Sirkulerende tumorcellelinjer: et innovativt verktøy for grunnleggende og translasjonell forskning

Summary

Culturing CTCs tillater en dypere funksjonell karakterisering av kreft, gjennom å analyse spesifikke markør uttrykk, og vurdere narkotikaresistens og evnen til å kolonisere leveren blant andre muligheter. Samlet sett kan CTC-kultur være et lovende klinisk verktøy for personlig medisin for å forbedre pasientutfallet.

Abstract

Metastase er en ledende årsak til kreftdød. Til tross for forbedringer i behandlingsstrategier har metastatisk kreft en dårlig prognose. Vi står dermed overfor et presserende behov for å forstå mekanismene bak metastaseringsutvikling, og dermed foreslå effektive behandlinger for avansert kreft. Metastatiske kreftformer er vanskelige å behandle, da biopsier er invasive og utilgjengelige. Nylig har det vært stor interesse for flytende biopsier, inkludert både cellefrie sirkulerende deoksyribonukleinsyre (DNA) og sirkulerende tumorceller fra perifert blod, og vi har etablert flere sirkulerende tumorcellelinjer fra metastatiske kolorektal kreftpasienter for å delta i karakteriseringen. Faktisk, for å funksjonelt karakterisere disse sjeldne og dårlig beskrevne cellene, er det avgjørende trinnet å utvide dem. Når de er etablert, kan sirkulerende tumorcellelinjer (CTC) deretter dyrkes under suspensjon eller tilhengerforhold. På molekylært nivå kan CTC-linjer videre brukes til å vurdere uttrykket av spesifikke markører av interesse (for eksempel differensiering, epitelceller eller kreftstamceller) ved immunfluorescens eller cytometrianalyse. I tillegg kan CTC-linjer brukes til å vurdere legemiddelfølsomhet overfor gullstandard kjemoterapi samt målrettede terapier. Ctc-linjers evne til å initiere svulster kan også testes ved subkutan injeksjon av CTCer i immunodeficient mus.

Til slutt er det mulig å teste rollen til spesifikke gener av interesse som kan være involvert i kreftformidling ved å redigere CTC-gener, ved kort hårnål ribonukleinsyre (shRNA) eller Crispr / Cas9. Modifiserte CTCer kan dermed injiseres i immunodeficient mus milt, for å eksperimentelt etterligne en del av den metastatiske utviklingsprosessen in vivo.

Til slutt er CTC-linjer et dyrebart verktøy for fremtidig forskning og for personlig medisin, hvor de vil tillate prediksjon av behandlingseffektivitet ved hjelp av selve cellene som opprinnelig er ansvarlige for metastase.

Introduction

Til tross for nylige forbedringer i tidlig kreftdiagnose og i terapeutisk strategi, skyldes mer enn nitti prosent av kreftmorbiditeten fortsatt metastase¹. Den metastatiske prosessen er en flertrinns kaskade som starter med lokal løsrivelse av celler fra primærsvulsten og deres inngang til blodet der de blir sirkulerende tumorceller (CTCer) for endelig å kolonisere fjerne steder som lever og lunger, i tilfelle kolorektal kreft (CRC)². Nylig har det vært økende oppmerksomhet på flytende biopsier, som er et ikke-invasivt verktøy for å oppdage og liste opp CTCer fra pasientblodprøver. Intratumor genetisk heterogenitet er en viktig årsak til narkotikaresistens; Dermed utgjør isolerende representative celler fra tumormateriale et lovende verktøy for personlig medisin³.

Til tross for lav frekvens av CTCer i blodet (1 CTC per 10⁶ – 10⁷ leukocytter)⁴, ble flere deteksjons- og isolasjonsteknikker utviklet basert på egenskapsforskjeller mellom CTCer og andre komponenter i blodet⁵. Antall CTCer i pasientblodprøver, alene, kan gi informasjon om stadium av malignitet, behandlingsrespons og sykdomsprogresjon^6,7. Derfor er CTC-isolasjon et avgjørende verktøy for translasjonsstudier for å vurdere genetisk heterogenitet eller utføre narkotikascreening, samt for grunnleggende studier for å karakterisere disse invasive cellene, da de er de viktigste aktørene for metastatisk induksjon^8,9. Faktisk, sammenlignet med kommersielt etablerte kreftcellelinjer som har akkumulert tusenvis av mutasjoner over tid, deler friske CTCer hovedtrekkene til den opprinnelige primærsvulsten, inkludert en potent kapasitet til å metastasere, og de er en bedre refleksjon av sykdommen. Disse funksjonene gjør dem til et robust verktøy for grunnleggende studier, spesielt i knockout-eksperimenter av anslåtte nøkkelfaktorer involvert i metastase. Utfallet av disse eksperimentene kan valideres in vivo, på mus, som beskrevet nedenfor.

