперь доступен для своих субстратов. Во многих видах рака активность SHP2 повышена. Соматические усиления функции (GOF) мутации в PTPN11 были выявлены в основном при лейкемии и предотвращения связывания N-SH2 домена фосфатазы домена, в результате чего составно активны sHP2 (Рисунок 1B)11. Мутации germline GOF в PTPN11 отвечают за 50% случаев синдрома Нунана, расстройства развития с повышенным риском злокачественности12. В твердых опухолях, где мутации PTPN11 редки, более высокие уровни фосфорилированных связывающих белков приводят к повышенной активности SHP2(рисунок 1C). SHP2 также имеет важное значение для сигнализации иммунной контрольно-пропускной пункт, как контрольно-пропускные рецепторы, такие как BTLA или PD-1 набирать SHP2 для дефосфорилата ключевых сигнальных молекул, предотвращаяактивацию иммунных клеток 13,14,15.
Нацеливание PTPs с небольшими молекулами было проблемой, потому что активное место PTPs высоки сохранено и высоки поручено; ингибиторы, нацеленные на активный участок, часто являются мощными, но обладают плохой избирательностью и устной биодоступностью16,,17,,18,,19,,20,,21,,22. Действительно, многие сообщили SHP2 ингибиторы страдают от плохой избирательности и отсутствие эффективности в клетках23. В последнее время были зарегистрированы алостерические ингибиторы SHP2 с хорошей потенцией и отличной избирательностью (например, SHP09924 и RMC-455025)и вызвали новый интерес к ингибиторам SHP2. Соединения на основе SHP099 и RMC-4550 в настоящее время находятся в фазе I клинических испытаний для лечения твердых опухолей с рецептором тирозинкиназы (RTK)активации пути 26,27. Хотя новаторские, эти соединения являются неэффективными против многих из онкогенных мутантов SHP2, которые управляют лейкемогенезом в значительном числебольных раком крови 28,29,30. Это отсутствие потенции SHP099-как соединения к SHP2 онкогенных вариантов проистекает из их уникального алостерического механизма, так как они подавляют активность SHP2 путем связывания и стабилизации неактивной, закрытой конформации, которая нарушается в SHP2 мутантов. Кроме того, на основенедавнего доклада 31, адаптивной устойчивости механизмов у пациентов, лечения с SHP099-как ингибиторы вполне мыслимы. Следовательно, разработка ингибиторов SHP2 нового поколения, нацеленных на его активное, открытое состояние, является предметом интенсивных исследований.
Характеристика новых ингибиторов SHP2 в клетках является важным аспектом процесса оптимизации свинца. Критически, доказано целевое участие ингибитора в физиологических условиях обеспечивает дополнительный уровень уверенности в том, что ресурсы для лекарственной химии эффективно развернуты на соединениях с перспективной клеточной эффективностью. В прошлом было разработано несколько методов оценки привязки малых ингибиторов молекул к их целям, в первую очередь для белковых киназы32. Для разработки SHP2 клеточной целевой взаимодействия анализа, мы использовали сотовый тепловой сдвиг анализ33. Этот анализ, похожий на термальный сдвиг in vitro (PTS) дляанализа белков 34, отслеживает тепловую стабильность целевого белка, который обычно изменяется связыванием малых молекул. Первоначальный анализ является низкой пропускной способностью анализа, который использует антитела для количественной оценки целевых уровней белка. Кроме того, мы выбрали недавно сообщили вариант теплового сдвига анализ, который использует β-галактозидазы фермента фрагмента дополнения (EFC) анализ (Рисунок 2)35. Для этих экспериментов, белок интереса выражается в клетках как N- или C-терминал синтеза белка проведения расширенной ProLabel теги (ePL, 42 аминокислоты фрагмент β-галактозидазы). Клетки затем передаются в 384-хорошо PCR совместимых пластин и инкубируется с соединениями, представляющими интерес. Термоциклер используется для применения градиента температуры к клеткам, белки которых будут денатурировать и агрегировать по мере повышения температуры в зависимости от их тепловой стабильности. Способность соединения кандидата связывать и стабилизировать белок интереса приведет к повышенной тепловой стабильности этого белка. Таким образом, после лиза клеток, те помеченные белки, которые были стабилизированы соединением кандидата, останутся в растворе при более высоких температурах, чем помеченные белки клеток, инкубированных с контролем транспортного средства. Репортер фермента acceptor (EA) способен дополнить растворимые ePL-тегами белков, в результате чего обнаруживается β-галактозидазы деятельности с помощью люминесценции субстрата.
