순환 종양 세포 주: 근본적이고 번역적인 연구를 위한 혁신적인 도구
Summary
CtC를 배양하면 특정 마커 발현을 속이고 약물 내성과 다른 가능성 중 간을 식민지화하는 능력을 평가함으로써 암의 더 깊은 기능적 특성을 허용합니다. 전반적으로 CTC 문화는 환자 결과를 개선하기 위해 개인화 된 의학을위한 유망한 임상 도구가 될 수 있습니다.
Abstract
전이는 암 사망의 주요 원인입니다. 치료 전략의 개선에도 불구하고 전이성 암에는 예후가 좋지 않습니다. 따라서 우리는 전이 발달뒤에 기계장치를 이해하고, 이렇게 향상된 암을 위한 능률적인 처리를 제안하는 긴급한 필요에 직면합니다. 전이성 암은 생검이 침략적이고 접근할 수 없기 때문에 취급하기 어렵습니다. 최근에는 세포없는 순환 탈옥리보핵산(DNA) 및 말초 혈액으로부터 종양 세포를 순환하는 등 액체 생검에 상당한 관심이 있었으며, 전이성 대장암 환자로부터 여러 순환 종양 세포주를 확립하여 특성화에 참여하고 있다. 실제로, 기능적으로 이 희소하고 제대로 기술되지 않는 세포를 특성화하기 위하여, 중요한 단계는 그(것)들을 확장하는 것입니다. 일단 확립되면, 순환 종양 세포 (CTC) 라인은 그 때 현탁액 또는 응고 조건에서 배양될 수 있습니다. 분자 수준에서, CTC 라인은 면역 형광 또는 세포 측정 분석에 의해 관심의 특정 마커 (분화, 상피 또는 암 줄기 세포와 같은)의 발현을 평가하기 위해 더 사용될 수 있다. 또한 CTC 라인은 금 표준 화학 요법뿐만 아니라 표적 치료에 대한 약물 민감도를 평가하는 데 사용할 수 있습니다. CTC 라인의 기능은 또한 면역 결핍 마우스에 있는 CTC의 피하 주입에 의해 시험될 수 있습니다.
마지막으로, 짧은 헤어핀 리보핵산(shRNA) 또는 Crispr/Cas9에 의해 CTC 유전자를 편집하여 암 보급에 관여할 수 있는 특정 유전자의 역할을 테스트할 수 있다. 따라서 변형된 CtC는 생체 내에서 전이성 개발 과정의 일부를 실험적으로 모방하기 위해 면역 결핍 마우스 비장으로 주입될 수 있다.
결론적으로, CTC 라인은 미래 연구와 개인화 된 의학을위한 귀중한 도구이며, 원래 전이를 담당하는 세포를 사용하여 치료 효율을 예측할 수 있습니다.
Introduction
최근 조기 암 진단및 치료 전략의 개선에도 불구하고 암 이환율의 90% 이상이 여전히 전이1로인한 것입니다. 전이성 과정은 1차 종양으로부터 세포의 국소 분리로 시작하여 혈류로 들어가는 것으로 시작하여 순환종양 세포(CTC)가 되어 대장암(CRC)의 경우 간과 폐와 같은 먼 부위를 마지막으로식민지화한다. 최근에는 환자 혈액 샘플에서 CTC를 특히 감지하고 예중화하는 비침습적 도구인 액체 생검에 대한 관심이 증가하고 있습니다. 종양 내 유전 적 이질성은 약물 내성의 주요 원인입니다. 따라서, 종양 물질로부터 대표 세포를 분리하는 것은 개인화된 약3을위한 유망한 공구를 구성한다.
