تعميم خطوط الخلايا السرطانية: أداة مبتكرة للبحوث الأساسية والترجمة
Summary
يسمح زرع CTCs بتوصيف وظيفي أعمق للسرطان ، من خلال قياس تعبير علامة محددة ، وتقييم مقاومة الدواء والقدرة على استعمار الكبد من بين إمكانيات أخرى. وعموما، يمكن أن تكون ثقافة لجنة مكافحة الإرهاب أداة سريرية واعدة للطب الشخصي لتحسين نتائج المرضى.
Abstract
الانبثاث هو السبب الرئيسي للوفاة بالسرطان. على الرغم من التحسينات في استراتيجيات العلاج، فإن السرطان النقيلي لديه تشخيص ضعيف. وبالتالي فإننا نواجه حاجة ملحة لفهم الآليات الكامنة وراء تطور الانبثاث، وبالتالي اقتراح علاجات فعالة للسرطان المتقدم. من الصعب علاج السرطانات النقيلية ، حيث أن الخزعات غازية ولا يمكن الوصول إليها. في الآونة الأخيرة ، كان هناك اهتمام كبير في الخزعات السائلة بما في ذلك كل من حمض deoxyribonucleic المتداول الخالي من الخلايا (DNA) وتعميم الخلايا السرطانية من الدم المحيطي وأنشأنا العديد من خطوط الخلايا السرطانية المتداولة من مرضى سرطان القولون والمستقيم النقيلي للمشاركة في توصيفها. في الواقع، لوصف هذه الخلايا النادرة وغير الموصوفة بشكل جيد، فإن الخطوة الحاسمة هي توسيعها. بمجرد تأسيسها ، يمكن بعد ذلك زراعة خطوط الخلايا السرطانية المتداولة (CTC) في ظروف التعليق أو التمسك. وعلى المستوى الجزيئي، يمكن استخدام خطوط CTC لتقييم التعبير عن علامات محددة ذات أهمية (مثل التمايز أو الخلايا الجذعية الظهارية أو السرطانية) عن طريق التحليل المناعي أو تحليل قياس الخلايا. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام خطوط CTC لتقييم حساسية الأدوية للعلاج الكيميائي القياسي الذهبي وكذلك للعلاجات المستهدفة. ويمكن أيضا اختبار قدرة خطوط لجنة مكافحة الإرهاب على بدء الأورام عن طريق الحقن تحت الجلد من CTCs في الفئران المناعية.
وأخيرا، من الممكن اختبار دور جينات محددة ذات أهمية قد تشارك في نشر السرطان عن طريق تحرير جينات CTC، عن طريق حمض ريبونوكليك دبوس الشعر القصير (shRNA) أو Crispr/Cas9. وبالتالي يمكن حقن CTCs المعدلة في طحال الفئران المناعية ، لمحاكاة جزء من عملية التطوير النقيلي في الجسم الحي.
في الختام، خطوط CTC هي أداة ثمينة للبحوث المستقبلية والطب الشخصي، حيث أنها سوف تسمح التنبؤ بكفاءة العلاج باستخدام الخلايا نفسها التي هي في الأصل مسؤولة عن الانبثاث.
Introduction
على الرغم من التحسينات الأخيرة في التشخيص المبكر للسرطان وفي الاستراتيجية العلاجية ، لا يزال أكثر من تسعين في المئة من مراضة السرطان بسبب الانبثاث1. العملية النقيلية هي سلسلة متعددة الخطوات تبدأ بالانفصال المحلي للخلايا عن الورم الأساسي ودخولها إلى مجرى الدم حيث تصبح خلايا ورم متداولة (CTCs) لاستعمار مواقع بعيدة في النهاية مثل الكبد والرئتين ، في حالة سرطان القولون والمستقيم (CRC)2. في الآونة الأخيرة ، كان هناك اهتمام متزايد بال خزعات السائل ، والتي هي أداة غير الغازية للكشف بشكل ملحوظ وعدد CTCs من عينات دم المريض. التغايرية الوراثية داخل الرحم هو سبب رئيسي لمقاومة المخدرات. وبالتالي، عزل الخلايا التمثيلية من مادة الورم يشكل أداة واعدة للطب الشخصي3.