Недавно мы разработали надежный клеточный тепловой сдвиг анализ для дикого типа SHP2 (SHP2-WT) и частые SHP2 онкогенный вариант (SHP2-E76K) в миниатюрном формате 384-ну36. Здесь мы сообщаем подробный протокол этого анализа, который надежно обнаруживает целевое взаимодействие ингибиторами SHP2 в клетках и демонстрирует высокую степень корреляции между потенцией ингибитора и данными о клеточном тепловом сдвиге. Общий рабочий процесс анализа иллюстрируется на рисунке 3. Наша платформа использует N-терминированно помеченные полнометражные белки синтеза ePL-SHP2. Для генерации соответствующих pICP-ePL-N-SHP2-WT и pICP-ePL-N-SHP2-E76K выражения плазмидов, пожалуйста, обратитесь к нашей недавней публикации36. Этот анализ может быть выполнен с использованием теплового градиента для создания тепловых профилей SHP2 и определения температуры плавления SHP2 при наличии или отсутствии ингибитора. После того, как тепловые профили были установлены, он также может быть выполнен в изотермальных условиях, что позволяет ингибитор доза-ответ оценки. Оба типа экспериментов описаны ниже.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка клеточной культуры и реагентов
- Сформулируйте бутылку 500 мл средств роста с 10% сыворотки крупного рогатого скота плода, 1x антибиотиком/антимикотикой, 20 мМ HEPES и 1 м натрийным пируватом. Хранить при 4 градусов по Цельсию.
- Реагенты клеточного теплового сдвига оттепели (реагент EA, буфер лиза и субстрат) из замороженных оригинальных бутылок.
- Распределять реагенты и буфер в качестве 2 мл aliquots и хранить при -20 градусов по Цельсию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте замораживания/оттепели для воспроизводимости и используйте только тот объем реагента, необходимый для процедуры анализа.
2. Рост и обслуживание клеток HEK293T
- Получить низкий проход приверженец HEK293T клеток из крио хранения.
- Поддержание HEK293T клеток в средствах массовой информации роста при 37 кк, 5% CO2.
- Разделение ячеек каждые 4 дня в соотношении 1:14.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для лучшей производительности, HEK293T клетки не допускаются к прохождению более 25 раз.
3. Подготовка клеток HEK293T для преходящей трансфекции
- Отсоедините клетки HEK293T от 16 мл пластин с использованием 3 мл реагента клеточного отслоения.
- Разбавить 12 мл средств массовой информации роста. Соберите клетки путем центрифугации при 1400 х г в течение 4 мин.
- Повторное производство гранул в 10 мл средств роста. Измерьте концентрацию и жизнеспособность клеток с помощью трипан-голубого и клеточного счетчика.
- Плита 7.0 x 105 экспоненциально растущих heK293T клеток на колодец в 6 хорошо пластины культуры клеток примерно 24 ч до трансфекции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Зарезервировать один колодец для каждого плазмида, чтобы быть трансфицированы. - Инкубационный в течение 24 ч при 37 градусов по Цельсию, 5% CO2.
4. Трансфекция клеток HEK293T
- Из очищенного плазмидного запаса pICP-ePL-N-SHP2-WT или pICP-ePL-N-SHP2-E76K (200 нг/Л) разбавляют 2 мкг плазмидной ДНК в 200 л трансфектического буфера.
- Вихрь на 10 с и центрифугу при 1400 х г в течение 4 мин.
- Добавьте 4 МКЛ трансфектного реагента в разбавленную ДНК. Вихрь на 10 с и центрифугу при 1400 х г в течение 4 мин.
- Инкубировать при 23 градусов по Цельсию в течение 10 мин.
- Удалите 6 хорошо пластины, содержащие растущие HEK293T клеток из инкубатора. Добавьте смесь трансфекции к прикрепленным клеткам в пластине 6-хорошо. Инкубационный для 24 ч при 37 градусов по Цельсию, 5% CO2.
5. Подготовка анализных пластин
- Подготовка 10 мМ фондовых решений в DMSO соединений для тестирования.
- Распределять растворы ингибитора в 384-ну низкой мертвой пластины источника объема для немедленного использования.
- Определить желаемый объем ингибиторов или транспортного средства (DMSO) с помощью жидкого обработчика в 384-ну в режиме реального времени ПЦР пластин на целевой конечный объем менее 0,5% DMSO (v/v). Печать пластины с помощью пластины герметика с инертной очистки газа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для анализа дозы ингибитора, убедитесь, что backfill DMSO соответственно, так что равное количество DMSO используются для каждой концентрации ингибитора. Для получения наилучших результатов храните тарелки при 23 градусах Цельсия и используйте пластины в пределах 24 ч.
