Linhas celulares tumorais circulantes: uma ferramenta inovadora para pesquisa fundamental e translacional
Summary
Os CTCs de cultivo permitem uma caracterização funcional mais profunda do câncer, através do ensaio de expressão específica do marcador, e da avaliação da resistência medicamentosa e da capacidade de colonizar o fígado entre outras possibilidades. No geral, a cultura CTC pode ser uma ferramenta clínica promissora para a medicina personalizada para melhorar o resultado do paciente.
Abstract
A metástase é a principal causa de morte por câncer. Apesar da melhora nas estratégias de tratamento, o câncer metastático tem um prognóstico ruim. Enfrentamos, portanto, uma necessidade urgente de compreender os mecanismos por trás do desenvolvimento da metástase e, assim, propor tratamentos eficientes para o câncer avançado. Cânceres metastáticos são difíceis de tratar, pois biópsias são invasivas e inacessíveis. Recentemente, houve um interesse considerável em biópsias líquidas, incluindo o ácido desoxiribonucleico circulante livre de células (DNA) e as células tumorais circulantes do sangue periférico e estabelecemos várias linhas de células tumorais circulantes de pacientes com câncer colorretal metastático para participar de sua caracterização. De fato, para caracterizar funcionalmente essas células raras e mal descritas, o passo crucial é expandi-las. Uma vez estabelecidas, as linhas de células tumorais circulantes (CTC) podem então ser cultivadas em condições de suspensão ou aderentes. No nível molecular, as linhas CTC podem ser utilizadas para avaliar a expressão de marcadores específicos de interesse (como diferenciação, células-tronco epiteliais ou cancerígenas) por imunofluorescência ou análise de citometria. Além disso, as linhas CTC podem ser usadas para avaliar a sensibilidade medicamentosa a quimioterapias padrão-ouro, bem como a terapias-alvo. A capacidade das linhas CTC para iniciar tumores também pode ser testada por injeção subcutânea de CTCs em camundongos imunodeficientes.
Finalmente, é possível testar o papel de genes específicos de interesse que possam estar envolvidos na disseminação do câncer editando genes CTC, por ácido ribonucleico de pinos curtos (shRNA) ou Crispr/Cas9. Os CTCs modificados podem, assim, ser injetados em baços de camundongos imunodeficientes, para imitar experimentalmente parte do processo de desenvolvimento metastático in vivo.
Em conclusão, as linhas CTC são uma ferramenta preciosa para futuras pesquisas e para medicina personalizada, onde permitirão a previsão da eficiência do tratamento utilizando as próprias células que são originalmente responsáveis pela metástase.
Introduction
Apesar das recentes melhoras no diagnóstico precoce do câncer e na estratégia terapêutica, mais de noventa por cento da morbidade do câncer ainda se deve à metástase1. O processo metastático é uma cascata de várias etapas que começa com o descolamento local das células do tumor primário e sua entrada na corrente sanguínea onde se tornam células tumorais circulantes (CTCs) para finalmente colonizar locais distantes como fígado e pulmões, no caso do câncer colorretal (CRC)2. Recentemente, tem-se aumentado a atenção para biópsias líquidas, que são uma ferramenta não invasiva para detectar e enumerar CTCs de amostras de sangue de pacientes. A heterogeneidade genética intratumor é uma das principais causas de resistência a medicamentos; assim, isolar células representativas do material tumoral constitui uma ferramenta promissora para a medicina personalizada3.
Apesar da baixa frequência de CTCs no sangue (1 CTC por 106 – 107 leucócitos)4, várias técnicas de detecção e isolamento foram desenvolvidas com base em diferenças de propriedade entre CTCs e outros componentes do sangue5. O número de CTCs em amostras de sangue do paciente, sozinho, pode fornecer informações sobre o estágio de malignidade, resposta ao tratamento e progressão da doença6,7. Assim, o isolamento do CTC é uma ferramenta crucial para estudos translacionais avaliarem a heterogeneidade genética ou realizarem o rastreamento de medicamentos, bem como para estudos fundamentais para caracterizar essas células invasoras, pois são os principais atores da indução metastática8,9. De fato, em comparação com as linhas de células cancerígenas estabelecidas comercialmente que acumularam milhares de mutações ao longo do tempo, os CTCs frescos compartilham as principais características do tumor primário original, incluindo uma capacidade potente de metástase, e eles são um melhor reflexo da doença. Essas características fazem deles uma ferramenta robusta para estudos fundamentais, especialmente em experimentos eliminatórios de fatores-chave previstos envolvidos na metástase. O resultado desses experimentos pode ser validado in vivo, emcamundongos, conforme descrito abaixo.
