Linee cellulari tumorali circolanti: uno strumento innovativo per la ricerca fondamentale e traslazionale
Summary
La coltura di CTC consente una caratterizzazione funzionale più profonda del cancro, attraverso l’analisi dell’espressione di marcatori specifici e la valutazione della resistenza ai farmaci e della capacità di colonizzare il fegato tra le altre possibilità. Nel complesso, la cultura CTC potrebbe essere uno strumento clinico promettente per la medicina personalizzata per migliorare l’esito del paziente.
Abstract
Le metastasi sono una delle principali cause di morte per cancro. Nonostante i miglioramenti nelle strategie di trattamento, il cancro metastatico ha una prognosi sfavorevole. Ci troviamo quindi di fronte a un urgente bisogno di comprendere i meccanismi alla base dello sviluppo delle metastasi e quindi di proporre trattamenti efficaci per il cancro avanzato. I tumori metastatici sono difficili da trattare, poiché le biopsie sono invasive e inaccessibili. Recentemente, c’è stato un notevole interesse per le biopsie liquide che includono sia l’acido desossiribonucleico circolante privo di cellule (DNA) che le cellule tumorali circolanti dal sangue periferico e abbiamo stabilito diverse linee cellulari tumorali circolanti da pazienti con carcinoma colorettale metastatico per partecipare alla loro caratterizzazione. Infatti, per caratterizzare funzionalmente queste cellule rare e mal descritte, il passo cruciale è quello di espanderle. Una volta stabilite, le linee di cellule tumorali circolanti (CTC) possono quindi essere coltivate in condizioni di sospensione o aderenza. A livello molecolare, le linee CTC possono essere ulteriormente utilizzate per valutare l’espressione di specifici marcatori di interesse (come il differenziamento, le cellule staminali epiteliali o tumorali) mediante immunofluorescenza o analisi citometrica. Inoltre, le linee CTC possono essere utilizzate per valutare la sensibilità ai farmaci alle chemioterapie gold standard e alle terapie mirate. La capacità delle linee CTC di avviare i tumori può anche essere testata mediante iniezione sottocutanea di CTC in topi immunodeficienti.
Infine, è possibile testare il ruolo di specifici geni di interesse che potrebbero essere coinvolti nella disseminazione del cancro modificando i geni CTC, l’acido ribonucleico a forcina corta (shRNA) o Crispr/Cas9. Le CTC modificate possono quindi essere iniettate in milze di topo immunodeficienti, per imitare sperimentalmente parte del processo di sviluppo metastatico in vivo.
In conclusione, le linee CTC sono uno strumento prezioso per la ricerca futura e per la medicina personalizzata, dove permetteranno di prevedere l’efficienza del trattamento utilizzando proprio le cellule originariamente responsabili delle metastasi.
Introduction
Nonostante i recenti miglioramenti nella diagnosi precoce del cancro e nella strategia terapeutica, oltre il novanta per cento della morbilità del cancro è ancora dovuto alle metastasi1. Il processo metastatico è una cascata a più fasi che inizia con il distacco locale delle cellule dal tumore primario e il loro ingresso nel flusso sanguigno dove diventano cellule tumorali circolanti (CTC) per colonizzare infine siti distanti come fegato e polmoni, nel caso del cancro del colon-retto (CRC)2. Recentemente, c’è stata una crescente attenzione alle biopsie liquide, che sono uno strumento non invasivo per rilevare ed enumerare in particolare le CTC dai campioni di sangue dei pazienti. L’eterogeneità genetica intratumorale è una delle principali cause di resistenza ai farmaci; pertanto, isolare le cellule rappresentative dal materiale tumorale costituisce uno strumento promettente per la medicina personalizzata3.