على الرغم من انخفاض وتيرة CTCs في الدم (1 CTC لكل 106 –10 7 الكريات البيض)4، تم تطوير العديد من تقنيات الكشف والعزل على أساس اختلافات الممتلكات بين CTCs والمكونات الأخرى للدم5. عدد CTCs في عينات دم المريض، وحدها، يمكن أن توفر معلومات عن مرحلة الأورام الخبيثة، والاستجابة للعلاج وتطور المرض6،7. وبالتالي، فإن عزلة CTC هي أداة حاسمة للدراسات التحويلية لتقييم التغاير الوراثي أو إجراء فحص الأدوية، وكذلك للدراسات الأساسية لتوصيف هذه الخلايا الغازية، لأنها الجهات الفاعلة الرئيسية في الحث النقيلي8،9. في الواقع ، بالمقارنة مع خطوط الخلايا السرطانية الراسخة تجاريا التي تراكمت الآلاف من الطفرات مع مرور الوقت ، تشترك CTCs الطازجة في السمات الرئيسية للورم الأساسي الأصلي بما في ذلك القدرة القوية على الانبثاث ، وهي انعكاس أفضل للمرض. هذه الميزات تجعلها أداة قوية للدراسات الأساسية ، وخاصة في تجارب خروج المغلوب من العوامل الرئيسية المتوقعة المشاركة في الانبثاث. يمكن التحقق من نتائج هذه التجارب في الجسم الحي، على الفئران ، كما هو موضح أدناه.
بمجرد عزل CTCs ، يمكن توسيعها في ظروف الثقافة غير الملتزمة ومن ثم ، يمكن التلاعب بها تماما مثل أي خط خلايا سرطان متاح ، أي يمكن استزراعها على قدم المساواة في ظروف التمسك أو تضمينها في Matrigel ، اعتمادا على السؤال العلمي10. على سبيل المثال، لاختبار التعبير عن البروتين ذي الاهتمام وتوطينه، يمكن زراعة مجالات CTC في حالة تعليق وتضمينها في Histogel لأداء الفلورة المناعية على أقسام المجال. بالإضافة إلى ذلك ، إذا كان البروتين ميمبرانوس ، يمكن قياس تعبيره على الخلايا الحية عن طريق القياس الخلوي.
للدراسات الوظيفية، لاختبار دور البروتين من الفائدة التي قد تلعب دورا في استعمار الكبد، CTCs مع الجينات تحريرها، من قبل shRNA أو CRISPR/Cas9، يمكن حقنها في طحال الفئران المناعية. هذه التجربة الأخيرة هي نموذج قوي لمحاكاة استعمار انبثاث الكبد11.
يمكن تقييم قدرة CTCs على بدء الأورام عن طريق حقن عدد قليل جدا من الخلايا في الفئران التي تعاني من نقص المناعة. كما بدء الورم هو السمة المميزة للخلايا الجذعية السرطانية (CSCs) هذا الفحص سوف تشير إلى النسبة المئوية للCSCs داخل خطوط CTC. هذا النمط الظاهري للخلايا الجذعية يجعل خطوط الخلايا السرطانية المتداولة مقاومة لبعض علاجات السرطان ذات المعيار الذهبي. ولذلك يمكن استخدام أجهزة CTCs الموسعة لفحص الأدوية وتحديد أفضل علاج فعال محتمل للمريض؛ ويمكن اختبار استجابة لجنة مكافحة الإرهاب للعلاج في المختبر باستخدام اختبار قابلية البقاء على الاشتعال، على سبيل المثال.
ومن منظور طويل الأجل، يمكن استخدام فحص الأدوية على أجهزة CTCs المعزولة والمتضخمة حديثا كأداة جديدة للطب الشخصي للمساعدة في اختيار العلاج الأكثر كفاءة وتكييفا للمرضى.
في هذه الورقة، يتم تفصيل بروتوكولات لخطوط CTC الثقافة، لتلطيخ بروتينات محددة عن طريق التصبغ المناعي والقياس الخلوي، لإجراء اختبارات السمية الخلوية وكذلك في تجارب فيفو زينوغرافت مع CTC.
Protocol
Representative Results
Discussion
تم استخدام البروتوكول المذكور أعلاه في البداية لتوصيف وظيفي للجنة مكافحة الإرهاب القولون والمستقيم ، ولكن يمكن استخدامه لأنواع أخرى من السرطان مثل سرطان الثدي ويمكن تكييفه لنماذج الماوس.
