Les lignées cellulaires tumorales circulantes : un outil innovant pour la recherche fondamentale et translationnelle
Summary
La culture des CTC permet une caractérisation fonctionnelle plus profonde du cancer, en testant l’expression de marqueurs spécifiques et en évaluant la résistance aux médicaments et la capacité de coloniser le foie, entre autres possibilités. Dans l’ensemble, la culture du CCT pourrait être un outil clinique prometteur pour la médecine personnalisée afin d’améliorer les résultats pour les patients.
Abstract
Les métastases sont l’une des principales causes de décès par cancer. Malgré l’amélioration des stratégies de traitement, le cancer métastatique a un mauvais pronostic. Nous sommes donc confrontés à un besoin urgent de comprendre les mécanismes à l’origine du développement des métastases, et donc de proposer des traitements efficaces pour le cancer avancé. Les cancers métastatiques sont difficiles à traiter, car les biopsies sont invasives et inaccessibles. Récemment, il y a eu un intérêt considérable pour les biopsies liquides, y compris l’acide désoxyribonucléique circulant (ADN) sans cellules et les cellules tumorales circulantes du sang périphérique et nous avons établi plusieurs lignées cellulaires tumorales circulantes de patients atteints de cancer colorectal métastatique pour participer à leur caractérisation. En effet, pour caractériser fonctionnellement ces cellules rares et mal décrites, l’étape cruciale est de les étendre. Une fois établies, les lignées de cellules tumorales circulantes (CTC) peuvent ensuite être cultivées dans des conditions de suspension ou d’adhérence. Au niveau moléculaire, les lignées CTC peuvent également être utilisées pour évaluer l’expression de marqueurs d’intérêt spécifiques (tels que la différenciation, les cellules souches épithéliales ou cancéreuses) par immunofluorescence ou analyse cytométrique. En outre, les lignes CTC peuvent être utilisées pour évaluer la sensibilité des médicaments aux chimiothérapies de référence ainsi qu’aux thérapies ciblées. La capacité des lignées CTC à initier des tumeurs peut également être testée par injection sous-cutanée de CTC chez des souris immunodéficientes.
Enfin, il est possible de tester le rôle de gènes spécifiques d’intérêt qui pourraient être impliqués dans la dissémination du cancer en éditant les gènes CTC, par l’acide ribonucléique en épingle à cheveux court (shRNA) ou Crispr / Cas9. Des CTC modifiés peuvent ainsi être injectés dans des rates de souris immunodéficientes, pour imiter expérimentalement une partie du processus de développement métastatique in vivo.
En conclusion, les lignées CTC sont un outil précieux pour la recherche future et pour la médecine personnalisée, où elles permettront de prédire l’efficacité du traitement en utilisant les cellules mêmes qui sont à l’origine responsables des métastases.
Introduction
Malgré les améliorations récentes dans le diagnostic précoce du cancer et dans la stratégie thérapeutique, plus de quatre-vingt-dix pour cent de la morbidité cancéreuse est toujours due à des métastases1. Le processus métastatique est une cascade en plusieurs étapes qui commence par le détachement local des cellules de la tumeur primaire et leur entrée dans la circulation sanguine où elles deviennent des cellules tumorales circulantes (CTC) pour finalement coloniser des sites éloignés tels que le foie et les poumons, dans le cas du cancer colorectal (CCR)2. Récemment, on s’est de plus en plus intéressé aux biopsies liquides, qui sont un outil non invasif permettant notamment de détecter et de dénombrer les CTC à partir d’échantillons de sang de patients. L’hétérogénéité génétique intratumorale est une cause majeure de résistance aux médicaments; ainsi, isoler des cellules représentatives du matériel tumoral constitue un outil prometteur pour la médecine personnalisée3.
Malgré une faible fréquence de CTC dans le sang (1 CTC pour 106 – 107 leucocytes)4,plusieurs techniques de détection et d’isolement ont été développées sur la base de différences de propriété entre les CTC et d’autres composants du sang5. Le nombre de CTC dans les échantillons de sang de patients, seul, peut fournir des informations sur le stade de la malignité, la réponse au traitement et la progression de la maladie6,7. Ainsi, l’isolement du CTC est un outil crucial pour les études translationnelles permettant d’évaluer l’hétérogénéité génétique ou d’effectuer un dépistage médicamenteux, ainsi que pour les études fondamentales visant à caractériser ces cellules invasives, car elles sont les acteurs clés de l’induction métastatique8,9. En effet, par rapport aux lignées cellulaires cancéreuses commercialement établies qui ont accumulé des milliers de mutations au fil du temps, les CTC frais partagent les principales caractéristiques de la tumeur primaire d’origine, y compris une puissante capacité à métastaser, et ils sont un meilleur reflet de la maladie. Ces caractéristiques en font un outil robuste pour les études fondamentales, en particulier dans les expériences de knockout des facteurs clés prédits impliqués dans les métastases. Le résultat de ces expériences peut être validé in vivo,sur des souris, comme décrit ci-dessous.
