Summary
यहां हम एसडी चूहों से बीएमएम के अलगाव के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं, जिसे माध्यमिक पालन विधि कहा जाता है।
Abstract
अस्थि खनिज घनत्व में कमी के साथ, हड्डियों में फ्रैक्चर होने की अधिक संभावना होती है, इस प्रकार रोगी के जीवन की गुणवत्ता को नकारात्मक रूप से प्रभावित किया जाता है। हड्डियों की वृद्धि और विकास मुख्य रूप से ओस्टियोब्लास्ट और ओस्टियोक्लास्ट द्वारा विनियमित होते हैं। यह व्यापक रूप से स्वीकार किया गया है कि ओस्टियोक्लास्ट अस्थि मज्जा मोनोसाइट-मैक्रोफेज कोशिकाओं (बीएमएम) से प्राप्त होते हैं। बीएमएम और अन्य हेमटोपोइएटिक स्टेम सेल अस्थि मज्जा गुहा में स्थित हैं। इसलिए, अलग-अलग और विषम सेल आबादी से एकल स्थिर बीएमएम को अलग करना एक बड़ी चुनौती है। यहां हम एसडी चूहों से बीएमएम के अलगाव के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं, जिसे माध्यमिक पालन विधि कहा जाता है। प्राथमिक संस्कृति में 24-48 घंटे के लिए सुसंस्कृत अनुयायी कोशिकाओं को एकत्र किया गया था। प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण से पता चला है कि लगभग 37.94% कोशिकाएं सीडी 11 बी / सी + (मोनोसाइट-मैक्रोफेज सतह एंटीजन) थीं। टार्ट्रेट प्रतिरोधी एसिड फॉस्फेट (टीआरएपी) धुंधला और पश्चिमी धब्बा विश्लेषण से पता चला है कि बीएमएम इन विट्रो में ओस्टियोक्लास्ट में अंतर कर सकते हैं। उपरोक्त निष्कर्षों ने सुझाव दिया कि माध्यमिक पालन कोशिकाओं को ओस्टियोक्लास्ट भेदभाव अनुसंधान के लिए एक उपयुक्त सेलुलर मॉडल के रूप में माना जा सकता है।
Introduction
यह बताया गया है कि अस्थि मज्जा में मौजूद मोनोसाइट-मैक्रोफेज वंश कोशिकाएं रक्त मोनोसाइट्स और ऊतक मैक्रोफेज 1,2 में अंतर कर सकती हैं। उपरोक्त कोशिकाएं, जो हड्डी के विकास और विकास को संतुलित करने के लिए ओस्टियोक्लास्ट में अंतर कर सकती हैं, आमतौर पर विवो 3,4 में ओस्टियोक्लास्ट को प्रेरित करने के लिए सेल मॉडल के रूप में उपयोग की जाती हैं। अस्थि मज्जा एक विशेष ऊतक है जिसमें कई अलग-अलग प्रकार की कोशिकाएं होती हैं, जिनमें केवल अस्थि मज्जा मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाएं, अस्थि मज्जा मोनोसाइट-मैक्रोफेज कोशिकाएं (बीएमएम), हेमटोपोइएटिक स्टेम कोशिकाएं, एंडोथेलियल कोशिकाएं और प्रतिरक्षा कोशिकाएं शामिल नहीं हैं। वास्तव में, पिछले कई अध्ययनों ने सुझाव दिया कि लंबी हड्डी के अस्थि मज्जा गुहा से बाहर निकलने वाली अनुयायी कोशिकाएं ओस्टियोब्लास्ट, ओस्टियोक्लास्ट, चोंड्रोसाइट्स या एडिपोसाइट्स 5,6,7,8 में अंतर कर सकती हैं। यद्यपि, विभिन्न सजातीय सेल आबादी का उत्पादन करने के लिए विभिन्न अलगाव और संस्कृति विधियों का उपयोग किया गया है, फिर भी विभिन्न प्रकार के सेल प्रकारों से बीएमएम को अलग करने और संवर्धन करने में बड़ी चुनौतियां हैं।
