循環腫瘍細胞株:基礎的・翻訳的研究のための革新的なツール
Summary
CTCを培養することで、特定のマーカー発現をアッセリングし、薬剤耐性や肝臓を植民地化する能力を評価することによって、癌のより深い機能的特徴付けが可能になります。全体的に、CTC培養は、患者の転帰を改善するためのパーソナライズされた医療のための有望な臨床ツールである可能性があります。
Abstract
転移は癌死の主な原因である。治療戦略の改善にもかかわらず、転移性癌は予後が悪い。そこで、転移のメカニズムを理解し、進行癌に対して効率的な治療法を提案することが急務に直面する。転移性癌は、生検が侵襲的でアクセス不能であるため、治療が困難である。近年、末梢血から細胞を含まない循環性デオキシリボ核酸(DNA)と循環腫瘍細胞の両方を含む液体生検に大きな関心があり、転移性大腸癌患者からいくつかの循環腫瘍細胞株を確立し、その特性評価に参加しています。確かに、これらの稀で十分に記述されていない細胞を機能的に特徴付けるためには、重要なステップはそれらを拡大することです。一旦確立されると、循環腫瘍細胞(CTC)株は、懸濁または付着状態で培養することができる。分子レベルでは、CTCラインは、免疫蛍光または細胞測定分析による関心のある特定のマーカー(分化、上皮、癌幹細胞など)の発現を評価するためにさらに使用することができる。さらに、CTCラインは、ゴールドスタンダード化学療法および標的療法に対する薬物感受性を評価するために使用することができる。腫瘍を開始するCTCラインの能力は、免疫不全マウスにおけるCTCの皮下注射によっても試験することができる。
最後に、短いヘアピンリボ核酸(shRNA)またはCrispr/Cas9によってCTC遺伝子を編集することによって、癌の播種に関与する可能性のある特定の関心遺伝子の役割をテストすることが可能である。このようにして修飾CTCを免疫不全マウス脾臓に注入することができ、 インビボにおける転移開発プロセスの一部を実験的に模倣することができる。
結論として、CTCラインは、将来の研究とパーソナライズされた医療のための貴重なツールであり、もともと転移を担っている細胞を使用して治療効率を予測することができます。
Introduction
早期癌診断および治療戦略における最近の改善にもかかわらず、癌罹患率の90%以上は転移によるものである。転移過程は、原発腫瘍からの細胞の局所剥離と、それらが循環腫瘍細胞(CTC)となる血流への入り口から始まり、最終的に肝臓および肺などの遠方部位を植民地化する多段階カスケードである、大腸癌(CRC)2の場合。最近では、患者の血液サンプルからCTCを検出して列挙するための非侵襲的なツールである液体生検への注目が高まっています。腫瘍内の遺伝的不均一性は薬剤耐性の主要な原因である;したがって、代表的な細胞を腫瘍材料から分離することは、個別化医療3のための有望なツールを構成する。
血液中のCTCの低頻度(106-10 7白血球あたり1CTC)4にもかかわらず、CTCと血液5の他の成分との間の特性の違いに基づいていくつかの検出および分離技術が開発された。患者の血液サンプル中のCTCの数は、単独で、悪性腫瘍の段階、治療応答および疾患進行に関する情報を提供することができる6、7。したがって、CTC単離は、遺伝的不均一性を評価したり、薬物スクリーニングを行ったりするための翻訳研究や、転移誘導8,9の主要なアクターであるこれらの侵襲性細胞を特徴付けるための基礎的研究にとって重要なツールである。実際、時間の経過とともに何千もの突然変異を蓄積した商業的に確立された癌細胞株と比較して、新鮮なCTCは転移する強力な能力を含む元の原発性腫瘍の主な特徴を共有し、疾患のより良い反映である。これらの特徴は、特に転移に関与する予測された重要な要因のノックアウト実験において、基礎研究のための堅牢なツールです。これらの実験の結果は、以下に説明されるように、マウス上でインビボで検証することができる。
CTCが単離されると、それらは非接着性培養条件で拡大することができ、その後、それらは利用可能な癌細胞株と同じように操作することができ、すなわち、科学的な質問10に応じて、同じように接着状態で培養またはマトリゲルに埋め込むことができる。例えば、目的のタンパク質の発現および局在を試験するために、CTC球体を懸濁状態で増殖させ、ヒストゲルに埋め込んで球部に免疫蛍光を行うことができる。また、タンパク質が膜状であれば、生細胞に対するその発現は細胞測定によって測定することができる。
機能研究のために、肝コロニー形成に役割を果たす可能性のある目的のタンパク質の役割を試験するために、遺伝子を編集したCTCは、shRNAまたはCRISPR/Cas9によって、免疫不全マウスの脾臓に注入することができる。この後者の実験は、肝転移コロニー形成11を模倣する強力なモデルである。
CTCが腫瘍を開始する能力は、非常に少数の細胞を免疫欠損マウスに注入することによって評価することができる。腫瘍開始は癌幹細胞(CSC)の特徴であるため、このアッセイはCTCライン内のCSCの割合を示す。この幹細胞表現型は、循環腫瘍細胞株をいくつかのゴールドスタンダード癌療法に耐性にする。拡張されたCTCは、したがって、薬物をスクリーニングし、患者のための最良の潜在的な効率的な治療を特定するために使用することができます。治療に対するCTC応答は、例えば発光生存アッセイを用いてインビトロで試験することができる。
長期的な観点から、新たに単離され増幅されたCTCの薬物スクリーニングは、患者のための最も効率的で適応された治療法を選択するのに役立つパーソナライズされた医療のための新しいツールとして使用することができます。
本論文では、CTCラインを培養するためのプロトコル、免疫染色および細胞測定を介して特定のタンパク質を染色し、CTCを用いた生体内異種移植実験と同様に細胞傷害アッセイを行う方法が詳述されている。
Protocol
Representative Results
Discussion
上述のプロトコルは、最初は大腸CTC機能特性評価に使用されたが、乳癌などの他のタイプの癌に使用することができ、マウスモデルに適応することができる。
実際の制限要因は、血液サンプルに存在するCTCの数と、それらを分離および拡大するために使用される技術の効率です。いくつかのCTC分離技術は、Parsortixのような特定のCTC特性に基づいて記述されている、マイ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
パンヌキン研究室でのこの研究プロジェクトは、SIRICからの研究助成金によって支援されました: グラント « INCa-DGOS-Inserm 6045 » .ギヨーム・ベルトィエとゼイナブ・ホマイドの博士課程は、抗がんリーグ/リーグ・コントル・ル・ガンによって支えられました。セリーヌ・ブークリエの給与は「地域オクシタニー」によって資金提供されました。英語編集のためのジュリアン・ヴァナブルズに感謝します。
Materials
| Accumax solution | Sigma-Aldrich | A7089 | |
| Advanced DMEM/F-12 | Gibco | 12634028 | |
| CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay | Promega | G7570 | |
| Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | Corning | 354230 | |
| Costar 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, | Corning | 3473 | |
| Histiogel Specimen Medium | LabStorage | HG-4000 | |
| Human EGF, premium grade | Miltenyi Biotec | 130-097-751 | |
| Human FGF-2, premium grade | Miltenyi Biotec | 130-093-564 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030081 | |
| N-2 Supplement | Gibco | 17502048 | |
| Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL) | Gibco | 15070063 |
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