Uma vez que os CTCs são isolados, eles podem ser expandidos em condições de cultura não aderentes e, em seguida, eles podem ser manipulados assim como qualquer linha de células cancerígenas disponíveis, ou seja, eles podem ser igualmente cultivados em condições aderentes ou incorporados em Matrigel, dependendo da questão científica10. Por exemplo, para testar a expressão e localização de uma proteína de interesse, as esferas CTC podem ser cultivadas em condições de suspensão e serem incorporadas em Histogel para realizar imunofluorescência em seções de esferas. Além disso, se a proteína é membranous, sua expressão em células vivas pode ser medida por citometria.
Para estudos funcionais, para testar o papel de uma proteína de interesse que pode desempenhar um papel na colonização hepática, os CTCs com genes editados, por shRNA ou CRISPR/Cas9, podem ser injetados no baço de camundongos imunodeficientes. Este último experimento é um modelo poderoso para imitar a colonização da metástase hepática11.
A capacidade dos CTCs de iniciar tumores pode ser avaliada injetando um número muito pequeno de células em camundongos imuno-deficientes. Como a iniciação tumoral é uma marca registrada das células-tronco cancerígenas (CSCs) este ensaio indicará a porcentagem de CSCs dentro das linhas CTC. Este fenótipo de células-tronco torna as linhas de células tumorais circulantes resistentes a algumas terapias de câncer padrão-ouro. Os CTCs expandidos podem, portanto, ser usados para triagem de medicamentos e identificar o melhor tratamento potencial eficiente para o paciente; A resposta ctc ao tratamento pode ser testada in vitro usando um ensaio de viabilidade de luminescência, por exemplo.
Em uma perspectiva de longo prazo, o rastreamento de medicamentos em CTCs recém-isolados e amplificados poderia ser usado como uma nova ferramenta para a medicina personalizada para ajudar na escolha do tratamento mais eficiente e adaptado para os pacientes.
No presente artigo, são detalhados protocolos para a cultura de linhas CTC, para coloração de proteínas específicas via imunostaining e citometria, para a realização de ensaios de citotoxicidade, bem como experimentos in vivo xenoenxerto com CTC.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo descrito acima foi utilizado inicialmente para caracterização funcional ctc colorretal, mas pode ser usado para outros tipos de câncer, como o câncer de mama e pode ser adaptado para modelos de camundongos.
O verdadeiro fator limitante é o número de CTCs presentes na amostra de sangue e a eficiência da técnica utilizada para isolá-las e expandi-las. Várias técnicas de isolamento CTC foram descritas com base em propriedades específicas de CTC, como o Parsortix, um dispos…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este projeto de pesquisa no laboratório Pannequin foi apoiado por uma bolsa de pesquisa do SIRIC: Grant « INCa-DGOS-Inserm 6045 ». As teses de doutorado de Guillaume Belthier e Zeinab Homayed foram apoiadas pela liga anticâncoma/Ligue contre le Cancer. O salário de Céline Bouclier foi financiado pela “região Occitanie”. Obrigado a Julian Venables pela edição em inglês.
Materials
| Accumax solution | Sigma-Aldrich | A7089 | |
| Advanced DMEM/F-12 | Gibco | 12634028 | |
| CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay | Promega | G7570 | |
| Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | Corning | 354230 | |
| Costar 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, | Corning | 3473 | |
| Histiogel Specimen Medium | LabStorage | HG-4000 | |
| Human EGF, premium grade | Miltenyi Biotec | 130-097-751 | |
| Human FGF-2, premium grade | Miltenyi Biotec | 130-093-564 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030081 | |
| N-2 Supplement | Gibco | 17502048 | |
| Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL) | Gibco | 15070063 |
Riferimenti
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