العامل الحقيقي هو الحد من عدد من CTCs موجودة في عينة الدم وكفاءة التقنية المستخدمة لعز?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
هذا المشروع البحثي في مختبر Pannequin كان مدعوما بمنحة بحثية من SIRIC: منحة « INCa-DGOS-Inserm 6045 ». تم دعم أطروحات الدكتوراه لغيوم بلتيير وزيناب هومايد من قبل رابطة مكافحة السرطان / Ligue contre le Cancer. وتم تمويل راتب سيلين بوكلييه من قبل “منطقة أوكسيتاني”. بفضل جوليان فينابلز للتحرير الإنجليزية.
Materials
| Accumax solution | Sigma-Aldrich | A7089 | |
| Advanced DMEM/F-12 | Gibco | 12634028 | |
| CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay | Promega | G7570 | |
| Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | Corning | 354230 | |
| Costar 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, | Corning | 3473 | |
| Histiogel Specimen Medium | LabStorage | HG-4000 | |
| Human EGF, premium grade | Miltenyi Biotec | 130-097-751 | |
| Human FGF-2, premium grade | Miltenyi Biotec | 130-093-564 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030081 | |
| N-2 Supplement | Gibco | 17502048 | |
| Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL) | Gibco | 15070063 |
Riferimenti
- Wittekind, C., Neid, M. Cancer invasion and metastasis. Oncology. 69, 14-16 (2005).
- Eger, A., Mikulits, W. Models of epithelial-mesenchymal transition. Drug Discovery Today: Disease Models. 2, 57-63 (2005).
- Palmirotta, R., et al. Liquid biopsy of cancer: a multimodal diagnostic tool in clinical oncology. Therapeutic Advances in Medical Oncology. 10, (2018).
- Hong, B., Zu, Y. Detecting circulating tumor cells: current challenges and new trends. Theranostics. 3, 377-394 (2013).
- vander Toom, E. E., Verdone, J. E., Gorin, M. A., Pienta, K. J. Technical challenges in the isolation and analysis of circulating tumor cells. Oncotarget. 7, 62754-62766 (2016).
- Jin, L., et al. Evaluation of the diagnostic value of circulating tumor cells with CytoSorter® CTC capture system in patients with breast cancer. Cancer Medicine. 9, 1638-1647 (2020).
- Huang, X., et al. Relationship between circulating tumor cells and tumor response in colorectal cancer patients treated with chemotherapy: a meta-analysis. BMC Cancer. 14, 976 (2014).
- Yu, M., et al. Ex vivo culture of circulating breast tumor cells for individualized testing of drug susceptibility. Science. 345, 216-220 (2014).
- Aceto, N., et al. Circulating Tumor Cell Clusters are Oligoclonal Precursors of Breast Cancer Metastasis. Cell. 158, 1110-1122 (2014).
- Grillet, F., et al. Circulating tumour cells from patients with colorectal cancer have cancer stem cell hallmarks in ex vivo culture. Gut. 66, 1802-1810 (2017).
- Lee, W. Y., Hong, H. K., Ham, S. K., Kim, C. I., Cho, Y. B. Comparison of Colorectal Cancer in Differentially Established Liver Metastasis Models. Anticancer Research. 34, 3321-3328 (2014).
- Giraud, J., et al. Progastrin production transitions from Bmi1+/Prox1+ to Lgr5high cells during early intestinal tumorigenesis. Translational Oncology. 14, (2020).
- Xu, L., et al. Optimization and Evaluation of a Novel Size Based Circulating Tumor Cell Isolation System. PLoS One. 10, 0138032 (2015).
- Beije, N., Jager, A., Sleijfer, S. Circulating tumor cell enumeration by the CellSearch system: the clinician’s guide to breast cancer treatment. Cancer Treatment Reviews. 41, 144-150 (2015).
- Karabacak, N. M., et al. Microfluidic, marker-free isolation of circulating tumor cells from blood samples. Nature Protocols. 9, 694-710 (2014).
- Ozkumur, E., et al. Inertial Focusing for Tumor Antigen-Dependent and -Independent Sorting of Rare Circulating Tumor Cells. Science Translational Medicine. 5, (2013).