혈액내 CTC의 저주빈도에도 불구하고(106-107 백혈구당 1CTC)4,CTC 및 혈액 5의다른 성분 간의 특성 차이에 기초하여 여러 가지 검출 및 격리 기술이 개발되었다. 환자 혈액 샘플에서 CTC의 수는 단독으로 악성, 치료 반응 및 질병 진행6,7의단계에 대한 정보를 제공할 수 있다. 따라서, CTC 격리는 유전 이질성을 평가하거나 약물 스크리닝을 수행하는 번역 연구뿐만 아니라 전이성유도8,9의주요 행위자로서 이러한 침습적 세포를 특성화하는 근본적인 연구를 위한 중요한 도구이다. 실제로, 시간이 지남에 따라 수천 개의 돌연변이를 축적한 상업적으로 확립된 암 세포주에 비해, 신선한 CTC는 전이할 수 있는 강력한 용량을 포함하여 원래 1차 종양의 주요 특징을 공유하고, 질병의 더 나은 반사이다. 이러한 기능은 특히 전이와 관련된 예측 된 주요 요인의 녹아웃 실험에서 기본 연구를위한 강력한 도구입니다. 이러한 실험의 결과는 아래에 설명된 바와 같이 마우스에 대한 생체 내에서검증될 수 있다.
일단 CTC가 고립되면, 그(것)들은 비 부착된 배양 조건에서 확장될 수 있고, 그(것)들은 어떤 유효한 암 세포주로 조작될 수 있고, 즉, 그(것)들은 과학적인 질문에 따라, 준수한 조건에서 동등하게 배양되거나 Matrigel에 내재될 수 있습니다10. 예를 들어, 관심 있는 단백질의 발현 및 국소화를 테스트하기 위해 CTC 구체는 현탁 상태로 성장하고 히스토겔에 내장되어 구단 에 대한 면역형성을 수행할 수 있다. 또한, 단백질이 음골인 경우, 살아있는 세포에 대한 발현은 세포측정에 의해 측정될 수 있다.
기능적 연구를 위해, 간 식민지화에 역할을 할 수 있는 관심 있는 단백질의 역할을 시험하기 위하여는, shRNA 또는 CRISPR/Cas9에 의해 편집된 유전자를 가진 CTC는 면역 결핍 마우스의 비장에 주입될 수 있다. 이 후자의 실험은 간 전이 식민지(11)를모방하는 강력한 모델이다.
CTC가 종양을 개시하는 기능은 면역 결핍 마우스로 세포의 아주 작은 수를 주입하여 평가될 수 있습니다. 종양 개시는 암 줄기 세포 (CSC)의 특징이기 때문에 이 분석은 CTC 라인 내의 CSCs의 비율을 나타냅니다. 이 줄기 세포 표현형은 몇몇 금 표준 암 치료에 저항하는 순환 종양 세포 주를 만듭니다. 따라서 확장된 CtC는 약물을 검사하고 환자를 위한 최상의 잠재적 효율적인 치료를 정확히 찾아내는 데 사용될 수 있습니다. 치료에 대한 CTC 반응은 발광 생존 가능성 분석, 예를 들어, 체외에서 테스트 할 수 있습니다.
장기적인 관점에서, 갓 고립되고 증폭된 CtC에 대한 약물 스크리닝은 환자를 위한 가장 효율적이고 적응된 치료를 선택하는 데 도움이 되는 개인화된 의학을 위한 새로운 도구로 사용될 수 있습니다.
본 논문에서, CTC 라인을 배양하는 프로토콜은 면역스테인링 및 세포측정을 통해 특정 단백질을 염색하고, CTC를 통한 생체 내 식이식 실험뿐만 아니라 세포 독성 분석도 수행한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
전술한 프로토콜은 처음에 대장 CTC 기능특성화를 위해 사용되었지만 유방암과 같은 다른 유형의 암에 사용될 수 있으며 마우스 모델에 적응할 수 있다.
