Zirkulierende Tumorzelllinien: ein innovatives Werkzeug für die Grundlagen- und Translationsforschung
Summary
Die Kultivierung von CTCs ermöglicht eine tiefere funktionelle Charakterisierung von Krebs, unter anderem durch die Untersuchung der spezifischen Markerexpression und die Bewertung der Arzneimittelresistenz und der Fähigkeit, die Leber zu besiedeln. Insgesamt könnte die CTC-Kultur ein vielversprechendes klinisches Werkzeug für die personalisierte Medizin sein, um das Patientenergebnis zu verbessern.
Abstract
Metastasierung ist eine der Hauptursachen für Krebstod. Trotz Verbesserungen der Behandlungsstrategien hat metastasierender Krebs eine schlechte Prognose. Wir stehen daher vor der dringenden Notwendigkeit, die Mechanismen hinter der Metastasenentwicklung zu verstehen und somit effiziente Behandlungen für fortgeschrittenen Krebs vorzuschlagen. Metastasierende Krebsarten sind schwer zu behandeln, da Biopsien invasiv und unzugänglich sind. In jüngster Zeit besteht ein erhebliches Interesse an Flüssigbiopsien, die sowohl zellfreie zirkulierende Desoxyribonukleinsäure (DNA) als auch zirkulierende Tumorzellen aus peripherem Blut umfassen, und wir haben mehrere zirkulierende Tumorzelllinien von patienten mit metastasierendem Dickdarmkrebs etabliert, um an ihrer Charakterisierung teilzunehmen. Um diese seltenen und schlecht beschriebenen Zellen funktionell zu charakterisieren, besteht der entscheidende Schritt darin, sie zu erweitern. Einmal etabliert, können zirkulierende Tumorzelllinien (CTC) dann in Suspensions- oder Adhärenzbedingungen kultiviert werden. Auf molekularer Ebene können CTC-Linien weiter verwendet werden, um die Expression spezifischer Marker von Interesse (wie Differenzierungs-, Epithel- oder Krebsstammzellen) durch Immunfluoreszenz- oder Zytometrieanalyse zu bewerten. Darüber hinaus können CTC-Linien verwendet werden, um die Arzneimittelempfindlichkeit gegenüber Goldstandard-Chemotherapien sowie gegenüber zielgerichteten Therapien zu beurteilen. Die Fähigkeit von CTC-Linien, Tumore zu initiieren, kann auch durch subkutane Injektion von CTCs in immundefiziente Mäuse getestet werden.
Schließlich ist es möglich, die Rolle spezifischer Gene von Interesse zu testen, die an der Krebsverbreitung beteiligt sein könnten, indem CTC-Gene, kurzhaarige Ribonukleinsäure (shRNA) oder Crispr/Cas9 bearbeitet werden. Modifizierte CTCs können somit in immundefiziente Mausmilzen injiziert werden, um einen Teil des metastatischen Entwicklungsprozesses in vivoexperimentell nachzuahmen.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass CTC-Linien ein wertvolles Werkzeug für die zukünftige Forschung und für die personalisierte Medizin sind, wo sie eine Vorhersage der Behandlungseffizienz mit genau den Zellen ermöglichen, die ursprünglich für die Metastasierung verantwortlich sind.
Introduction
Trotz jüngster Verbesserungen in der Krebsfrüherkennung und in der therapeutischen Strategie sind immer noch mehr als neunzig Prozent der Krebsmorbidität auf Metastasen zurückzuführen1. Der metastatische Prozess ist eine mehrstufige Kaskade, die mit der lokalen Ablösung von Zellen aus dem Primärtumor und ihrem Eintritt in den Blutkreislauf beginnt, wo sie zu zirkulierenden Tumorzellen (CTCs) werden, um schließlich entfernte Stellen wie Leber und Lunge zu besiedeln, im Falle von Darmkrebs (CRC)2. In letzter Zeit wächst die Aufmerksamkeit für Flüssigbiopsien, die ein nicht-invasives Werkzeug sind, um INSbesondere CTCs aus Patientenblutproben zu erkennen und aufzuzählen. Intratumor genetische Heterogenität ist eine Hauptursache für Arzneimittelresistenzen; Somit stellt die Isolierung repräsentativer Zellen aus Tumormaterial ein vielversprechendes Werkzeug für die personalisierte Medizin dar3.
