Dolaşımdaki Tümör Hücre Hatları: Temel ve Çevirisel Araştırmalar için Yenilikçi Bir Araç
Summary
Kült WC’ler, belirli belirteç ifadesini test ederek ve ilaç direncini ve karaciğeri diğer olasılıklar arasında kolonileştirme yeteneğini değerlendirerek kanserin daha derin bir fonksiyonel karakterizasyonuna izin verir. Genel olarak, CTC kültürü hasta sonucunu iyileştirmek için kişiselleştirilmiş tıp için umut verici bir klinik araç olabilir.
Abstract
Metastaz kanser ölümlerinin önde gelen bir nedenidir. Tedavi stratejilerindeki gelişmelere rağmen, metastatik kanserin prognozu zayıftır. Bu nedenle metastaz gelişiminin arkasındaki mekanizmaları anlamak ve böylece ileri kanser için verimli tedaviler önermek için acil bir ihtiyaçla karşı karşıyayız. Biyopsiler invaziv ve erişilemez olduğu için metastatik kanserlerin tedavisi zordur. Son zamanlarda, hem hücre içermeyen dolaşımdaki deoksiribonükleik asit (DNA) hem de periferik kandan dolaşımdaki tümör hücreleri de dahil olmak üzere sıvı biyopsilere önemli bir ilgi olmuştur ve metastatik kolorektal kanser hastalarından karakterizasyonlarına katılmak için dolaşan birkaç tümör hücre hattı kurduk. Gerçekten de, bu nadir ve kötü tanımlanmış hücreleri işlevsel olarak karakterize etmek için, önemli adım onları genişletmektir. Kurulduktan sonra, dolaşımdaki tümör hücresi (CTC) çizgileri süspansiyon veya yapışık koşullarda kültürlenebilir. Moleküler düzeyde, CTC çizgileri immünoforezans veya sitometri analizi ile belirli ilgi belirteçlerinin (farklılaşma, epitel veya kanser kök hücreleri gibi) ekspresyonunu değerlendirmek için daha fazla kullanılabilir. Ek olarak, CTC hatları altın standart kemoterapilere ve hedefe dönük tedavilere karşı ilaç duyarlılığını değerlendirmek için kullanılabilir. CTC hatlarının tümörleri başlatma yeteneği, immün yetmezlikli farelerde CTC’lerin deri altı enjeksiyonu ile de test edilebilir.
Son olarak, CTC genlerini düzenleyerek, kısa saç tokası ribonik asit (shRNA) veya Crispr / Cas9 ile kanser yayılmasında rol alabilecek belirli ilgi genlerinin rolünü test etmek mümkündür. Böylece modifiye CTC’ler, metastatikgeliştirme sürecinin bir kısmını deneysel olarak taklit etmek için immün yetmez fare dalaklarına enjekte edilebilir vivo .
Sonuç olarak, CTC hatları gelecekteki araştırmalar ve kişiselleştirilmiş tıp için değerli bir araçtır, burada başlangıçta metastazdan sorumlu hücreleri kullanarak tedavi verimliliğinin tahminine izin vereceklerdir.
Introduction
Erken kanser tanısında ve terapötik stratejide son gelişmelere rağmen, kanser morbiditesinin yüzde doksanından fazlası hala metastaznedeniyle 1. Metastatik süreç, kolorektal kanser (CRC) durumunda, hücrelerin birincil tümörden lokal olarak kopması ve sonunda karaciğer ve akciğerler gibi uzak bölgeleri kolonize etmek için dolaşımdaki tümör hücreleri (CTC’ ler) haline geldikleri kan dolaşımına girmeleri ile başlayan çok adımlı bir basamaktır2. Son zamanlarda, hasta kan örneklerinden CTC’leri tespit etmek ve numaralandırmak için invaziv olmayan bir araç olan sıvı biyopsilerine dikkat artmaktadır. İntratümör genetik heterojenlik ilaç direncinin önemli bir nedenidir; bu nedenle, tümör materyalinden temsili hücreleri izole etmek kişiselleştirilmiş tıp için umut verici bir araç oluşturur3.