실제 제한 요소는 혈액 샘플에 존재하는 CtC의 수와 이를 분리하고 확장하는 데 사용되는 기술의 효율성입니다. 몇몇 CTC 격리 기술자들은 세포 크기 및 그것의압축성(13)에근거하여 CTC의 격리를 허용하는 파s…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
판네퀸 연구소의 이 연구 프로젝트는 SIRIC: 그랜트« INCa-DGOS-Inserm 6045 »의 연구 보조금에 의해 지원되었습니다. 기요메 벨트티어와 제이나브 호마예드박사의 박사 학위 는 항암 리그/리그 콘트라트 르 암에 의해 지원되었다. 셀린 부클리에 의 급여는 “지역 옥시타니”에 의해 조달되었다. 영어 편집 줄리안 Venable 감사합니다.
Materials
| Accumax solution | Sigma-Aldrich | A7089 | |
| Advanced DMEM/F-12 | Gibco | 12634028 | |
| CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay | Promega | G7570 | |
| Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | Corning | 354230 | |
| Costar 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, | Corning | 3473 | |
| Histiogel Specimen Medium | LabStorage | HG-4000 | |
| Human EGF, premium grade | Miltenyi Biotec | 130-097-751 | |
| Human FGF-2, premium grade | Miltenyi Biotec | 130-093-564 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030081 | |
| N-2 Supplement | Gibco | 17502048 | |
| Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL) | Gibco | 15070063 |
Riferimenti
- Wittekind, C., Neid, M. Cancer invasion and metastasis. Oncology. 69, 14-16 (2005).
- Eger, A., Mikulits, W. Models of epithelial-mesenchymal transition. Drug Discovery Today: Disease Models. 2, 57-63 (2005).
- Palmirotta, R., et al. Liquid biopsy of cancer: a multimodal diagnostic tool in clinical oncology. Therapeutic Advances in Medical Oncology. 10, (2018).
- Hong, B., Zu, Y. Detecting circulating tumor cells: current challenges and new trends. Theranostics. 3, 377-394 (2013).
- vander Toom, E. E., Verdone, J. E., Gorin, M. A., Pienta, K. J. Technical challenges in the isolation and analysis of circulating tumor cells. Oncotarget. 7, 62754-62766 (2016).
- Jin, L., et al. Evaluation of the diagnostic value of circulating tumor cells with CytoSorter® CTC capture system in patients with breast cancer. Cancer Medicine. 9, 1638-1647 (2020).
- Huang, X., et al. Relationship between circulating tumor cells and tumor response in colorectal cancer patients treated with chemotherapy: a meta-analysis. BMC Cancer. 14, 976 (2014).
- Yu, M., et al. Ex vivo culture of circulating breast tumor cells for individualized testing of drug susceptibility. Science. 345, 216-220 (2014).
- Aceto, N., et al. Circulating Tumor Cell Clusters are Oligoclonal Precursors of Breast Cancer Metastasis. Cell. 158, 1110-1122 (2014).
- Grillet, F., et al. Circulating tumour cells from patients with colorectal cancer have cancer stem cell hallmarks in ex vivo culture. Gut. 66, 1802-1810 (2017).
- Lee, W. Y., Hong, H. K., Ham, S. K., Kim, C. I., Cho, Y. B. Comparison of Colorectal Cancer in Differentially Established Liver Metastasis Models. Anticancer Research. 34, 3321-3328 (2014).
- Giraud, J., et al. Progastrin production transitions from Bmi1+/Prox1+ to Lgr5high cells during early intestinal tumorigenesis. Translational Oncology. 14, (2020).
- Xu, L., et al. Optimization and Evaluation of a Novel Size Based Circulating Tumor Cell Isolation System. PLoS One. 10, 0138032 (2015).
- Beije, N., Jager, A., Sleijfer, S. Circulating tumor cell enumeration by the CellSearch system: the clinician’s guide to breast cancer treatment. Cancer Treatment Reviews. 41, 144-150 (2015).
- Karabacak, N. M., et al. Microfluidic, marker-free isolation of circulating tumor cells from blood samples. Nature Protocols. 9, 694-710 (2014).
- Ozkumur, E., et al. Inertial Focusing for Tumor Antigen-Dependent and -Independent Sorting of Rare Circulating Tumor Cells. Science Translational Medicine. 5, (2013).
