Circulerende tumorcellijnen: een innovatief hulpmiddel voor fundamenteel en translationeel onderzoek
Summary
Het kweken van CTC’s maakt een diepere functionele karakterisering van kanker mogelijk, door specifieke markerexpressie te testen en resistentie tegen geneesmiddelen en het vermogen om de lever te koloniseren te beoordelen, naast andere mogelijkheden. Over het algemeen zou de CTC-cultuur een veelbelovend klinisch hulpmiddel kunnen zijn voor gepersonaliseerde geneeskunde om de uitkomst van de patiënt te verbeteren.
Abstract
Metastase is een belangrijke doodsoorzaak van kanker. Ondanks verbeteringen in behandelingsstrategieën heeft uitgezaaide kanker een slechte prognose. We worden dus geconfronteerd met een dringende behoefte om de mechanismen achter de ontwikkeling van metastase te begrijpen en zo efficiënte behandelingen voor gevorderde kanker voor te stellen. Gemetastaseerde kankers zijn moeilijk te behandelen, omdat biopsieën invasief en ontoegankelijk zijn. Onlangs is er veel belangstelling geweest voor vloeibare biopsieën, waaronder zowel celvrij circulerend desoxyribonucleïnezuur (DNA) als circulerende tumorcellen uit perifeer bloed en we hebben verschillende circulerende tumorcellijnen van gemetastaseerde colorectale kankerpatiënten vastgesteld om deel te nemen aan hun karakterisering. Inderdaad, om deze zeldzame en slecht beschreven cellen functioneel te karakteriseren, is de cruciale stap om ze uit te breiden. Eenmaal vastgesteld, kunnen circulerende tumorcellijnen (CTC) vervolgens worden gekweekt in suspensie of aanhankelijke omstandigheden. Op moleculair niveau kunnen CTC-lijnen verder worden gebruikt om de expressie van specifieke markers van belang (zoals differentiatie, epitheliale of kankerstamcellen) te beoordelen door immunofluorescentie of cytometrie-analyse. Bovendien kunnen CTC-lijnen worden gebruikt om de gevoeligheid van geneesmiddelen voor chemotherapieën met een gouden standaard en voor gerichte therapieën te beoordelen. Het vermogen van CTC-lijnen om tumoren te initiëren kan ook worden getest door subcutane injectie van CTC’s in immunodeficiënte muizen.
Ten slotte is het mogelijk om de rol van specifieke genen van belang die betrokken kunnen zijn bij de verspreiding van kanker te testen door CTC-genen te bewerken, door korte haarspeld ribonucleïnezuur (shRNA) of Crispr / Cas9. Gemodificeerde CTC’s kunnen dus worden geïnjecteerd in immunodeficiënte muizenpleten, om experimenteel een deel van het metastatische ontwikkelingsproces in vivona te bootsen.
Kortom, CTC-lijnen zijn een kostbaar hulpmiddel voor toekomstig onderzoek en voor gepersonaliseerde geneeskunde, waar ze voorspelling van de efficiëntie van de behandeling mogelijk maken met behulp van de cellen die oorspronkelijk verantwoordelijk zijn voor metastase.
Introduction
Ondanks recente verbeteringen in vroege kankerdiagnose en in therapeutische strategie, is meer dan negentig procent van de kankermorbiditeit nog steeds te wijten aan metastase1. Het metastatische proces is een cascade van meerdere stappen die begint met de lokale loslating van cellen van de primaire tumor en hun toegang tot de bloedbaan waar ze circulerende tumorcellen (CTC’s) worden om uiteindelijk verre locaties zoals lever en longen te koloniseren, in het geval van colorectale kanker (CRC)2. Onlangs is er een groeiende aandacht voor vloeibare biopsieën, die een niet-invasief hulpmiddel zijn om met name CTC’s uit bloedmonsters van patiënten te detecteren en op te sommen. Intratumor genetische heterogeniteit is een belangrijke oorzaak van resistentie tegen geneesmiddelen; het isoleren van representatieve cellen uit tumormateriaal vormt dus een veelbelovend hulpmiddel voor gepersonaliseerde geneeskunde3.