अस्थि मज्जा मोनोन्यूक्लियर मैक्रोफेज (बीएमएससी) निकालने के लिए कई तरीके विकसित किए गए हैं। हालांकि, इनमें से अधिकांश विधियां जटिल 9,10,11 हैं। उदाहरण के लिए, घनत्व ढाल सेंट्रीफ्यूजेशन के लिए एक विशेष किट की आवश्यकता होती है और ऑपरेशन समय लेने वाला और बोझिल होता है। यह विधि उच्च मात्रा वाले रक्त के नमूनों से बीएमएम के अलगाव के लिए उपयुक्त है, लेकिन अस्थि मज्जा के नमूनों 9,12,13 से नहीं। इसके अलावा, कोलेजनेज पाचन का उपयोग करके ऊतक के नमूने निकालना एक जटिल और समय लेने वाली प्रक्रिया है; अस्थि मज्जा नमूने14,15 से बीएमएम के अलगाव के लिए इस विधि की सिफारिश नहीं की जाती है। इसके अलावा, हालांकि प्रवाह पृथक्करण के परिणामस्वरूप अत्यधिक शुद्ध मोनोसाइट / मैक्रोफेज आबादी हो सकती है, इसके लिए बहुत बड़े नमूना आकार और उच्च उपकरण और उपकरण आवश्यकताओं10,16 की आवश्यकता होती है। इसके अतिरिक्त, माइक्रोबीड संवर्धन विधि बेहद महंगी है और एक सामान्य प्रयोगशाला17 में संभव नहीं है।
इसलिए, वर्तमान अध्ययन में अस्थि मज्जा से मोनोन्यूक्लियर मैक्रोफेज के अलगाव के लिए एक सुविधाजनक, तेज़ और सस्ती विधि प्रस्तावित की गई थी। विभिन्न समय बिंदुओं के लिए पालन की जाने वाली अस्थि मज्जा कोशिकाओं का उपयोग माध्यमिक पालन विधि का उपयोग करके बीएमएम को अलग करने के लिए किया गया था। उपरोक्त विधि के साथ निकाले गए बीएमएम इन विट्रो में ओस्टियोक्लास्ट के गठन को प्रेरित कर सकते हैं, इस प्रकार इन विट्रो में ऑस्टियोपोरोसिस के भविष्य के अध्ययन के लिए एक सरल और सुविधाजनक सेल मॉडल प्रदान करते हैं।
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Protocol
इस अध्ययन में सभी प्रयोग झेजियांग चीनी मेडिकल यूनिवर्सिटी प्रयोगशाला पशु अनुसंधान केंद्र (अनुमोदन संख्या: आईएसीयूसी -20181029-11) के पशु प्रयोग दिशानिर्देशों के अनुसार आयोजित किए गए थे।
1. सेल निष्कर्षण
- मिनट की संतुलित दर पर सीओ2 से भरे इच्छामृत्यु पिंजरों में स्प्रैग-डॉली चूहों (एसडी चूहों, 1-10 दिन पुराने, पुरुष या महिला) को रखें। चूहों चेतना खोने के बाद (20-60 मिनट), एक दर्द रहित मौत सुनिश्चित करने के लिए गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा चूहे इच्छामृत्यु।
- कीटाणुशोधन के लिए 10 मिनट के लिए 75% शराब में चूहों विसर्जित।
- ध्यान से कैंची और संदंश के साथ चूहे के सभी अंगों को हटा दें, एक पिपेट का उपयोग पीबीएस के साथ महाप्राण करें और अंगों का पालन करने वाले रक्त को फ्लश करें।