6. Трансфицированный клеточный отряд и подготовка
- Предустановляют средства роста и реагент клеточного отслоения в водяной бане 37 градусов по Цельсию. Удалите трансфектные клетки из инкубатора. Аккуратно аспирировать средства массовой информации из колодцев пластины.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте новый аспиратор для каждой колодец, который содержит различные трансфицированные плазмиды. - Добавьте 0,3 мл реагента клеточного отслоения. Аккуратно раскачивайте пластину вперед и назад, чтобы тщательно покрыть поверхность дна пластины. Инкубировать при 23 градусов по Цельсию в течение 2 мин.
- Добавьте 1 мл средств роста к каждой хорошо. Аккуратно пипетки и клетки в колодец и передать в 15 мл Сокол центрифуги трубки. Соберите клетки путем центрифугации при 1400 х г в течение 4 мин.
- Аккуратно, но тщательно аспирировать от средств массовой информации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Остаточный фенол красный в реагенте отслоения клетки может помешать анализу. - Тщательно resuspend ячейки гранулы в 2 мл средств массовой информации роста. Измерьте концентрацию и жизнеспособность клеток с помощью трипан-голубого и клеточного счетчика.
ПРИМЕЧАНИЕ: Жизнеспособность клеток должна быть на 90% выше для наилучших результатов. - Разбавить клетки до концентрации 125 клеток/КЛ. Например, для анализа 5 МКЛ это 625 ячеек/йл. Для оптимальной жизнеспособности держите клетки в подвеске не более 2 ч.
7. Инкубация клеток ингибиторами SHP2
- Распределять клетки в стерильный одноканальные растворы корыта.
- Центрифуга 384-хорошо в режиме реального времени ПЦР пластины, которая была x g предварительно подготовлена SHP2 ингибитор осаждения на 2500 х г в течение 5 мин при 23 градусов по Цельсию.
- Снимите уплотнение с составной пластины. Используя многоканальный пипетку 125 МКЛ, добавьте 5 МКЛ разбавленных ячеек в нужные скважины.
- Центрифуга пластины на 42 х г на 30 с без крышки на пластине. Прикрепите уплотнение крышки к пластине после того, как пластина закружилась вниз и инкубировать анализ пластины при 37 градусов по Цельсию, 5% CO2 для 1 ч.
8. Подготовка смеси химлюминесцентных реагентов
- Удалите необходимое количество реагентов обнаружения (реагент EA, буфер лиза и субстрат) из хранилища -20 градусов по Цельсию после покрытия ячеек. Реагенты оттепели при 23 градусах Цельсия.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для удобства при передаче подготовьте объем, который в 1,5x от общего объема ячеек, которые были депонированы на тарелку. Не используйте реагенты повторно после использования. - Подготовьте мастер-микс реагентов с использованием состояния EA-10, которое состоит из компонента и фракции объема следующим образом: реагент EA (0,17), буфер лиза (0,17), субстрат (0,67).
ПРИМЕЧАНИЕ: Коэффициенты реагентов основаны на экспериментах по оптимизации, выполненных, как указано в руководстве поставщика.
9. Изотермальный или тепловой профиль градиентного теплового импульса
- Запрограммировать градиент способный термоциклер для доставки теплового импульса.
- Для экспериментов с градиентом теплового профиля предварительно программируйте термоциклер со следующими спецификациями:
- Тепловой импульс: 3 мин желаемой температуры плавления (вертикальный или горизонтальный градиент No/- 15 градусов по Цельсию; пример 38-68 градусов по Цельсию, разбросанный по 24 скважинам, дает температуру приращения 1,25 градусов по Цельсию).
- Шаг восстановления эквилибрации: 3 мин 20 градусов по Цельсию со скоростью рампы
- Для изотермальных экспериментов настроить протокол, установленный следующим образом:
- Тепловой пульс: 3 мин. 55 градусов по Цельсию. Шаг восстановления эквилибрации: 3 мин 20 градусов по Цельсию со скоростью рампы
ПРИМЕЧАНИЕ: Для повышенной воспроизводимости, так как это может быть трудно разместить пластину именно в то время, когда термоциклер достигает желаемой температуры, настроить программу, чтобы отсчитать 15 с до начала 3 мин импульса. Для термоциклера, используемого в этом эксперименте, см. Таблицуматериалов, крышка держится во время теплового импульса.
10. Обнаружение и измерение лиза
- Дополнение анализных пластин с лизом обнаружения мастер смеси путем добавления равных объемов (5 йл) к каждой хорошо для анализа с помощью многоканальной пипетки.
- Центрифуга пластины 42 х г на 30 с. Хранить при 23 градусов по Цельсию в темноте в течение 30-60 мин.
- Измерьте хемилюминесценцию с помощью микропластиного считыватель, способный обнаруживать люминесценцию в формате 384-колодец. Выполните измерение люминесценции с оптимизированным типом пластины и оптимизированным временем интеграции (время интеграции 1000 мс, время схладения 0 с). Измерьте значения как количество/ы и выход для дальнейшего анализа.
