Líneas celulares tumorales circulantes: una herramienta innovadora para la investigación fundamental y traslacional
Summary
El cultivo de CTC permite una caracterización funcional más profunda del cáncer, a través del ensayo de la expresión de marcadores específicos, y la evaluación de la resistencia a los medicamentos y la capacidad de colonizar el hígado, entre otras posibilidades. En general, el cultivo de CTC podría ser una herramienta clínica prometedora para la medicina personalizada para mejorar el resultado del paciente.
Abstract
La metástasis es una de las principales causas de muerte por cáncer. A pesar de las mejoras en las estrategias de tratamiento, el cáncer metastásico tiene un mal pronóstico. Por lo tanto, nos enfrentamos a una necesidad urgente de comprender los mecanismos detrás del desarrollo de la metástasis y, por lo tanto, de proponer tratamientos eficientes para el cáncer avanzado. Los cánceres metastásicos son difíciles de tratar, ya que las biopsias son invasivas e inaccesibles. Recientemente, ha habido un interés considerable en las biopsias líquidas que incluyen tanto el ácido desoxirribonucleico circulante (ADN) libre de células como las células tumorales circulantes de sangre periférica y hemos establecido varias líneas celulares tumorales circulantes de pacientes con cáncer colorrectal metastásico para participar en su caracterización. De hecho, para caracterizar funcionalmente estas células raras y mal descritas, el paso crucial es expandirlas. Una vez establecidas, las líneas de células tumorales circulantes (CTC) se pueden cultivar en condiciones de suspensión o adherentes. A nivel molecular, las líneas CTC se pueden utilizar para evaluar la expresión de marcadores específicos de interés (como la diferenciación, las células madre epiteliales o cancerosas) mediante análisis de inmunofluorescencia o citometría. Además, las líneas ctC se pueden usar para evaluar la sensibilidad a los medicamentos a las quimioterapias estándar de oro, así como a las terapias dirigidas. La capacidad de las líneas ctc para iniciar tumores también se puede probar mediante inyección subcutánea de CTC en ratones inmunodeficientes.
Finalmente, es posible probar el papel de genes específicos de interés que podrían estar involucrados en la diseminación del cáncer mediante la edición de genes CTC, mediante ácido ribonucleico de horquilla corta (shRNA) o Crispr / Cas9. Por lo tanto, los CTC modificados se pueden inyectar en bazos de ratón inmunodeficientes, para imitar experimentalmente parte del proceso de desarrollo metastásico in vivo.
En conclusión, las líneas CTC son una herramienta valiosa para futuras investigaciones y para la medicina personalizada, donde permitirán predecir la eficiencia del tratamiento utilizando las mismas células que originalmente son responsables de la metástasis.
Introduction
A pesar de las recientes mejoras en el diagnóstico precoz del cáncer y en la estrategia terapéutica, más del noventa por ciento de la morbilidad por cáncer todavía se debe a la metástasis1. El proceso metastásico es una cascada de varios pasos que comienza con el desprendimiento local de las células del tumor primario y su entrada en el torrente sanguíneo donde se convierten en células tumorales circulantes (CTC) para finalmente colonizar sitios distantes como el hígado y los pulmones, en el caso del cáncer colorrectal (CCR)2. Recientemente, ha habido una creciente atención a las biopsias líquidas, que son una herramienta no invasiva para detectar y enumerar notablemente los CTC a partir de muestras de sangre de pacientes. La heterogeneidad genética intratumoral es una de las principales causas de resistencia a los medicamentos; por lo tanto, aislar células representativas del material tumoral constituye una herramienta prometedora para la medicina personalizada3.
A pesar de la baja frecuencia de CTC en la sangre (1 CTC por 106 – 107 leucocitos)4,se desarrollaron varias técnicas de detección y aislamiento basadas en diferencias de propiedad entre CTC y otros componentes de la sangre5. El número de CTC en las muestras de sangre de los pacientes, por sí solo, puede proporcionar información sobre la etapa de malignidad, la respuesta al tratamiento y la progresión de la enfermedad6,7. Así, el aislamiento ctc es una herramienta crucial para los estudios traslacionales para evaluar la heterogeneidad genética o realizar el cribado farmacológico, así como para los estudios fundamentales para caracterizar estas células invasoras, ya que son los actores clave de la inducción metastásica8,9. De hecho, en comparación con las líneas celulares de cáncer establecidas comercialmente que han acumulado miles de mutaciones a lo largo del tiempo, las CTC frescas comparten las características principales del tumor primario original, incluida una potente capacidad para hacer metástasis, y son un mejor reflejo de la enfermedad. Estas características los convierten en una herramienta robusta para estudios fundamentales, especialmente en experimentos knockout de factores clave predichos involucrados en la metástasis. El resultado de estos experimentos se puede validar in vivo, enratones, como se describe a continuación.
