קווי תאים סרטניים במחזור: כלי חדשני למחקר יסודי ותרגום
Summary
Culturing CTCs מאפשר אפיון תפקודי עמוק יותר של סרטן, באמצעות הבעת ביטוי סמן ספציפי, והערכת עמידות לתרופות ואת היכולת ליישב את הכבד בין אפשרויות אחרות. בסך הכל, תרבות CTC יכולה להיות כלי קליני מבטיח לרפואה מותאמת אישית כדי לשפר את תוצאות המטופל.
Abstract
גרורות היא הגורם המוביל למוות מסרטן. למרות השיפורים באסטרטגיות הטיפול, לסרטן גרורתי יש פרוגנוזה ירודה. לכן אנו מתמודדים עם צורך דחוף להבין את המנגנונים העומדים מאחורי התפתחות גרורות, ובכך להציע טיפולים יעילים לסרטן מתקדם. סרטן גרורתי קשה לטיפול, כמו ביופסיות הם פולשניים ולא נגישים. לאחרונה, יש כבר עניין רב ביופסיות נוזליות כולל הן ללא תאים במחזור חומצה deoxyribonucleic (DNA) ו במחזור תאים סרטניים מדם היקפי הקמנו מספר קווי תאים סרטניים במחזור מחולי סרטן המעי הגס גרורתי להשתתף באפיון שלהם. ואכן, כדי לאפיין מבחינה תפקודית תאים נדירים אלה המתוארים בצורה גרועה, הצעד המכריע הוא להרחיב אותם. לאחר שנקבע, קווי תאים סרטניים במחזור (CTC) אז ניתן לתרבות בתנאים השעיה או דבקות. ברמה המולקולרית, ניתן להשתמש בקווי CTC כדי להעריך את הביטוי של סמנים ספציפיים של עניין (כגון בידול, אפיתל או תאי גזע סרטניים) על ידי אימונופלואורסצנטיות או ניתוח ציטומטריה. בנוסף, ניתן להשתמש בקווי CTC כדי להעריך את רגישות הסמים לכימותרפיה בתקן הזהב, כמו גם טיפולים ממוקדים. היכולת של קווי CTC ליזום גידולים יכולה להיבדק גם על ידי הזרקה תת עורית של CTCs בעכברים חיסוניים.
לבסוף, ניתן לבדוק את התפקיד של גנים ספציפיים של עניין שעשויים להיות מעורבים בהפצת סרטן על ידי עריכת גנים CTC, על ידי חומצה ריבונוקלאית סיכת ראש קצרה (shRNA) או Crispr / Cas9. CTCs שונה ולכן ניתן להזריק לתוך טחול עכבר חיסוני, כדי לחקות באופן ניסיוני חלק מתהליך הפיתוח גרורתי ב vivo.
לסיכום, קווי CTC הם כלי יקר למחקר עתידי ולרפואה מותאמת אישית, שם הם יאפשרו חיזוי של יעילות הטיפול באמצעות אותם תאים האחראים במקור על גרורות.
Introduction
למרות השיפורים האחרונים באבחון מוקדם של סרטן ובאסטרטגיה טיפולית, יותר מתשעים אחוזים מהתחלואה בסרטן עדיין נובעת מחילוד1. התהליך גרורתי הוא מפל רב-שלבי שמתחיל בניתוק מקומי של תאים מהגידול הראשי ובכניסתם למחזור הדם שם הם הופכים לתאי גידול במחזור (CTCs) כדי ליישב סוף סוף אתרים מרוחקים כגון כבד וריאות, במקרה של סרטן המעי הגס (CRC)2. לאחרונה, יש כבר הגדלת תשומת הלב ביופסיות נוזליות, שהם כלי לא פולשני במיוחד לזהות ולפרום CTCs מדגימות דם המטופל. הטרוגניות גנטית תוך-אטומית היא הגורם העיקרי לעמידות לתרופות; לכן, בידוד תאים מייצגים מחומר הגידול מהווה כלי מבטיח לרפואה מותאמת אישית3.