- डीएमईएम के 500 एमएल में 5 एमएल पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन समाधान जोड़ें और अच्छी तरह से मिलाएं। 50 एमएल बाँझ अपकेंद्रित्र ट्यूब लें, एफबीएस के 5 एमएल और डीएमईएम माध्यम के 45 एमएल जोड़ें, और 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन समाधान युक्त 10% एफबीएस डीएमईएम प्राप्त करने के लिए अच्छी तरह से मिलाएं। उपरोक्त संस्कृति माध्यम के 2 एमएल को 5 एमएल ट्यूब में जोड़ें।
- अंग की हड्डियों को 5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें। ट्यूब में अंग की हड्डियों को छोटे टुकड़ों (1-3 मिमी) में काटने के लिए कैंची का उपयोग करें और संस्कृति माध्यम में अस्थि मज्जा कोशिकाओं को फिर से निलंबित करने के लिए होमोजेनेट मिलाएं। ट्यूब के नीचे बसे ऊतक टुकड़े जब तक 5 मिनट के लिए खड़े हो जाओ।
- 100 मिमी संस्कृति पकवान में 10% एफबीएस डीएमईएम के 10 एमएल जोड़ें, और फिर सतह पर तैरनेवाला को संस्कृति पकवान में स्थानांतरित करें। सतह पर तैरनेवाला की आकांक्षा करते समय, ऊतक मलबे को संस्कृति पकवान में स्थानांतरित करने से बचें।
- लगभग24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 पर सेते हैं। इस इनक्यूबेशन समय के बाद, अधिकांश मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाएं संस्कृति पकवान की दीवार का पालन करेंगी और धीरे-धीरे बढ़ेंगी, जबकि अधिकांश बीएमएम अभी भी संस्कृति माध्यम में निलंबित रहेंगे।
- एक नए 25सेमी 2 फ्लास्क के लिए 100 मिमी संस्कृति पकवान में सेल निलंबन हस्तांतरण और एक अतिरिक्त24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 पर कोशिकाओं की खेती करने के लिए जारी है। पुराने माध्यम को ध्यान से निकालें और बीएमएम के फ्लास्क दीवार का पालन करने के बाद ताजा माध्यम से बदलें।
- उप-संस्कृति जब फ्लास्क में कोशिकाएं 80% -90% संगम तक पहुंच जाती हैं।
नोट: सभी कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर सुसंस्कृत किया गया था। संस्कृति के दौरान, सेल आकृति विज्ञान धीरे-धीरे एकीकृत किया गया था। कोशिकाएं बड़ी, अनियमित आकार की, रेडियल रूप से बढ़ती थीं और डिस्क के रूप में फ्लास्क से जुड़ी होती थीं, जहां कई नाभिक देखे जा सकते थे।
2. सेल के एफएसीएस धुंधला
- 37 डिग्री सेल्सियस पर वाणिज्यिक ट्रिप्सिन के 1-2 एमएल का उपयोग करके ट्रिप्सिन डाइजेस्ट और 5 मिनट के लिए 5% सीओ2 और 100,000 / नमूना (न्यूबॉयर हेमोसाइटोमीटर के साथ गिनती कोशिकाओं) की अंतिम सेल गिनती सुनिश्चित करने के लिए माध्यमिक अनुयायी कोशिकाओं की गिनती करें।
- कोशिकाओं को तीन समूहों में विभाजित करें (पीबीएस के 500 μL में 100,000 कोशिकाएं होती हैं): (1) रिक्त नियंत्रण समूह जिसमें बिना दाग वाली कोशिकाएं होती हैं; (2) आइसोटाइप नियंत्रण समूह; और (3) प्रयोगात्मक समूह (सीडी 11 बी /