Trotz der geringen Häufigkeit von CTCs im Blut (1 CTC pro 106 – 107 Leukozyten)4wurden mehrere Nachweis- und Isolationstechniken entwickelt, die auf Eigenschaftsunterschieden zwischen CTCs und anderen Bestandteilen des Blutes basieren5. Allein die Anzahl der CTCs in Patientenblutproben kann Aufschluss über das Stadium der Malignität, das Ansprechen auf die Behandlung und den Krankheitsverlauf geben6,7. Daher ist die CTC-Isolierung ein entscheidendes Instrument für translationale Studien zur Beurteilung der genetischen Heterogenität oder zur Durchführung von Arzneimittelscreenings sowie für grundlegende Studien zur Charakterisierung dieser invasiven Zellen, da sie die Schlüsselakteure der metastatischen Induktion sind8,9. Im Vergleich zu kommerziell etablierten Krebszelllinien, die im Laufe der Zeit Tausende von Mutationen angesammelt haben, teilen frische CTCs die Hauptmerkmale des ursprünglichen Primärtumors, einschließlich einer starken Fähigkeit zur Metastasierung, und sie spiegeln die Krankheit besser wider. Diese Eigenschaften machen sie zu einem robusten Werkzeug für grundlegende Studien, insbesondere in Knockout-Experimenten mit vorhergesagten Schlüsselfaktoren, die an der Metastasierung beteiligt sind. Das Ergebnis dieser Experimente kann in vivoan Mäusen validiert werden, wie unten beschrieben.
Sobald CTCs isoliert sind, können sie unter nicht-adhärenten Kulturbedingungen expandiert werden und dann können sie wie jede verfügbare Krebszelllinie manipuliert werden, d.h. sie können auch unter adhärenten Bedingungen kultiviert oder in Matrigel eingebettet werden, abhängig von der wissenschaftlichen Frage10. Um beispielsweise die Expression und Lokalisation eines interessierenden Proteins zu testen, können CTC-Kugeln in Suspensionszustand gezüchtet und in Histogel eingebettet werden, um Immunfluoreszenz auf Kugelabschnitten durchzuführen. Wenn das Protein membranös ist, kann seine Expression auf lebenden Zellen durch Zytometrie gemessen werden.
Um die Rolle eines interessierenden Proteins zu testen, das bei der Besiedlung der Leber eine Rolle spielen könnte, können CTCs mit Genen, die durch shRNA oder CRISPR/Cas9 bearbeitet wurden, in die Milz von immundefizienten Mäusen injiziert werden. Dieses letztgenannte Experiment ist ein leistungsfähiges Modell zur Nachahmung der Lebermetastasenkolonisation11.
Die Fähigkeit von CTCs, Tumore zu initiieren, kann beurteilt werden, indem eine sehr kleine Anzahl von Zellen in immundefiziente Mäuse injiziert wird. Da die Tumorinitiierung ein Kennzeichen von Krebsstammzellen (CSCs) ist, zeigt dieser Assay den Prozentsatz der CSCs innerhalb der CTC-Linien an. Dieser Stammzellphänotyp macht zirkulierende Tumorzelllinien resistent gegen einige Goldstandard-Krebstherapien. Erweiterte CTCs können daher verwendet werden, um Medikamente zu screenen und die beste potenzielle effiziente Behandlung für den Patienten zu ermitteln. Das Ansprechen von CTC auf die Behandlung kann in vitro beispielsweise mit einem Lumineszenz-Lebensfähigkeitstest getestet werden.
Langfristig könnte das Arzneimittelscreening auf frisch isolierten und amplifizierten CTCs als neues Werkzeug für die personalisierte Medizin eingesetzt werden, um bei der Auswahl der effizientesten und am besten angepassten Behandlung für Patienten zu helfen.
In der vorliegenden Arbeit werden Protokolle zur Kultivierung von CTC-Linien, zur Färbung spezifischer Proteine mittels Immunfärbung und Zytometrie, zur Durchführung von Zytotoxizitätsassays sowie in vivo Xenograft-Experimenten mit CTC detailliert beschrieben.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das oben beschriebene Protokoll wurde ursprünglich für die funktionelle Charakterisierung der kolorektalen CTC verwendet, kann jedoch für andere Krebsarten wie Brustkrebs verwendet und für Mausmodelle angepasst werden.
Der wirklich limitierende Faktor ist die Anzahl der in der Blutprobe vorhandenen CTCs und die Effizienz der Technik, mit der sie isoliert und expandiert werden. Mehrere CTC-Isolationstechniken wurden auf der Grundlage spezifischer CTC-Eigenschaften beschrieben, wie z.B. pars…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dieses Forschungsprojekt im Pannequin-Labor wurde durch ein Forschungsstipendium des SIRIC unterstützt: Grant « INCa-DGOS-Inserm 6045 ». Die Doktorarbeiten von Guillaume Belthier und Zeinab Homayed wurden von der Anti-Krebs-Liga/Ligue contre le Cancer unterstützt. Das Gehalt von Céline Bouclier wurde von der “Region Okzitanien” finanziert. Danke an Julian Venables für die englische Bearbeitung.
Materials
| Accumax solution | Sigma-Aldrich | A7089 | |
| Advanced DMEM/F-12 | Gibco | 12634028 | |
| CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay | Promega | G7570 | |
| Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | Corning | 354230 | |
| Costar 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, | Corning | 3473 | |
| Histiogel Specimen Medium | LabStorage | HG-4000 | |
| Human EGF, premium grade | Miltenyi Biotec | 130-097-751 | |
| Human FGF-2, premium grade | Miltenyi Biotec | 130-093-564 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030081 | |
| N-2 Supplement | Gibco | 17502048 | |
| Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL) | Gibco | 15070063 |
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