למרות תדירות נמוכה של CTCs בדם (1 CTC לכל 106 – 107 לויקוציטים)4,מספר טכניקות גילוי ובידוד פותחו בהתבסס על הבדלי רכוש בין CTCs ורכיבים אחרים של הדם5. מספר CTCs בדגימות דם חולים, לבד, יכול לספק מידע על שלב הממאירות, תגובת הטיפול והתקדמות המחלה6,7. לכן, בידוד CTC הוא כלי חיוני למחקרים תרגומיים כדי להעריך הטרוגניות גנטית או לבצע הקרנת סמים, כמו גם עבור מחקרים בסיסיים לאפיין תאים פולשניים אלה, כפי שהם השחקנים העיקריים של אינדוקציה גרורתית8,9. ואכן, בהשוואה לקווי תאים סרטניים שהוקמו מסחרית שצברו אלפי מוטציות לאורך זמן, CTCs טריים חולקים את התכונות העיקריות של הגידול הראשוני המקורי כולל יכולת חזקה גרורות, והם השתקפות טובה יותר של המחלה. תכונות אלה הופכות אותם לכלי חזק למחקרים בסיסיים, במיוחד בניסויי נוקאאוט של גורמי מפתח צפויים המעורבים גרורות. התוצאה של ניסויים אלה ניתן לאמת ב vivo, על עכברים, כפי שתואר להלן.
ברגע CTCs מבודדים, הם יכולים להיות מורחבים בתנאי תרבות שאינם דבקים ולאחר מכן, הם יכולים להיות מניפולציה בדיוק כמו כל קו תאים סרטניים זמין, כלומר הם יכולים להיות מתורבתים באותה מידה בתנאים דבקים או מוטבע מטריגל, בהתאם לשאלה המדעית10. לדוגמה, כדי לבדוק את הביטוי ואת לוקליזציה של חלבון של עניין, ספירות CTC ניתן לגדל במצב השעיה להיות מוטבע היסטוגל לבצע אימונופלואורסצנטיות על קטעי כדור. בנוסף, אם החלבון הוא membranous, הביטוי שלה על תאים חיים יכול להימדד על ידי ציטומטריה.
עבור מחקרים פונקציונליים, כדי לבדוק את התפקיד של חלבון של עניין שעשוי לשחק תפקיד קולוניזציה בכבד, CTCs עם גנים שנערכו, על ידי shRNA או CRISPR / Cas9, ניתן להזריק לתוך הטחול של עכברים חיסוניים. ניסוי זה האחרון הוא מודל רב עוצמה לחקות גלאוניזציה גרורות בכבד11.
היכולת של CTCs ליזום גידולים ניתן להעריך על ידי הזרקת מספר קטן מאוד של תאים לתוך עכברים אימונו לקוי. כמו חניכת הגידול הוא סימן ההיכר של תאי גזע סרטניים (CSCs) זה מציין את אחוז CSCs בתוך קווי CTC. פנוטיפ תאי גזע זה הופך את קווי תאי הגידול במחזור לעמידים בפני כמה טיפולים בסרטן בתקן זהב. CTCs מורחבים ולכן ניתן להשתמש כדי לסנן תרופות ולהצביע על הטיפול היעיל הפוטנציאלי הטוב ביותר עבור המטופל; תגובת CTC לטיפול ניתן לבדוק במבחנה באמצעות בדיקת כדאיות luminescence, למשל.
בראייה ארוכת טווח, הקרנת תרופות על CTCs מבודדים ומוגברים טריים יכולה לשמש ככלי חדש לרפואה מותאמת אישית כדי לסייע בבחירת הטיפול היעיל והמותאם ביותר לחולים.
במאמר הנוכחי, פרוטוקולים לתרבות קווי CTC, להכתים חלבונים ספציפיים באמצעות חיסונים וציטומטריה, לבצע בדיקות ציטוטוקסיות, כמו גם בניסויים קסנוגרפט vivo עם CTC מפורטים.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול שתואר לעיל שימש בתחילה לאפיון תפקודי CTC המעי הגס, אך ניתן להשתמש בו לסוגים אחרים של סרטן כגון סרטן השד וניתן להתאים אותו לדגמי עכבר.