Une fois les CTC isolés, ils peuvent être étendus dans des conditions de culture non adhérentes et ensuite, ils peuvent être manipulés comme n’importe quelle lignée cellulaire cancéreuse disponible, c’est-à-dire qu’ils peuvent également être cultivés dans des conditions adhérentes ou incorporés dans Matrigel, selon la question scientifique10. Par exemple, pour tester l’expression et la localisation d’une protéine d’intérêt, les sphères CTC peuvent être cultivées en suspension et être incorporées dans Histogel pour effectuer une immunofluorescence sur des sections de sphère. De plus, si la protéine est membraneuse, son expression sur les cellules vivantes peut être mesurée par cytométrie.
Pour les études fonctionnelles, afin de tester le rôle d’une protéine d’intérêt qui pourrait jouer un rôle dans la colonisation du foie, des CTC avec des gènes modifiés, par shRNA ou CRISPR/Cas9, peuvent être injectés dans la rate de souris immunodéficientes. Cette dernière expérience est un modèle puissant pour imiter la colonisation des métastases hépatiques11.
La capacité des CTC à initier des tumeurs peut être évaluée en injectant un très petit nombre de cellules dans des souris immunodéficientes. Comme l’initiation tumorale est une caractéristique des cellules souches cancéreuses (CSC), ce test indiquera le pourcentage de CSC dans les lignées CTC. Ce phénotype de cellules souches rend les lignées cellulaires tumorales circulantes résistantes à certaines thérapies anticancéreuses de référence. Les CTC élargis peuvent donc être utilisés pour dépister les médicaments et identifier le meilleur traitement efficace potentiel pour le patient; La réponse du CTC au traitement peut être testée in vitro à l’aide d’un test de viabilité de la luminescence, par exemple.
Dans une perspective à long terme, le dépistage de médicaments sur des CTC fraîchement isolés et amplifiés pourrait être utilisé comme un nouvel outil de médecine personnalisée pour aider à choisir le traitement le plus efficace et le plus adapté pour les patients.
Dans le présent article, les protocoles de culture de lignées CTC, de coloration de protéines spécifiques par immunocoloration et cytométrie, d’effectuer des tests de cytotoxicité ainsi que des expériences de xénogreffe in vivo avec CTC sont détaillés.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole décrit ci-dessus a été utilisé initialement pour la caractérisation fonctionnelle du CTC colorectal, mais il peut être utilisé pour d’autres types de cancer tels que le cancer du sein et peut être adapté pour des modèles murins.
Le véritable facteur limitant est le nombre de CTC présents dans l’échantillon de sang et l’efficacité de la technique utilisée pour les isoler et les étendre. Plusieurs techniques d’isolation CTC ont été décrites sur la base de …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce projet de recherche au laboratoire Pannequin a été soutenu par une subvention de recherche du SIRIC : Subvention « INCa-DGOS-Inserm 6045 ». Les thèses de doctorat de Guillaume Belthier et Zeinab Homayed ont été soutenues par la Ligue contre le Cancer. Le salaire de Céline Bouclier a été financé par la « région Occitanie ». Merci à Julian Venables pour le montage en anglais.
Materials
| Accumax solution | Sigma-Aldrich | A7089 | |
| Advanced DMEM/F-12 | Gibco | 12634028 | |
| CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay | Promega | G7570 | |
| Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | Corning | 354230 | |
| Costar 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, | Corning | 3473 | |
| Histiogel Specimen Medium | LabStorage | HG-4000 | |
| Human EGF, premium grade | Miltenyi Biotec | 130-097-751 | |
| Human FGF-2, premium grade | Miltenyi Biotec | 130-093-564 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030081 | |
| N-2 Supplement | Gibco | 17502048 | |
| Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL) | Gibco | 15070063 |
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