- 30 मिनट के लिए बर्फ पर प्राथमिक एंटीबॉडी (रिक्त नियंत्रण समूह के लिए कोई एंटीबॉडी नहीं; आइसोटाइप नियंत्रण समूह के लिए एंटी-सीडी 11 आइसोटाइप नियंत्रण, एंटीबॉडी / नमूना का 0.6 μL, 1 μg / नमूना; प्रयोगात्मक समूह के लिए एंटी-सीडी 11 बी / सी, एंटीबॉडी / नमूना का 1 μL, 1 μg / नमूना) सेते हैं।
- 5 मिनट के लिए 300-350 एक्स जी पर अपकेंद्रित्र, सतह पर तैरनेवाला त्यागें, और पीबीएस के 500 μL के साथ कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। यह सुनिश्चित करने के लिए कि अनबाउंड प्राथमिक एंटीबॉडी धोए जाते हैं, उपरोक्त प्रक्रिया को एक बार दोहराएं।
- इसी माध्यमिक एंटीबॉडी (रिक्त नियंत्रण समूह के लिए कोई एंटीबॉडी; आइसोटाइप नियंत्रण और प्रयोगात्मक समूहों के लिए बकरी विरोधी खरगोश आईजीजी, 0.25 μL एंटीबॉडी / नमूना, 1: 2,000) 30 मिनट के लिए अंधेरे में बर्फ पर सेते हैं।
- 5 मिनट के लिए 300-350 एक्स जी पर अपकेंद्रित्र, सतह पर तैरनेवाला त्यागें, और पीबीएस के 500 μL के साथ कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। यह सुनिश्चित करने के लिए कि अनबाउंड दूसरी एंटीबॉडी धोया जाता है, उपरोक्त प्रक्रिया को एक बार दोहराएं।
- प्रवाह साइटोमेट्री (10,000 कोशिकाओं / नमूना) द्वारा सीडी 11 बी / सी सकारात्मक कोशिकाओं का पता लगाएं और सॉफ्टवेयर द्वारा डेटा का विश्लेषण करें (उदाहरण के लिए, फ्लोजो 7.5)।
नोट: सीडी 11 बी / सी + कोशिकाओं का अंतिम प्रतिशत प्राप्त करने के लिए, निम्नलिखित सूत्र का उपयोग किया गया था: प्रयोगात्मक समूह में सीडी 11 बी / सी + कोशिकाओं का प्रतिशत - आइसोटाइप नियंत्रण समूह में सीडी 11 + कोशिकाओं का प्रतिशत।
3. राइट-गिएम्सा धुंधला हो जाना
- अनुयायी माध्यमिक कोशिकाओं को बीज दें जिन्हें 35 मिमी2 सेल चढ़ाई शीट (1 × 106 कोशिकाओं / अच्छी तरह से) और 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति और24 घंटे के लिए 5% सीओ 2 पर तीन बार पारित किया गया है।
- संस्कृति माध्यम को त्यागें और पीबीएस के साथ तीन बार धोएं।
- 1 मिनट के लिए सेल चढ़ाई शीट में राइट-गीमसा डाई समाधान (0.5 एमएल -0.8 एमएल) जोड़ें।
- कपास झाड़ू के साथ आसुत जल (0.5 एमएल -0.8 एमएल) के साथ डाई मिलाएं, और 10 मिनट के लिए खड़े हो जाओ।
- आसुत पानी के साथ डाई समाधान धो लें, और फिर 1-3 मिनट के लिए सूखजाएं। एक माइक्रोस्कोप के नीचे निरीक्षण करें।
4. जाल धुंधला
- अनुयायी माध्यमिक कोशिकाओं को बीज दें जिन्हें 35 मिमी2 सेल चढ़ाई शीट (1 × 106 कोशिकाओं / अच्छी तरह से) और 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति और24 घंटे के लिए 5% सीओ 2 पर तीन बार पारित किया गया है।