Nonostante la bassa frequenza di CTC nel sangue (1 CTC per 106 – 107 leucociti)4, sono state sviluppate diverse tecniche di rilevamento e isolamento basate sulle differenze di proprietà tra CTC e altri componenti del sangue5. Il numero di CTC nei campioni di sangue dei pazienti, da solo, può fornire informazioni sullo stadio della malignità, sulla risposta al trattamento e sulla progressione della malattia6,7. Pertanto, l’isolamento CTC è uno strumento cruciale per gli studi traslazionali per valutare l’eterogeneità genetica o eseguire lo screening farmacologico, nonché per gli studi fondamentali per caratterizzare queste cellule invasive, in quanto sono gli attori chiave dell’induzione metastatica8,9. Infatti, rispetto alle linee cellulari tumorali commercialmente stabilite che hanno accumulato migliaia di mutazioni nel tempo, le CTC fresche condividono le caratteristiche principali del tumore primario originale, inclusa una potente capacità di metastatizzare e sono un riflesso migliore della malattia. Queste caratteristiche li rendono uno strumento robusto per studi fondamentali, specialmente negli esperimenti knockout di fattori chiave previsti coinvolti nelle metastasi. L’esito di questi esperimenti può essere validato in vivo,sui topi, come descritto di seguito.
Una volta isolati i CTC, possono essere espansi in condizioni di coltura non aderenti e quindi possono essere manipolati proprio come qualsiasi linea cellulare tumorale disponibile, cioè possono ugualmente essere coltivati in condizioni aderenti o incorporati in Matrigel, a seconda della domanda scientifica10. Ad esempio, per testare l’espressione e la localizzazione di una proteina di interesse, le sfere CTC possono essere coltivate in condizioni di sospensione ed essere incorporate in Histogel per eseguire immunofluorescenza su sezioni di sfera. Inoltre, se la proteina è membranosa, la sua espressione sulle cellule viventi può essere misurata mediante citometria.
Per gli studi funzionali, per testare il ruolo di una proteina di interesse che può svolgere un ruolo nella colonizzazione epatica, le CTC con geni modificati, da shRNA o CRISPR / Cas9, possono essere iniettate nella milza di topi immunodeficienti. Quest’ultimo esperimento è un potente modello per imitare la colonizzazione delle metastasiepatiche 11.
La capacità delle CTC di avviare tumori può essere valutata iniettando un numero molto piccolo di cellule in topi immuno-carenti. Poiché l’inizio del tumore è un segno distintivo delle cellule staminali tumorali (CSC), questo test indicherà la percentuale di CSC all’interno delle linee CTC. Questo fenotipo di cellule staminali rende le linee cellulari tumorali circolanti resistenti ad alcune terapie antitumorali gold standard. Le CTC espanse possono quindi essere utilizzate per lo screening dei farmaci e individuare il miglior trattamento potenzialmente efficiente per il paziente; La risposta CTC al trattamento può essere testata in vitro utilizzando, ad esempio, un test di vitalità a luminescenza.
In una prospettiva a lungo termine, lo screening farmacologico su CTC appena isolate e amplificate potrebbe essere utilizzato come nuovo strumento per la medicina personalizzata per aiutare a scegliere il trattamento più efficiente e adattato per i pazienti.
Nel presente articolo, i protocolli per la coltura di linee CTC, per colorare proteine specifiche tramite immunocolorazione e citometria, per eseguire saggi di citotossicità e esperimenti di xenotrapianto in vivo con CTC sono dettagliati.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo sopra descritto è stato utilizzato inizialmente per la caratterizzazione funzionale del CTC del colon-retto, ma può essere utilizzato per altri tipi di cancro come il cancro al seno e può essere adattato per modelli murini.