11. Анализ данных
- Проанализируйте данные люминесценции с помощью научного программного обеспечения для 2D-графики и статистики.
- Создание тепловых профилей путем анализа нормализованных данных о люминесценции (нормализованных для управления транспортным средством) с использованием нелинейной регрессии и сигмоидной модели Больцмана.
ПРИМЕЧАНИЕ: В тепловых экспериментов профиля, рассчитывается V50, температура, которая является на полпути между нижней и верхней части кривой, определяет температуру плавления SHP2. В изотермальных экспериментах EC50 определяет концентрацию ингибитора, который дает полу максимальную реакцию.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Тепловой градиентный эксперимент для SHP2-WT привел к сигмоидно-клеточному тепловому профилю с узким плавильным переходом, который является типичным и последовательным для сложенногобелка (рисунок 4A). SHP2 состоит из трех независимых доменов: двух доменов SH2 и каталитического домена(рисунок 1). В autoinhibited закрытой конформации эти домены self-associate; переход плавления, наблюдаемый в эксперименте с тепловым профилем, предположительно отражал это состояние в клетке. Инкубация SHP2-WT с алостерическим ингибитором SHP099 при 10 МКМ стабилизировала тепловой профиль SHP2-WT до значительной и измеримой степени(рисунок 4A). Это отражает известный режим связывания SHP099-как ингибиторы, которые действуют как "молекулярныйклей" 37 между нормативно-правовой привязки SH2 доменов и каталитических подразделений. Важно отметить, что наш анализ клеточного теплового сдвига подтвердил, что SHP099 может проникать в клетку и связываться с помеченным SHP2-WT. Стабилизация SHP2 также отслеживается с потенцией SHP099-как алостерические соединения. На 10 МКМ, более мощный RMC-4550 (сообщается IC50 и 0,6 нМ) производится большая степень стабилизации, чем SHP099(сообщается IC 50 и 70 nM) для SHP2-WT (Рисунок 4B).
Мы наблюдаем различное поведение в тепловом профиле анализа взаимодействия цели с онкогенным мутантом SHP2-E76K(рисунок 4C). Тепловой профиль для SHP2-E76K имеет плавильный переход, который является менее узким, отражая дестабилизацию, придаваемую третичной структуре SHP2 мутацией E76K, которая, как известно, нарушает взаимодействие между доменами SH2 и каталитической субъедицией. Таким образом, наблюдаемая температура плавления была снижена по сравнению с белком WT. Важно отметить, что при инкубации с алостерическим ингибитором SHP099 при 10 МКМ наблюдалась лишь маргинальная термальная стабилизация, в соответствии с известными свойствами SHP099 и аналогичнымиингибиторами 28,,29,,30.
Уровень экспрессии белка с тегами ePL, который необходимо исследовать, может значительно повлиять на интенсивность сигнала. Показано(рисунок 4D) являются тепловые профили для переходных и стабилически интегрированных SHP2-WT клеток при одинаковых условиях анализа. Нормализация этих разрозненных кривых обеспечивает сопоставимые тепловые профили(рисунок 4E),что указывает на широкий спектр системы обнаружения EFC. Важно отметить, что мы использовали как транзитонную трансфекцию, так и стабильную интеграцию SHP2, выражающем ячейки с сопоставимыми результатами. Для генерации стабильных клеточных линий следует отметить, что клетки HEK293, а не HEK293T клетки должны быть использованы, как HEK293T клетки уже имеют маркер устойчивости неомицина, что позволит предотвратить отбор клеток с интегрированной pICP-ePL-N-SHP2 плазмид, который содержит неомицин / канамицин резистентности гена для отбора в клетках млекопитающих.
Для получения измерения дозы ингибитора-реакции, можно выполнить сложные титровать на клетках в изотермальных условиях. Для этого мы предлагаем сначала определить оптимальную температуру для этих измерений. Воспользовавшись способностью термоциклера производить тепловые градиенты на «короткой» оси пластины из 384 хорошо, на одной пластине можно выработать ряд изотермальных титров. На рисунке 5A показаны репрезентативные результаты этой оптимизации для SHP2-WT с использованием ограниченной пятио пункта дозы ответа RMC-4550. Температуры, которые были слишком низкими, чтобы денатуратура белка производится высокий сигнал, который был независим от препарата. Аналогичным образом, температуры, которые были слишком высоки, не позволили соединения для стабилизации белка. Тем не менее, при оптимальной температуре, как это определено в этом эксперименте, изотермальная титровация с использованием полной 10-тоной дозы ответ дал полезный EC50 для RMC-4550 (Рисунок 5B). В дополнение к репрезентативным данным, показанным здесь, мы определили, что эксперименты с использованием оптимизированных изотермальных условий могут быть использованы для эффективного экрана новых ингибиторов SHP2 для их способности пересекать клеточные мембраны и заниматься своей целью вклетках 36.