Kandaki CPC sıklığının düşüklüğüne rağmen (106 – 107 lökosit başına 1 CTC)4, CTC’lerve kanın diğer bileşenleri arasındaki özellik farklılıklarına dayanarak çeşitli algılama ve izolasyon teknikleri geliştirilmiştir5. Hasta kan örneklerindeki CTC sayısı, tek başına malignite, tedavi yanıtı ve hastalığın ilerleme evresi hakkında bilgi sağlayabilir6,7. Bu nedenle, CTC izolasyonu, genetik heterojenliği değerlendirmek veya ilaç taraması yapmak için çeviri çalışmaları için ve metastatik indüksiyonun temel aktörleri oldukları için bu invaziv hücreleri karakterize etmek için temel çalışmalar için çok önemli bir araçtır8,9. Gerçekten de, zaman içinde binlerce mutasyon biriktiren ticari olarak kurulmuş kanser hücre hatlarıyla karşılaştırıldığında, taze CTC’ler metastaz yapmak için güçlü bir kapasite de dahil olmak üzere orijinal primer tümörün ana özelliklerini paylaşırlar ve bunlar hastalığın daha iyi bir yansımasıdır. Bu özellikler, özellikle metastazda yer alan tahmin edilen anahtar faktörlerin nakavt deneylerinde, temel çalışmalar için sağlam bir araç haline getirir. Bu deneylerin sonucu in vivo, fareler üzerinde, aşağıda açıklandığı gibi.
CTC’ler izole edildikten sonra, yapışmayan kültür koşullarında genişletilebilirler ve daha sonra, mevcut herhangi bir kanser hücresi hattı gibi manipüle edilebilirler, yani bilimsel soruya bağlı olarak, bağlı koşullarda eşit olarak kültürlenebilir veya Matrigel’e gömülebilirler10. Örneğin, ilgi çekici bir proteinin ekspresyonunu ve lokalizasyonunu test etmek için, CTC küreleri süspansiyon durumunda yetiştirilebilir ve küre bölümlerinde immünofluoresans yapmak için Histogel’e gömülebilir. Ek olarak, protein membranöz ise, canlı hücreler üzerindeki ifadesi sitotemetri ile ölçülebilir.
Fonksiyonel çalışmalar için, karaciğer kolonizasyonunda rol oynayabilecek ilgi çekici bir proteinin rolünü test etmek için, shRNA veya CRISPR / Cas9 tarafından düzenlenmiş genlere sahip CTC’ler, immün yetmez farelerin dalağının içine enjekte edilebilir. Bu ikinci deney karaciğer metastaz kolozizasyonunu taklit etmek için güçlü bir modeldir11.
CTC’lerin tümörleri başlatma yeteneği, immün eksikliği olan farelere çok az sayıda hücre enjekte edilerek değerlendirilebilir. Tümör inisiyonu kanser kök hücrelerinin (CSC) ayırt edici özelliği olduğundan, bu test CTC satırlarındaki CSC’lerin yüzdesini gösterecektir. Bu kök hücre fenotipi dolaşımdaki tümör hücre hatlarını bazı altın standart kanser tedavilerine dirençli hale getirir. Bu nedenle genişletilmiş CTC’ler ilaçları taramak ve hasta için en iyi potansiyel verimli tedaviyi belirlemek için kullanılabilir; Tedaviye BTC yanıtı, örneğin bir lüminesans canlılık testi kullanılarak in vitro olarak test edilebilir.
Uzun vadeli bir perspektifte, yeni izole edilmiş ve güçlendirilmiş CTC’ler üzerinde ilaç taraması, hastalar için en verimli ve uyarlanmış tedavinin seçilmesine yardımcı olmak için kişiselleştirilmiş tıp için yeni bir araç olarak kullanılabilir.
Bu makalede, CTC çizgilerini kültüre etme, immünostainleme ve sitotemetri yoluyla spesifik proteinleri lekeleme, sitotoksiklik tahlillerinin yanı sıra CTC ile in vivo ksinograft deneyleri yapma protokolleri ayrıntılı olarak açıklanmıştır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Yukarıda açıklanan protokol başlangıçta kolorektal CTC fonksiyonel karakterizasyonu için kullanılmıştır, ancak meme kanseri gibi diğer kanser türleri için kullanılabilir ve fare modelleri için uyarlanabilir.