Ondanks de lage frequentie van CTC’s in het bloed (1 CTC per 106 – 107 leukocyten)4, werden verschillende detectie- en isolatietechnieken ontwikkeld op basis van eigenschapsverschillen tussen CTC’s en andere componenten van het bloed5. Het aantal CTC’s in bloedmonsters van patiënten kan alleen al informatie geven over het stadium van maligniteit, behandelingsrespons en ziekteprogressie6,7. CTC-isolatie is dus een cruciaal hulpmiddel voor translationele studies om genetische heterogeniteit te beoordelen of geneesmiddelenscreening uit te voeren, evenals voor fundamentele studies om deze invasieve cellen te karakteriseren, omdat zij de belangrijkste actoren zijn van gemetastaseerde inductie8,9. Inderdaad, vergeleken met commercieel gevestigde kankercellijnen die in de loop van de tijd duizenden mutaties hebben verzameld, delen verse CTC’s de belangrijkste kenmerken van de oorspronkelijke primaire tumor, waaronder een krachtig vermogen om te metastaseren, en ze zijn een betere weerspiegeling van de ziekte. Deze kenmerken maken ze een robuust hulpmiddel voor fundamentele studies, vooral in knock-out experimenten van voorspelde sleutelfactoren die betrokken zijn bij metastase. De uitkomst van deze experimenten kan in vivoworden gevalideerd , op muizen, zoals hieronder beschreven.
Zodra CTC’s zijn geïsoleerd, kunnen ze worden uitgebreid in niet-adherente kweekomstandigheden en vervolgens kunnen ze worden gemanipuleerd, net als elke beschikbare kankercellijn, d.w.z. ze kunnen ook worden gekweekt in aanhankelijke omstandigheden of ingebed in Matrigel, afhankelijk van de wetenschappelijke vraag10. Om bijvoorbeeld de expressie en lokalisatie van een interessant eiwit te testen, kunnen CTC-bollen in suspensieconditie worden gekweekt en in Histogel worden ingebed om immunofluorescentie op bolsecties uit te voeren. Bovendien, als het eiwit vliezig is, kan de expressie ervan op levende cellen worden gemeten door cytometrie.
Voor functionele studies, om de rol van een eiwit van belang te testen dat een rol kan spelen bij leverkolonisatie, kunnen CTC’s met genen bewerkt, door shRNA of CRISPR / Cas9, worden geïnjecteerd in de milt van immunodeficiënte muizen. Dit laatste experiment is een krachtig model om levermetastasekolonisatie na te bootsen11.
Het vermogen van CTC’s om tumoren te initiëren kan worden beoordeeld door een zeer klein aantal cellen in immuno-deficiënte muizen te injecteren. Aangezien tumorinitiatie een kenmerk is van kankerstamcellen (CSC’s), zal deze test het percentage CSC’s binnen CTC-lijnen aangeven. Dit stamcelfenotype maakt circulerende tumorcellijnen resistent tegen sommige goudstandaard kankertherapieën. Uitgebreide CTC’s kunnen daarom worden gebruikt om geneesmiddelen te screenen en de beste potentiële efficiënte behandeling voor de patiënt te bepalen; CTC-respons op de behandeling kan bijvoorbeeld in vitro worden getest met behulp van een luminescentie-levensvatbaarheidstest.
In een langetermijnperspectief kan geneesmiddelenscreening op vers geïsoleerde en versterkte CTC’s worden gebruikt als een nieuw hulpmiddel voor gepersonaliseerde geneeskunde om te helpen bij het kiezen van de meest efficiënte en aangepaste behandeling voor patiënten.
In dit artikel worden protocollen voor het kweken van CTC-lijnen, voor het kleuren van specifieke eiwitten via immunostaining en cytometrie, voor het uitvoeren van cytotoxiciteitstests en in vivo xenograftexperimenten met CTC gedetailleerd beschreven.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het hierboven beschreven protocol werd aanvankelijk gebruikt voor colorectale CTC functionele karakterisering, maar het kan worden gebruikt voor andere soorten kanker zoals borstkanker en kan worden aangepast voor muismodellen.