Una vez que los CTC están aislados, pueden expandirse en condiciones de cultivo no adherentes y luego, pueden manipularse como cualquier línea celular de cáncer disponible, es decir, pueden cultivarse igualmente en condiciones adherentes o incrustarse en Matrigel, dependiendo de la pregunta científica10. Por ejemplo, para probar la expresión y localización de una proteína de interés, las esferas ctc se pueden cultivar en condición de suspensión y se incrustan en Histogel para realizar inmunofluorescencia en secciones de esfera. Además, si la proteína es membranosa, su expresión en células vivas se puede medir por citometría.
Para estudios funcionales, para probar el papel de una proteína de interés que puede desempeñar un papel en la colonización hepática, se pueden inyectar CTC con genes editados, por shRNA o CRISPR / Cas9, en el bazo de ratones inmunodeficientes. Este último experimento es un modelo poderoso para imitar la colonización de metástasishepáticas 11.
La capacidad de los CTC para iniciar tumores se puede evaluar inyectando un número muy pequeño de células en ratones inmunodeficientes. Como la iniciación del tumor es un sello distintivo de las células madre cancerosas (CSC), este ensayo indicará el porcentaje de CSC dentro de las líneas de CTC. Este fenotipo de células madre hace que las líneas celulares tumorales circulantes sean resistentes a algunas terapias contra el cáncer estándar de oro. Por lo tanto, los CTC ampliados se pueden usar para detectar medicamentos e identificar el mejor tratamiento eficiente potencial para el paciente; La respuesta de CTC al tratamiento se puede probar in vitro utilizando un ensayo de viabilidad de luminiscencia, por ejemplo.
En una perspectiva a largo plazo, el cribado de fármacos en CTC recién aislados y amplificados podría utilizarse como una nueva herramienta para la medicina personalizada para ayudar a elegir el tratamiento más eficiente y adaptado para los pacientes.
En el presente trabajo se detallan protocolos para cultivar líneas ctc, para teñir proteínas específicas mediante inmunotinción y citometría, para realizar ensayos de citotoxicidad así como experimentos de xenoinjerto in vivo con CTC.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo descrito anteriormente se utilizó inicialmente para la caracterización funcional de ctC colorrectal, pero se puede usar para otros tipos de cáncer como el cáncer de mama y se puede adaptar para modelos de ratón.
El factor limitante real es el número de CTC presentes en la muestra de sangre y la eficiencia de la técnica utilizada para aislarlos y expandirlos. Se han descrito varias técnicas de aislamiento ctc basadas en propiedades específicas de CTC como el Parsortix, un …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este proyecto de investigación en el laboratorio Pannequin fue apoyado por una beca de investigación del SIRIC: Beca « INCa-DGOS-Inserm 6045 ». Las tesis doctorales de Guillaume Belthier y Zeinab Homayed fueron apoyadas por la liga anticancerígena/Ligue contre le Cancer. El salario de Céline Bouclier fue financiado por la “región Occitania”. Gracias a Julian Venables por la edición en inglés.
Materials
| Accumax solution | Sigma-Aldrich | A7089 | |
| Advanced DMEM/F-12 | Gibco | 12634028 | |
| CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay | Promega | G7570 | |
| Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | Corning | 354230 | |
| Costar 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, | Corning | 3473 | |
| Histiogel Specimen Medium | LabStorage | HG-4000 | |
| Human EGF, premium grade | Miltenyi Biotec | 130-097-751 | |
| Human FGF-2, premium grade | Miltenyi Biotec | 130-093-564 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030081 | |
| N-2 Supplement | Gibco | 17502048 | |
| Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL) | Gibco | 15070063 |
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