循环肿瘤细胞系：基础和转化研究的创新工具
Summary
培养CTC可以通过测定特异性标志物表达，评估耐药性和定植肝脏的能力以及其他可能性，对癌症进行更深层次的功能表征。总体而言，CTC培养可能是个性化医疗改善患者预后的良好临床工具。
Abstract
转移是癌症死亡的主要原因。尽管治疗策略有所改善，但转移性癌症的预后较差。因此，我们迫切需要了解转移发展背后的机制，从而为晚期癌症提出有效的治疗方法。转移性癌症很难治疗，因为活检是侵入性的和不可接近的。最近，人们对液体活检产生了相当大的兴趣，包括无细胞循环脱氧核糖核酸（DNA）和来自外周血的循环肿瘤细胞，我们已经建立了来自转移性结直肠癌患者的几种循环肿瘤细胞系，以参与其表征。事实上，为了在功能上表征这些罕见且描述不佳的细胞，关键步骤是扩增它们。一旦建立，循环肿瘤细胞（CTC）系就可以在悬浮或粘附条件下培养。在分子水平上，CTC谱系可以进一步用于通过免疫荧光或细胞术分析评估感兴趣的特定标志物（如分化，上皮或癌症干细胞）的表达。此外，CTC线可用于评估药物对金标准化疗以及靶向治疗的敏感性。CTC系启动肿瘤的能力也可以通过在免疫缺陷小鼠中皮下注射CTC来测试。
最后，可以通过编辑CTC基因，通过短发夹核糖核酸（shRNA）或Crispr / Cas9来测试可能参与癌症传播的特定基因的作用。因此，可以将修饰的CTC注射到免疫缺陷小鼠脾脏中，以实验方式模拟 体内转移发育过程的一部分。
总之，CTC线是未来研究和个性化医疗的宝贵工具，它们将允许使用最初负责转移的细胞来预测治疗效率。
Introduction
尽管最近在早期癌症诊断和治疗策略方面有所改善，但超过90%的癌症发病率仍然是由于转移1。转移过程是一个多步骤级联反应，从细胞从原发肿瘤的局部脱离开始，并进入血液，在那里它们成为循环肿瘤细胞（CTC），最终定植于远处的部位，如肝脏和肺部，在结直肠癌（CRC）的情况下2。最近，人们越来越关注液体活检，液体活检是一种非侵入性工具，可以显着检测和枚举患者血液样本中的CTC。肿瘤内遗传异质性是耐药性的主要原因;因此，从肿瘤材料中分离代表性细胞构成了个性化医疗的有前途的工具3。
尽管血液中CTC的频率较低（1 CTC/106 –10 7白细胞）4，但基于CTC与血液其他成分之间的性质差异，开发了几种检测和分离技术5。单独使用患者血液样本中的CTC数量可以提供有关恶性肿瘤分期，治疗反应和疾病进展的信息6，7。因此，CTC分离是转化研究评估遗传异质性或进行药物筛选的重要工具，也是表征这些侵入性细胞的基础研究的重要工具，因为它们是转移诱导的关键参与者8，9。事实上，与随着时间的推移积累了数千个突变的商业建立的癌细胞系相比，新鲜的CTC具有原始原发性肿瘤的主要特征，包括强大的转移能力，并且它们更好地反映了这种疾病。这些特征使它们成为基础研究的有力工具，特别是在转移所涉及的预测关键因素的敲除实验中。这些实验的结果可以在体内验证，在小鼠身上，如下所述。
一旦 CTC 被分离出来，它们就可以在非粘附培养条件下扩增，然后，它们可以像任何可用的癌细胞系一样纵，即它们同样可以在粘附条件下培养或嵌入在 Matrigel 中，这取决于科学问题10。例如，为了测试目标蛋白质的表达和定位，CTC球可以在悬浮状态下生长并嵌入组织凝胶中以对球体切片进行免疫荧光。此外，如果蛋白质是膜性的，则可以通过细胞术测量其在活细胞上的表达。
对于功能研究，为了测试可能在肝脏定植中起作用的感兴趣蛋白质的作用，可以将具有由shRNA或CRISPR / Cas9编辑的基因的CTC注射到免疫缺陷小鼠的脾脏中。后一个实验是模拟肝转移定植的强大模型11。
CTC启动肿瘤的能力可以通过将非常少量的细胞注射到免疫缺陷小鼠中来评估。由于肿瘤起始是癌症干细胞（CSCs）的标志，因此该测定将指示CTC系内CSC的百分比。这种干细胞表型使循环肿瘤细胞系对一些金标准癌症疗法具有抗药性。因此，扩展的CTC可用于筛查药物并为患者确定最佳的潜在有效治疗;例如，CTC对治疗的反应可以使用发光活力测定法在体外进行测试。
从长远来看，对新鲜分离和扩增的CTC进行药物筛选可以用作个性化医疗的新工具，以帮助为患者选择最有效和最合适的治疗方法。
在本文中，详细介绍了培养CTC系，通过免疫染色和细胞术染色特定蛋白质，进行细胞毒性测定以及CTC体内异种移植实验的方案。
Protocol
Representative Results
Discussion
上述方案最初用于结直肠CTC功能表征，但它可用于其他类型的癌症，如乳腺癌，并且可以适用于小鼠模型。
真正的限制因素是血液样本中存在的CTC的数量以及用于分离和扩增它们的技术的效率。已经根据特定的CTC特性描述了几种CTC分离技术，例如Parsortix，一种微流体装置，它允许根据细胞大小及其可压缩性分离CTC13。此外，还有CellSearch，这是一种基于免疫?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Pannequin实验室的这个研究项目得到了SIRIC的研究资助：授予« INCa-DGOS-Inserm 6045 »。Guillaume Belthier和Zeinab Homayed的博士论文得到了抗癌联盟/法甲联盟的支持。Céline Bouclier的薪水由”Occitanie地区”资助。感谢Julian Venables的英文编辑。
Materials
| Accumax solution | Sigma-Aldrich | A7089 | |
| Advanced DMEM/F-12 | Gibco | 12634028 | |
| CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay | Promega | G7570 | |
| Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | Corning | 354230 | |
| Costar 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, | Corning | 3473 | |
| Histiogel Specimen Medium | LabStorage | HG-4000 | |
| Human EGF, premium grade | Miltenyi Biotec | 130-097-751 | |
| Human FGF-2, premium grade | Miltenyi Biotec | 130-093-564 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030081 | |
| N-2 Supplement | Gibco | 17502048 | |
| Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL) | Gibco | 15070063 |
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