הגורם המגביל האמיתי הוא מספר CTCs נוכח מדגם הדם ואת היעילות של הטכניקה המשמשת לבודד ולהרחיב אותם. מספר טכניקות בידוד CTC תוארו בהתבסס על…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
פרויקט מחקר זה במעבדת Pannequin נתמך על ידי מענק מחקר מ- SIRIC: Grant « INCa-DGOS-Inserm 6045 ». תזות הדוקטורט של גיום בלטהייר וזאינב הומייד נתמכו על ידי הליגה נגד סרטן / הליגה נגד סרטן. משכורת סלין בוקלייה מומנה על ידי “אזור אוקסיטני”. תודה לג’וליאן ונאבלס על העריכה באנגלית.
Materials
| Accumax solution | Sigma-Aldrich | A7089 | |
| Advanced DMEM/F-12 | Gibco | 12634028 | |
| CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay | Promega | G7570 | |
| Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | Corning | 354230 | |
| Costar 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, | Corning | 3473 | |
| Histiogel Specimen Medium | LabStorage | HG-4000 | |
| Human EGF, premium grade | Miltenyi Biotec | 130-097-751 | |
| Human FGF-2, premium grade | Miltenyi Biotec | 130-093-564 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030081 | |
| N-2 Supplement | Gibco | 17502048 | |
| Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL) | Gibco | 15070063 |
Riferimenti
- Wittekind, C., Neid, M. Cancer invasion and metastasis. Oncology. 69, 14-16 (2005).
- Eger, A., Mikulits, W. Models of epithelial-mesenchymal transition. Drug Discovery Today: Disease Models. 2, 57-63 (2005).
- Palmirotta, R., et al. Liquid biopsy of cancer: a multimodal diagnostic tool in clinical oncology. Therapeutic Advances in Medical Oncology. 10, (2018).
- Hong, B., Zu, Y. Detecting circulating tumor cells: current challenges and new trends. Theranostics. 3, 377-394 (2013).
- vander Toom, E. E., Verdone, J. E., Gorin, M. A., Pienta, K. J. Technical challenges in the isolation and analysis of circulating tumor cells. Oncotarget. 7, 62754-62766 (2016).
- Jin, L., et al. Evaluation of the diagnostic value of circulating tumor cells with CytoSorter® CTC capture system in patients with breast cancer. Cancer Medicine. 9, 1638-1647 (2020).
- Huang, X., et al. Relationship between circulating tumor cells and tumor response in colorectal cancer patients treated with chemotherapy: a meta-analysis. BMC Cancer. 14, 976 (2014).
- Yu, M., et al. Ex vivo culture of circulating breast tumor cells for individualized testing of drug susceptibility. Science. 345, 216-220 (2014).
- Aceto, N., et al. Circulating Tumor Cell Clusters are Oligoclonal Precursors of Breast Cancer Metastasis. Cell. 158, 1110-1122 (2014).
- Grillet, F., et al. Circulating tumour cells from patients with colorectal cancer have cancer stem cell hallmarks in ex vivo culture. Gut. 66, 1802-1810 (2017).
- Lee, W. Y., Hong, H. K., Ham, S. K., Kim, C. I., Cho, Y. B. Comparison of Colorectal Cancer in Differentially Established Liver Metastasis Models. Anticancer Research. 34, 3321-3328 (2014).
- Giraud, J., et al. Progastrin production transitions from Bmi1+/Prox1+ to Lgr5high cells during early intestinal tumorigenesis. Translational Oncology. 14, (2020).
- Xu, L., et al. Optimization and Evaluation of a Novel Size Based Circulating Tumor Cell Isolation System. PLoS One. 10, 0138032 (2015).
- Beije, N., Jager, A., Sleijfer, S. Circulating tumor cell enumeration by the CellSearch system: the clinician’s guide to breast cancer treatment. Cancer Treatment Reviews. 41, 144-150 (2015).
- Karabacak, N. M., et al. Microfluidic, marker-free isolation of circulating tumor cells from blood samples. Nature Protocols. 9, 694-710 (2014).
- Ozkumur, E., et al. Inertial Focusing for Tumor Antigen-Dependent and -Independent Sorting of Rare Circulating Tumor Cells. Science Translational Medicine. 5, (2013).