Gerçek sınırlayıcı faktör, kan örneğinde bulunan CTC sayısı ve bunları izole etmek ve genişletmek için kullanılan tekniğin verimliliğidir. Hücre boyutuna ve sıkıştırılabilirliğine göre CTC’lerin izolasyonunu sağlayan mikroakışkan bir cihaz olan Pa…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Pannequin laboratuvarındaki bu araştırma projesi SIRIC: Grant « INCa-DGOS-Inserm 6045 » araştırma hibesi ile desteklendi. Guillaume Belthier ve Zeinab Homayed’in doktora tezleri anti-kanser ligi/Ligue contre le Cancer tarafından desteklendi. Céline Bouclier maaşı “bölge Occitanie” tarafından finanse edildi. julian Venables’a İngilizce düzenleme için teşekkürler.
Materials
| Accumax solution | Sigma-Aldrich | A7089 | |
| Advanced DMEM/F-12 | Gibco | 12634028 | |
| CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay | Promega | G7570 | |
| Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | Corning | 354230 | |
| Costar 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, | Corning | 3473 | |
| Histiogel Specimen Medium | LabStorage | HG-4000 | |
| Human EGF, premium grade | Miltenyi Biotec | 130-097-751 | |
| Human FGF-2, premium grade | Miltenyi Biotec | 130-093-564 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030081 | |
| N-2 Supplement | Gibco | 17502048 | |
| Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL) | Gibco | 15070063 |
Riferimenti
- Wittekind, C., Neid, M. Cancer invasion and metastasis. Oncology. 69, 14-16 (2005).
- Eger, A., Mikulits, W. Models of epithelial-mesenchymal transition. Drug Discovery Today: Disease Models. 2, 57-63 (2005).
- Palmirotta, R., et al. Liquid biopsy of cancer: a multimodal diagnostic tool in clinical oncology. Therapeutic Advances in Medical Oncology. 10, (2018).
- Hong, B., Zu, Y. Detecting circulating tumor cells: current challenges and new trends. Theranostics. 3, 377-394 (2013).
- vander Toom, E. E., Verdone, J. E., Gorin, M. A., Pienta, K. J. Technical challenges in the isolation and analysis of circulating tumor cells. Oncotarget. 7, 62754-62766 (2016).
- Jin, L., et al. Evaluation of the diagnostic value of circulating tumor cells with CytoSorter® CTC capture system in patients with breast cancer. Cancer Medicine. 9, 1638-1647 (2020).
- Huang, X., et al. Relationship between circulating tumor cells and tumor response in colorectal cancer patients treated with chemotherapy: a meta-analysis. BMC Cancer. 14, 976 (2014).
- Yu, M., et al. Ex vivo culture of circulating breast tumor cells for individualized testing of drug susceptibility. Science. 345, 216-220 (2014).
- Aceto, N., et al. Circulating Tumor Cell Clusters are Oligoclonal Precursors of Breast Cancer Metastasis. Cell. 158, 1110-1122 (2014).
- Grillet, F., et al. Circulating tumour cells from patients with colorectal cancer have cancer stem cell hallmarks in ex vivo culture. Gut. 66, 1802-1810 (2017).
- Lee, W. Y., Hong, H. K., Ham, S. K., Kim, C. I., Cho, Y. B. Comparison of Colorectal Cancer in Differentially Established Liver Metastasis Models. Anticancer Research. 34, 3321-3328 (2014).
- Giraud, J., et al. Progastrin production transitions from Bmi1+/Prox1+ to Lgr5high cells during early intestinal tumorigenesis. Translational Oncology. 14, (2020).
- Xu, L., et al. Optimization and Evaluation of a Novel Size Based Circulating Tumor Cell Isolation System. PLoS One. 10, 0138032 (2015).
- Beije, N., Jager, A., Sleijfer, S. Circulating tumor cell enumeration by the CellSearch system: the clinician’s guide to breast cancer treatment. Cancer Treatment Reviews. 41, 144-150 (2015).
- Karabacak, N. M., et al. Microfluidic, marker-free isolation of circulating tumor cells from blood samples. Nature Protocols. 9, 694-710 (2014).
- Ozkumur, E., et al. Inertial Focusing for Tumor Antigen-Dependent and -Independent Sorting of Rare Circulating Tumor Cells. Science Translational Medicine. 5, (2013).