Når CTCer er isolert, kan de utvides i ikke-tilhengerkulturelle forhold, og da kan de manipuleres akkurat som alle tilgjengelige kreftcellelinjer, det vil si at de like kan dyrkes i følgeforhold eller innebygd i Matrigel, avhengig av det vitenskapelige spørsmålet¹⁰. For eksempel, for å teste uttrykket og lokaliseringen av et protein av interesse, kan CTC-sfærer dyrkes i suspensjonstilstand og bygges inn i Histogel for å utføre immunfluorescens på sfæreseksjoner. I tillegg, hvis proteinet er membranøst, kan uttrykket på levende celler måles ved cytometri.

For funksjonelle studier, for å teste rollen som et protein av interesse som kan spille en rolle i leverkolonisering, kan CTCer med gener redigert, av shRNA eller CRISPR / Cas9, injiseres i milten av immunodeficient mus. Dette sistnevnte eksperimentet er en kraftig modell for å etterligne levermetastase kolonisering¹¹.

CTCs evne til å initiere svulster kan vurderes ved å injisere et svært lite antall celler i immundefektende mus. Ettersom tumorinitiering er et kjennetegn på kreftstamceller (CSCer), vil denne analysen indikere prosentandelen CSC-er innenfor CTC-linjer. Denne stamcellefenotypen gjør sirkulerende tumorcellelinjer motstandsdyktige mot noen gullstandard kreftbehandlinger. Utvidede CTCer kan derfor brukes til å screene narkotika og finne den beste potensielle effektive behandlingen for pasienten; CTC respons på behandling kan testes in vitro ved hjelp av en luminescens levedyktighet analyse, for eksempel.

I et langsiktig perspektiv kan legemiddelscreening på nyisolerte og forsterkede CTCer brukes som et nytt verktøy for persontilpasset medisin for å hjelpe til med å velge den mest effektive og tilpassede behandlingen for pasienter.

I det nåværende papiret er protokoller for kultur CTC-linjer, for å flekke spesifikke proteiner via immunstaining og cytometri, for å utføre cytotoksisitetsanalyser samt in vivo xenograft-eksperimenter med CTC detaljert.

Protocol

Alle in vivo-protokoller ble godkjent av dyreetiske etater. 1. CTC-forsterkning i 3D-kulturforhold For å dyrke CTCer i suspensjon, første frø CTCer i brønner av en Ultra-Low Attachment (ULA) 24-brønns plate ved maksimal konsentrasjon på 5 celler / μL og i 1 ml M12 medium (dvs. avansert DMEM-F12 supplert med 2 mM l-glutamin, 100 Unit/ml penicillin og streptomycin, N2 supplement, 20 ng/ml epidermal vekstfaktor og 10 ng/ml fibroblast vekstfaktor…

Representative Results

Både EpCAM- og CD26-uttrykk som observeres av IF (figur 1A høyre panel) og FACS ( figur1B), angir at CTC-linjen er epitelial og viser et av CSC-kjennetegnene10. Dette epiteliske trekket kan ytterligere karakteriseres ved farging med antistoffer rettet mot andre epitel- og mesenchymale markører. Dermed kan det være mulig å omtrent vite hvor CTC-linjen er langs epitel-mesenchymal aksen. Uttrykk for andre CSC-markører …

Discussion

Protokollen beskrevet ovenfor ble opprinnelig brukt til kolorektal CTC funksjonell karakterisering, men den kan brukes til andre typer kreft som brystkreft og kan tilpasses for musemodeller.

Den reelle begrensende faktoren er antall CTCer som er tilstede i blodprøven og effektiviteten til teknikken som brukes til å isolere og utvide dem. Flere CTC-isolasjonsteknologier er beskrevet basert på spesifikke CTC-egenskaper som Parsortix, en mikrofluidisk enhet, som tillater isolering av CTCer bas…

Materials

Accumax solution	Sigma-Aldrich	A7089
Advanced DMEM/F-12	Gibco	12634028
CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay	Promega	G7570
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix	Corning	354230
Costar 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates,	Corning	3473
Histiogel Specimen Medium	LabStorage	HG-4000
Human EGF, premium grade	Miltenyi Biotec	130-097-751
Human FGF-2, premium grade	Miltenyi Biotec	130-093-564
L-Glutamine (200 mM)	Gibco	25030081
N-2 Supplement	Gibco	17502048
Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL)	Gibco	15070063