Рисунок 1: Регулирование деятельности SHP2.
(A)Активность SHP2 жестко регулируется в нормальных клетках. В базальных условиях, его N-терминал SH2 домена затмевает активный сайт в phosphatase (PTP) домена, в результате чего автоижение. Фактор роста RTK и стимуляция цитокинов приводит к фосфорилации тирозина белков адаптера, которые затем связываются с доменами SH2, вызывая конформационные изменения, в результате которых активный сайт SHP2 становится доступным для своих субстратов. (B) Соматические мутации SHP2, часто встречающиеся при лейкемии, расположены на стыке доменов N-SH2 и фосфатазы и предотвращают принятие SHP2 закрытой, аутоихибитной конформации, что приводит к составной активной фосфатазе. (C)При твердых опухолях усиление или переэкспрессия факторов роста, РТК или строительных лесов приводят к аномальной активации SHP2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Принципы клеточного теплового сдвига SHP2.
Наша клеточная целевая вовлеченность основана на анализе β-галактозидазы (β-гал) ферментной комплементации (EFC). Клетки (HEK293T), выражают полнометражный SHP2 с тегом синтеза ePL (42 аминокислотный фрагмент β-gal), обрабатываются соединением зонда и подвергаются короткому тепловому импульсу, который вызывает денатуратуру SHP2 и формирует недоступные нерастворимые агрегаты, делая тег ePL недоступным. Специфическое связывание соединения зонда с SHP2 может повысить его тепловую устойчивость. Тепловая стабилизация обеспечивает более растворимый целевой белок с тегом ePL для дополнения в системе хемилюминесценции фермента репортера. Агрегаты приводят к снижению комплементации и люминесценции. Эта цифра была изменена с ref.36. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Миниатюрный рабочий процесс оборудования SHP2.
Регулярное выполнение анализа делает использование оборудования указано. Анализные пластины готовятся с использованием акустического жидкого обработчика, который обеспечивает нанолитровые объемы соединений. Передача клеток может быть выполнена вручную, с помощью многоканальной пипетки, или с помощью автоматического дозатора жидкости. Денатурация теплового импульса использует термоциклер, который может доставить тепловые градиенты на пластину из 384 колодец. Для обнаружения химического считывателя β-гал EFC. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Клеточное целевое взаимодействие алостерических ингибиторов SHP2 с белками SHP2-WT и SHP2-E76K.
(A)Белок SHP2-WT в присутствии транспортного средства (DMSO, красный) произвел хорошо себя клеточный тепловой профиль с узким переходом плавления в соответствии со сложенным белком в состоянии аутоихибита. Инкубация экспресс-клеток SHP2-WT с 10 МКМ SHP099 стабилизировала белок в связанном состоянии (синий). (B)Сотовые целевые взаимодействия тепловых профилей SHP2-WT в отсутствие (красный) или наличие SHP099-как алостерический ингибитор RMC-4550 (10 МКМ, синий). RMC-4550 произвел повышенную клеточную стабилизацию SHP2-WT, чем это наблюдалось для SHP099. Это увеличение целевого взаимодействия треков с его большей биохимической потенции. (C) Мутант SHP2-E76K имел менее выраженную кривую плавления в соответствии с состоянием, которое в значительной степени находится в "открытой" активной форме (красный). SHP099 при температуре плавления SHP2-E76K (синий), что в согласии с биохимическим ингибированием и данными клеточной эффективности. (D)Наблюдаемый сигнал хемилюминесценции соответствует уровню экспрессии ePL-SHP2. По сравнению с переходно трансфицированными клетками HEK293T, клетки HEK293, в которых ePL с тегами SHP2-WT были стабилико интегрированы в геном, имели пониженный уровень экспрессии ePL-SHP2. Следовательно, необработанные ненормальные тепловые профили химилюминесценции показали значительно сниженный сигнал люминесценции для стабилизированных клеток HEK293 (синий) по сравнению с переходно трансфицированными клетками HEK293 (красный). E) Нормализация необработанных данных хемилюминесценции для стабильных (HEK293) и переходно трансфектированных (HEK293T) производила сопоставимые тепловые профили, показывая чувствительность измерений. Точки данных и бары ошибок (±SD) представляют собой дубликаты измерений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Сотовая целевая вовлеченность изотермальная доза-ответ анализ для SHP2-WT.