Il vero fattore limitante è il numero di CTC presenti nel campione di sangue e l’efficienza della tecnica utilizzata per isolarle ed espanderle. Sono state descritte diverse tecniche di isolamento CTC basate su specifiche proprietà CTC come il Parsortix, …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo progetto di ricerca nel laboratorio Pannequin è stato sostenuto da una borsa di ricerca del SIRIC: Grant « INCa-DGOS-Inserm 6045 ». Le tesi di dottorato di Guillaume Belthier e Zeinab Homayed sono state sostenute dalla lega anti-cancro / Ligue contre le Cancer. Lo stipendio di Céline Bouclier è stato finanziato dalla “regione Occitania”. Grazie a Julian Venables per l’editing in inglese.
Materials
| Accumax solution | Sigma-Aldrich | A7089 | |
| Advanced DMEM/F-12 | Gibco | 12634028 | |
| CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay | Promega | G7570 | |
| Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | Corning | 354230 | |
| Costar 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, | Corning | 3473 | |
| Histiogel Specimen Medium | LabStorage | HG-4000 | |
| Human EGF, premium grade | Miltenyi Biotec | 130-097-751 | |
| Human FGF-2, premium grade | Miltenyi Biotec | 130-093-564 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030081 | |
| N-2 Supplement | Gibco | 17502048 | |
| Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL) | Gibco | 15070063 |
Riferimenti
- Wittekind, C., Neid, M. Cancer invasion and metastasis. Oncology. 69, 14-16 (2005).
- Eger, A., Mikulits, W. Models of epithelial-mesenchymal transition. Drug Discovery Today: Disease Models. 2, 57-63 (2005).
- Palmirotta, R., et al. Liquid biopsy of cancer: a multimodal diagnostic tool in clinical oncology. Therapeutic Advances in Medical Oncology. 10, (2018).
- Hong, B., Zu, Y. Detecting circulating tumor cells: current challenges and new trends. Theranostics. 3, 377-394 (2013).
- vander Toom, E. E., Verdone, J. E., Gorin, M. A., Pienta, K. J. Technical challenges in the isolation and analysis of circulating tumor cells. Oncotarget. 7, 62754-62766 (2016).
- Jin, L., et al. Evaluation of the diagnostic value of circulating tumor cells with CytoSorter® CTC capture system in patients with breast cancer. Cancer Medicine. 9, 1638-1647 (2020).
- Huang, X., et al. Relationship between circulating tumor cells and tumor response in colorectal cancer patients treated with chemotherapy: a meta-analysis. BMC Cancer. 14, 976 (2014).
- Yu, M., et al. Ex vivo culture of circulating breast tumor cells for individualized testing of drug susceptibility. Science. 345, 216-220 (2014).
- Aceto, N., et al. Circulating Tumor Cell Clusters are Oligoclonal Precursors of Breast Cancer Metastasis. Cell. 158, 1110-1122 (2014).
- Grillet, F., et al. Circulating tumour cells from patients with colorectal cancer have cancer stem cell hallmarks in ex vivo culture. Gut. 66, 1802-1810 (2017).
- Lee, W. Y., Hong, H. K., Ham, S. K., Kim, C. I., Cho, Y. B. Comparison of Colorectal Cancer in Differentially Established Liver Metastasis Models. Anticancer Research. 34, 3321-3328 (2014).
- Giraud, J., et al. Progastrin production transitions from Bmi1+/Prox1+ to Lgr5high cells during early intestinal tumorigenesis. Translational Oncology. 14, (2020).
- Xu, L., et al. Optimization and Evaluation of a Novel Size Based Circulating Tumor Cell Isolation System. PLoS One. 10, 0138032 (2015).
- Beije, N., Jager, A., Sleijfer, S. Circulating tumor cell enumeration by the CellSearch system: the clinician’s guide to breast cancer treatment. Cancer Treatment Reviews. 41, 144-150 (2015).
- Karabacak, N. M., et al. Microfluidic, marker-free isolation of circulating tumor cells from blood samples. Nature Protocols. 9, 694-710 (2014).
- Ozkumur, E., et al. Inertial Focusing for Tumor Antigen-Dependent and -Independent Sorting of Rare Circulating Tumor Cells. Science Translational Medicine. 5, (2013).