De echte beperkende factor is het aantal CTC’s in het bloedmonster en de efficiëntie van de techniek die wordt gebruikt om ze te isoleren en uit te breiden. Verschillende CTC-isolatietechnieken zijn beschreven op basis van specifieke CTC-eigenschappen zoals de Parsorti…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoeksproject in het Pannequin lab werd ondersteund door een onderzoekssubsidie van het SIRIC: Grant « INCa-DGOS-Inserm 6045 ». De proefschriften van Guillaume Belthier en Zeinab Homayed werden ondersteund door de anti-kanker liga/Ligue contre le Cancer. Het salaris van Céline Bouclier werd gefinancierd door “regio Occitanie”. Met dank aan Julian Venables voor de Engelse redactie.
Materials
| Accumax solution | Sigma-Aldrich | A7089 | |
| Advanced DMEM/F-12 | Gibco | 12634028 | |
| CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay | Promega | G7570 | |
| Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | Corning | 354230 | |
| Costar 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, | Corning | 3473 | |
| Histiogel Specimen Medium | LabStorage | HG-4000 | |
| Human EGF, premium grade | Miltenyi Biotec | 130-097-751 | |
| Human FGF-2, premium grade | Miltenyi Biotec | 130-093-564 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030081 | |
| N-2 Supplement | Gibco | 17502048 | |
| Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL) | Gibco | 15070063 |
Riferimenti
- Wittekind, C., Neid, M. Cancer invasion and metastasis. Oncology. 69, 14-16 (2005).
- Eger, A., Mikulits, W. Models of epithelial-mesenchymal transition. Drug Discovery Today: Disease Models. 2, 57-63 (2005).
- Palmirotta, R., et al. Liquid biopsy of cancer: a multimodal diagnostic tool in clinical oncology. Therapeutic Advances in Medical Oncology. 10, (2018).
- Hong, B., Zu, Y. Detecting circulating tumor cells: current challenges and new trends. Theranostics. 3, 377-394 (2013).
- vander Toom, E. E., Verdone, J. E., Gorin, M. A., Pienta, K. J. Technical challenges in the isolation and analysis of circulating tumor cells. Oncotarget. 7, 62754-62766 (2016).
- Jin, L., et al. Evaluation of the diagnostic value of circulating tumor cells with CytoSorter® CTC capture system in patients with breast cancer. Cancer Medicine. 9, 1638-1647 (2020).
- Huang, X., et al. Relationship between circulating tumor cells and tumor response in colorectal cancer patients treated with chemotherapy: a meta-analysis. BMC Cancer. 14, 976 (2014).
- Yu, M., et al. Ex vivo culture of circulating breast tumor cells for individualized testing of drug susceptibility. Science. 345, 216-220 (2014).
- Aceto, N., et al. Circulating Tumor Cell Clusters are Oligoclonal Precursors of Breast Cancer Metastasis. Cell. 158, 1110-1122 (2014).
- Grillet, F., et al. Circulating tumour cells from patients with colorectal cancer have cancer stem cell hallmarks in ex vivo culture. Gut. 66, 1802-1810 (2017).
- Lee, W. Y., Hong, H. K., Ham, S. K., Kim, C. I., Cho, Y. B. Comparison of Colorectal Cancer in Differentially Established Liver Metastasis Models. Anticancer Research. 34, 3321-3328 (2014).
- Giraud, J., et al. Progastrin production transitions from Bmi1+/Prox1+ to Lgr5high cells during early intestinal tumorigenesis. Translational Oncology. 14, (2020).
- Xu, L., et al. Optimization and Evaluation of a Novel Size Based Circulating Tumor Cell Isolation System. PLoS One. 10, 0138032 (2015).
- Beije, N., Jager, A., Sleijfer, S. Circulating tumor cell enumeration by the CellSearch system: the clinician’s guide to breast cancer treatment. Cancer Treatment Reviews. 41, 144-150 (2015).
- Karabacak, N. M., et al. Microfluidic, marker-free isolation of circulating tumor cells from blood samples. Nature Protocols. 9, 694-710 (2014).
- Ozkumur, E., et al. Inertial Focusing for Tumor Antigen-Dependent and -Independent Sorting of Rare Circulating Tumor Cells. Science Translational Medicine. 5, (2013).