(A)Для того, чтобы установить оптимальные изотермальные условия для оценки дозозависимых целевых обязательств ингибиторов SHP2, тепловой градиент через короткую ось 384-хорошо пластины впервые выполняется. Это позволяет эффективно оценить пятиофициардную дозу-реакцию ингибиторов (RMC-4550; 0.08-10 МКМ) для определения оптимальной температуры. (B)Полная клеточная изотермальная доза-ответ (10-точка) для RMC-4550 при оптимальной температуре 56 градусов по Цельсию. EC50 при такой температуре указано. Точки данных и бары ошибок (± SD) представляют собой четырехкратные измерения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы представили анализ целевого взаимодействия, который может подтвердить прямую привязку малых молекул к фосфатазе SHP2 в клетках. Анализ может различать ингибиторы низкого и высокого сродства и, что важно, подтвердить отсутствие потенции со стороны алостерических ингибиторов типа SHP099 для онкогенного мутанта GOF SHP2-E76K. Сила этого миниатюрного анализа заключается в его способности быть интегрированы в SHP2 ингибитор скрининга кампании. Способность анализа подтвердить внутриклеточную привязку к SHP2 неизвестным химическим веществом является важным потенциалом для обеспечения эффективного использования ресурсов скрининга. В целом миниатюрный протокол является надежным и надежным.
Важнейшим аспектом анализа является время; лучшие результаты получены 24 ч после трансфекции клеток HEK293T. Белки SHP2-WT и SHP2-E76K не выглядят токсичными; однако долгосрочное высокое выражение может снизить чувствительность эксперимента и потребует повторной оптимизации. Тщательное обращение с клетками, чтобы отделить и подготовить их к анализу является дополнительным критическим соображением. Однако стандартных методов клеточной культуры достаточно для получения высококачественных данных. Мы включили ряд этапов центрифугации в рабочий процесс из-за небольших объемов, используемых в этом анализе. Эти шаги имеют целью обеспечить количественное смешивание, поэтому рекомендуется придерживаться ускорения и времени центрифугации. Следует отметить, что анализ реагентов может пострадать после плохого обращения. Поэтому мы рекомендуем, чтобы они были aliquoted и хранятся замороженные до использования.
Наиболее часто встречающихся проблем в производительности этого анализа является неустойчивой (шумный) или низкой люминесценции сигнала. Чтобы определить источник этой проблемы, это рутина для выполнения западного анализа пятно на трансфицированных HEK293T клеток с использованием анти-ePL антител для обеспечения надежного уровня экспрессии SHP2-WT и SHP2-E76K. Мы получили наилучшие результаты, используя протокол реагента, изложенный в шаге 4. После создания условий трансфекции и получения одного запаса плазмидной экспрессии SHP2 мы обнаружили, что анализ является весьма надежным.
Разработка анализа требует оптимизации хемилюминесцентного сигнального окна для обеспечения надежных результатов. Для оптимизации окна анализа наиболее важным параметром является формула мастер-микса реагентов обнаружения, как описано в руководстве поставщика. Эта оптимизация осуществляется путем систематического изменения реагента советника на коэффициент субстрата в основной смеси, в то время как компонент буфера лиза остается неизменным (четыре различных условия, как правило, достаточны для этого измерения). В качестве фона служит условие с нулевым реагентом EA. Анализ выполняется, как описано выше, и рассчитывается отношение наблюдаемого сигнала к фону (S/B). Надежные результаты получаются, когда соотношение S/B составляет 50 евро. Мастер смеси условия, которые приводят к чрезвычайно высокий сигнал следует избегать, так как они приведут к истощению хемилюминесценции субстрата.
Потенциальным ограничением анализа является его чувствительность. По нашему опыту, ингибиторы с по крайней мере низкой микромоляной потенции в SHP2 фосфатазы ингибирования анализы необходимы для производства измеримых эффектов в клеточной тепловой сдвиг анализа. В качестве общего руководства, мы предлагаем сначала оценить кандидат соединений в пробирке ПТС анализы с использованием рекомбинантных SHP236. Основываясь на результатах нашей текущей программы открытия ингибитора SHP2, соединения способность сдвиг SHP2 температуры плавления in vitro треков хорошо с его способностью стабилизировать (или иногда дестабилизировать) SHP2 белка в клетках. Интересно, что относительная стабилизация SHP2-WT SHP099-как алостерические ингибиторы, как представляется, больше, чем вызвано столь же мощным SHP2 активных сайт-направленных ингибиторов, вероятно, отражает способность алостерических ингибиторов эффективно стабилизировать физиологически релевантные конформации белка SHP2-WT.