- पुराने माध्यम को 10% एफबीएस डीएमईएम या ओस्टियोक्लास्ट प्रेरण माध्यम के साथ बदलें, जो परमाणु कारक-βB लिगैंड (आरएएनकेएल) के 50 एनजी / एमएल रिसेप्टर एक्टिवेटर और मैक्रोफेज कॉलोनी-उत्तेजक कारक (एम-सीएसएफ) के 30 एनजी / एमएल के साथ पूरक है, और अतिरिक्त 7 दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर संस्कृति।
- निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार ट्रैप धुंधला किट के साथ कोशिकाओं को दाग दें और माइक्रोस्कोप के तहत निरीक्षण करें।
नोट: ट्रैप पॉजिटिव कोशिकाओं को ओस्टियोक्लास्ट के रूप में परिभाषित किया गया था, जो प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत बैंगनी थे। ट्रैप-पॉजिटिव कोशिकाओं की संख्या को इमेजजे सॉफ्टवेयर का उपयोग करके मापा गया था।
5. पश्चिमी धब्बा
- 35 मिमी 2 सेल चढ़ाई चादरें (1 × 106 कोशिकाओं / अच्छी तरह से) और24 घंटे के लिए संस्कृति पर तीन बार पारित किया गया है कि अनुयायी माध्यमिक कोशिकाओं बीज।
- पुराने माध्यम को ताजा 10% एफबीएस डीएमईएम या ओस्टियोक्लास्ट प्रेरण माध्यम (आरएएनकेएल के 50 एनजी / एमएल और एम-सीएसएफ के 30 एनजी / एमएल) और 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर अतिरिक्त 7 दिनों के लिए संस्कृति के साथ बदलें।
- आरआईपीए बफर के साथ कुल सेलुलर प्रोटीन निकालें, 10% एसडीएस-पेज द्वारा अलग करें, और पॉलीविनाइलिडीन फ्लोराइड झिल्ली18,19 में स्थानांतरित करें।
- 2 घंटे के लिए 5% स्किमिल्क पाउडर (25 एमएल) के साथ ब्लॉक करें और टीबीएस-ट्वीन 20 (टीबीएसटी) के साथ हर बार 10 मिनट के लिए तीन बार धोएं।
- रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर प्राथमिक एंटीबॉडी सेते हैं (एंटी-β-एक्टिन, एंटी-ट्रैप, और एंटी-कैथेप्सिन के; सभी प्राथमिक एंटीबॉडी 1: 1,000, 10 एमएल पतला एंटीबॉडी /
- 2 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर माध्यमिक एंटीबॉडी (बकरी विरोधी खरगोश आईजीजी, 1: 2,000 कमजोर पड़ने, 10 एमएल पतला एंटीबॉडी / बैंड) सेते हैं, और टीबीएसटी के साथ तीन बार धोलें। एक विकासशील समाधान का उपयोग कर प्रोटीन बैंड की कल्पना करें।
नोट: उपरोक्त प्रोटीन की अभिव्यक्ति के स्तर को β-एक्टिन के लिए सामान्यीकृत किया गया था।
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Representative Results
माध्यमिक अनुयायी कोशिका आबादी स्थिर और समान थी। निरंतर सेल प्रसार के साथ, अधिकांश कोशिकाएं अनियमित आकार के साथ बड़ी हो गईं और रेडियल अनुयायी डिस्क (चित्रा 2 सी, डी) में बढ़ीं। प्रवाह साइटोमेट्री से पता चला है कि मोनोसाइट-मैक्रोफेज वंश कोशिकाओं की सतह पर एक आणविक मार्कर सीडी 11 बी / सी व्यक्त करने वाली कोशिकाओं का प्रतिशत लगभग 37.94% था (चित्रा 2 ए, बी)। आगे यह सत्यापित करने के लिए कि सीडी 11 बी / सी सकारात्मक कोशिकाएं मोनोसाइट-मैक्रोफेज वंश कोशिकाएं थीं, ओस्टियोक्लास्ट में माध्यमिक अनुयायी कोशिकाओं का भेदभाव आरएएनकेएल और एम-सीएसएफ के साथ सेल उपचार के बाद प्रेरित किया गया था। ट्रैप धुंधला परिणामों से पता चला है कि नियंत्रण समूह की तुलना में, आरएएनकेएल और एम-सीएसएफ (चित्रा 2 ई, एफ) के साथ प्रेरित कोशिकाओं में इंट्रासेल्युलर बैंगनी-लाल कणिकाओं की संख्या में काफी वृद्धि हुई थी। इसके अलावा, ओस्टियोक्लास्ट-विशिष्ट प्रोटीन ट्रैप और कैथेप्सिन के अभिव्यक्ति स्तर में काफी वृद्धि हुई थी (चित्रा 2 जी, एच)।
चित्र 1: द्वितीयक अनुयायी सेल निष्कर्षण विधि का प्रवाह चार्ट। कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2: (ए-बी) माध्यमिक अनुयायी कोशिकाओं की स्थिर संस्कृति की तीन पीढ़ियों के बाद, प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा सीडी 11 बी / (सी-डी) तीन पीढ़ियों के बाद माध्यमिक अनुयायी कोशिकाओं की आकृति विज्ञान दिखाया गया है (सफेद प्रकाश के लिए सी, राइट-गीम्सा धुंधला के लिए डी)। (ई-एफ) टीआरएपी धुंधला ऑस्टियोक्लास्ट गठन पर आरएएनकेएल और एम-सीएसएफ के प्रभाव का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया था (नियंत्रण के लिए ई; आरएएनकेएल और एम-सीएसएफ के लिए एफ)। (जी-एच) कोशिकाओं को 7 दिनों के लिए आरएएनकेएल और एम-सीएसएफ के साथ इलाज किया गया था और ट्रैप और कैथेप्सिन के अभिव्यक्ति स्तर पश्चिमी धब्बा विश्लेषण द्वारा निर्धारित किए गए थे। डेटा को तीन स्वतंत्र प्रयोगों के माध्य ± एसडी के रूप में व्यक्त किया जाता है। पी < 0.001 बनाम नियंत्रण समूह। ट्रैप, टार्ट्रेट प्रतिरोधी एसिड फॉस्फेट; आरएएनकेएल, परमाणु कारक-εB लिगैंड के रिसेप्टर उत्प्रेरक; एम-सीएसएफ, मैक्रोफेज कॉलोनी-उत्तेजक कारक। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
तालिका 1: मैक्रोफेज निकालने की विधि कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
ओस्टियोक्लास्ट हड्डी रोगों की घटना और विकास में शामिल सबसे महत्वपूर्ण सेल प्रकारों में से एक है, साथ ही हड्डी रोग अनुसंधान की प्राथमिक वस्तुओं में से एकहै 20. मैक्रोफेज ऑस्टियोक्लास्ट में अंतर कर सकते हैं। चूंकि मोनोन्यूक्लियर मैक्रोफेज (रॉ 264.7 कोशिकाएं) खरीदने के लिए बहुत महंगी हैं और संस्कृति के दौरान आसानी से सक्रिय होती हैं, इसलिए इस सेल लाइन का उपयोग करके इन विट्रो भेदभाव प्रयोगों को करना मुश्किल है। यद्यपि अस्थि मज्जा से मोनोसाइट्स /मैक्रोफेज निकालने के लिए कई तरीके विकसित किए गए हैं, जिनमें घनत्व ढाल सेंट्रीफ्यूजेशन, कोलेजनेज पाचन, माइक्रोस्फीयर संवर्धन और प्रवाह साइटोमेट्री (तालिका 1) शामिल हैं, ये विधियां समय लेने वाली हैं, जबकि उन्हें उच्च नमूना मात्रा और महंगे उपकरणों की आवश्यकता होती है। इसलिए, वर्तमान अध्ययन का उद्देश्य अस्थि मज्जा के नमूनों से मोनोसाइट / मैक्रोफेज निकालने के लिए एक सरल और तेज़ विधि का प्रस्ताव करना है।