В дополнение к фосфатазе SHP2, мы приобрели опыт в разработке клеточной целевой взаимодействия анализы для других фосфатов и киназы. Основное соображение с другой целью белка заключается в использовании комбинации положительных и отрицательных контрольных экспериментов для установления достоверности анализа, прежде чем полностью поручать ресурсы для интерпретации данных связывания лиганда. Кроме того, существуют и другие технологии оценки целевого участия сотовой связи. Мы изучили ряд альтернатив для SHP2 phosphatase, но нашли этот анализ, чтобы быть весьма полезным в наших усилиях. Наконец, этот анализ не зависит от энзиматической активности SHP2 и поэтому позволяет проводить оценку и оптимизацию малых молекул без учета их режима связывания.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов с содержанием этой статьи.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения Грант 1R21CA195422 (К Л. Т.), Эпштейн Семьи Фонд премии (N. D. P.C.), и NCI онкологический центр Поддержка Грант P30CA030199. Кроме того, этот проект финансировался в целом или частично за счет федеральных средств Национального института рака, Национальных институтов здравоохранения, в соответствии с контрактом Консорциума химической биологии No. HHSN261200800001E. Содержание этой публикации не обязательно отражает мнения или политику Министерства здравоохранения и социальных служб, равно как и не упоминает торговые названия, коммерческие продукты или организации, подразумевающие одобрение правительством США. Содержание является исключительно ответственностью авторов и не обязательно отражает официальные взгляды Национальных институтов здравоохранения.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 384-well gradient equipped thermocycler | Eppendorf AG | X50h | |
| 384-well low dead volume microplate Echo qualified | Beckman Coulter, Inc. | LP-0200 | |
| 6-well cell culture plates | Greiner Bio-One | 657 160 | Sterile with lid |
| Antibiotic-Antimycotic (Anti Anti) 100 X | Thermo Fisher Scientific | 15240-062 | |
| Cell counter | Thermo Fisher Scientific | Countess II FL | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium 1X + GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 10566-016 | 500 mL |
| Echo acoustic liquid handler | Beckman Coulter, Inc. | Echo 550 | |
| Electronic multichannel pipette | Thermo Fisher Scientific | E1 ClipTip | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 26140-079 | 500 mL |
| HEPES buffer | Thermo Fisher Scientific | 15630-680 | 100 mL |
| InCell Pulse starter kit | Eurofins DiscoverX Corp. | 94-4007 | Components include EA buffer, lysis buffer, and substrate |
| Microplate reader | Tecan Trading AG | Spark | |
| Single channel solution trough | Thermo Fisher Scientific | S253012005 | |
| Sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360-010 | 100 mM |
| Thermal microplate sealer | Agilent Technologies, Inc. | PlateLoc | |
| Transfection reagents | Polyplus Transfection | jetPRIME | |
| Trypan blue | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| TrypLE Express reagent | Thermo Fisher Scientific | 12605-010 | |
| Twin.tec 384 real-time PCR plates | Eppendorf AG | 30132734 |
References
- Hunter, T. Tyrosine phosphorylation: thirty years and counting. Current Opinion in Cell Biology. 21 (2), 140-146 (2009).
- Alonso, A., et al.
- Cohen, P. Protein kinases-the major drug targets of the twenty-first century. Nature Reviews Drug Discovery. 1 (4), 309 (2002).
- Ferguson, F. M., Gray, N. S.
- Stanford, S. M., Bottini, N. Targeting Tyrosine Phosphatases: Time to End the Stigma. Trends in Pharmacological Sciences. 38 (6), 524-540 (2017).
- Tonks, N. Protein tyrosine phosphatases--from housekeeping enzymes to master regulators of signal transduction. FEBS Journal. 280 (2), 346-378 (2013).
- Chan, R., Feng, G. PTPN11 is the first identified proto-oncogene that encodes a tyrosine phosphatase. Blood. 109 (3), 862-867 (2007).
- Chan, G., Kalaitzidis, D., Neel, B. The tyrosine phosphatase Shp2 (PTPN11) in cancer. Cancer Metastasis Rev. 27 (2), 179-192 (2008).
- Hof, P., Pluskey, S., Dhe-Paganon, S., Eck, M., Shoelson, S. Crystal structure of the tyrosine phosphatase SHP-2. Cell. 92 (4), 441-450 (1998).
- Barford, D., Neel, B. Revealing mechanisms for SH2 domain mediated regulation of the protein tyrosine phosphatase SHP-2. Structure. 6 (3), 249-254 (1998).
- Neel, B. G., Chan, G., Dhanji, S. Handbook of Cell Signaling (Second Edition). 2, Academic Press. Amsterdam. 771-809 (2010).
- Tartaglia, M., et al. Mutations in PTPN11, encoding the protein tyrosine phosphatase SHP-2, cause Noonan syndrome. Nature Genetics. 29 (4), 465-468 (2001).
- Yokosuka, T., et al. Programmed cell death 1 forms negative costimulatory microclusters that directly inhibit T cell receptor signaling by recruiting phosphatase SHP2. Journal of Experimental Medicine. 209 (6), 1201-1217 (2012).
- Okazaki, T., Maeda, A., Nishimura, H., Kurosaki, T., Honjo, T. PD-1 immunoreceptor inhibits B cell receptor-mediated signaling by recruiting src homology 2-domain-containing tyrosine phosphatase 2 to phosphotyrosine. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (24), 13866-13871 (2001).
- Watanabe, N., et al. BTLA is a lymphocyte inhibitory receptor with similarities to CTLA-4 and PD-1. Nature Immunology. 4 (7), 670-679 (2003).
- Bialy, L., Waldmann, H. Inhibitors of protein tyrosine phosphatases: next-generation drugs. Angewandte Chemie International Edition England. 44 (25), 3814-3839 (2005).
- Kumar, S., Liang, F., Lawrence, D., Zhang, Z. Small molecule approach to studying protein tyrosine phosphatase. Methods. 35 (1), 9-21 (2005).
- Tautz, L., Pellecchia, M., Mustelin, T.
- Tautz, L., Mustelin, T. Strategies for developing protein tyrosine phosphatase inhibitors. Methods. 42 (3), 250-260 (2007).
- Vintonyak, V., Antonchick, A., Rauh, D., Waldmann, H. The therapeutic potential of phosphatase inhibitors. Current Opinion in Chemical Biology. 13 (3), 272-283 (2009).
- Barr, A. Protein tyrosine phosphatases as drug targets: strategies and challenges of inhibitor development. Future Medicinal Chemistry. 2 (10), 1563-1576 (2010).
- He, R., Zeng, L., He, Y., Zhang, S., Zhang, Z. Small molecule tools for functional interrogation of protein tyrosine phosphatases. FEBS Journal. 280, 731-750 (2012).
- Tsutsumi, R., Ran, H., Neel, B. G. Off-target inhibition by active site-targeting SHP2 inhibitors. FEBS Open Biology. 8 (9), 1405-1411 (2018).
- Chen, Y. N., et al. Allosteric inhibition of SHP2 phosphatase inhibits cancers driven by receptor tyrosine kinases. Nature. 535 (7610), 148-152 (2016).
- Nichols, R. J., et al. RAS nucleotide cycling underlies the SHP2 phosphatase dependence of mutant BRAF-, NF1- and RAS-driven cancers. Nature Cell Biology. 20 (9), 1064-1073 (2018).
- Clinical Trial NCT03114319. , Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03114319?term=NCT03114319_rank=1 (2019).
- Clinical Trial NCT03634982. , Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03114319?term=NCT03634982_rank=1 (2019).
- Sun, X., et al. Selective inhibition of leukemia-associated SHP2(E69K) mutant by the allosteric SHP2 inhibitor SHP099. Leukemia. 32 (5), 1246-1249 (2018).
- LaRochelle, J. R., et al. Structural reorganization of SHP2 by oncogenic mutations and implications for oncoprotein resistance to allosteric inhibition. Nature Communication. 9 (1), 4508 (2018).
- Padua, R. A. P., et al. Mechanism of activating mutations and allosteric drug inhibition of the phosphatase SHP2. Nature Communication. 9 (1), 4507 (2018).
- Lu, H., et al. Resistance to allosteric SHP2 inhibition in FGFR-driven cancers through rapid feedback activation of FGFR. Oncotarget. 11 (3), 265-281 (2020).
- Smyth, L. A., Collins, I. Measuring and interpreting the selectivity of protein kinase inhibitors. Journal of Chemical Biology. 2 (3), 131-151 (2009).
- Martinez Molina, D., et al. Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay. Science. 341 (6141), 84-87 (2013).
- Ericsson, U., Hallberg, B., Detitta, G., Dekker, N., Nordlund, P. Thermofluor-based high-throughput stability optimization of proteins for structural studies. Analytical Biochemistry. 357 (2), 289-298 (2006).
- McNulty, D. E., et al. A High-Throughput Dose-Response Cellular Thermal Shift Assay for Rapid Screening of Drug Target Engagement in Living Cells, Exemplified Using SMYD3 and IDO1. SLAS Discovery. 23 (1), 34-46 (2018).
- Romero, C., et al. A cellular target engagement assay for the characterization of SHP2 (PTPN11) phosphatase inhibitors. Journal of Biological Chemistry. 295 (9), 2601-2613 (2020).
- Ran, H., Tsutsumi, R., Araki, T., Neel, B. G. Sticking It to Cancer with Molecular Glue for SHP2. Cancer Cell. 30 (2), 194-196 (2016).