अस्थि मज्जा में कई कोशिका आबादी हैं, जिनमें बीएमएम के अलावा बीएमएससी, एंडोथेलियल कोशिकाएं और प्रतिरक्षा कोशिकाएं शामिल हैं। जैसा कि हम सभी जानते हैं कि बीएमएससी ओस्टियोब्लास्ट में अंतर कर सकते हैं, और यह प्रक्रिया ओस्टियोक्लास्ट21 में बीएमएम के भेदभाव को प्रभावित करेगी। इन विट्रो में ओस्टियोक्लास्ट भेदभाव को प्रेरित करने के लिए समान और स्थिर बीएमएम महत्वपूर्ण कारक हैं, इसलिए बीएमएम को अलग करने और निकालने के दौरान इन सीमित कारकों पर विचार करना विशेष रूप से महत्वपूर्ण है। इसी समय, बीएमएम की ओस्टियोक्लास्ट में अंतर करने की क्षमता भी निरंतर मार्ग के दौरान कमजोर हो जाएगी। इसलिए, अस्थि मज्जा से बीएमएम को अलग करना और उन्हें ओस्टियोक्लास्ट में सफलतापूर्वक प्रेरित करना चुनौतीपूर्ण है।
हमने पाया कि अस्थि मज्जा में अनुयायी कोशिकाओं के पालन समय में अंतर है। अधिक विशेष रूप से, बीएमएससी मूल रूप से संस्कृति के 0-24 घंटे के दौरान संस्कृति पकवान की दीवार का पालन करते हैं, जबकि बीएमएम 24 घंटे के बाद संस्कृति पकवान की दीवार का पालन करना शुरू करते हैं। उपरोक्त खोज के आधार पर, बीएमएम को अलग करने के लिए माध्यमिक पालन विधि का चयन किया गया था चूसना एसडी चूहों (उम्र, 1-10 दिन पुराना) को बीएमएम निकालने के लिए चुना गया था, क्योंकि युवा चूहों के बीएमएम एक मजबूत भेदभाव क्षमता प्रदर्शित करते हैं। एसडी चूहों की अस्थि मज्जा कोशिकाओं को एकत्र किया गया था, और 24 घंटे के लिए संवर्धन के बाद, सेल निलंबन को स्थानांतरित कर दिया गया था और एक और 24 घंटे के लिए सुसंस्कृत किया गया था। एकत्रित माध्यमिक अनुयायी कोशिकाओं में बड़ी संख्या में बीएमएम थे। संस्कृति के बाद, माध्यमिक अनुयायी कोशिकाओं को धीरे-धीरे शुद्ध किया गया और स्थिर और समान हो गया। प्रवाह साइटोमेट्री परिणामों से पता चला है कि सीडी 11 बी / सी सकारात्मक कोशिकाओं का प्रतिशत लगभग 37.94% तक पहुंच गया। इसके अलावा, ट्रैप धुंधला और पश्चिमी धब्बा विश्लेषण से पता चला है कि निकाले गए बीएमएम ऑस्टियोक्लास्ट में अंतर कर सकते हैं। यह खोज पिछले अध्ययन के अनुरूप थी, जिसमें यह भी सुझाव दिया गया था कि माध्यमिक पालन विधि द्वारा निकाले गए बीएमएम को ओस्टियोक्लास्ट22 में सफलतापूर्वक विभेदित किया जा सकता है।
माध्यमिक पालन विधि का उपयोग उच्च तकनीक प्रयोगशाला उपकरणों की आवश्यकता के बिना अस्थि मज्जा से मोनोन्यूक्लियर मैक्रोफेज को आसानी से और जल्दी से निकालने के लिए किया जा सकता है। इसी समय, यह विधि एक छोटे अस्थि मज्जा नमूने से कोशिकाओं को अलग करने के लिए उपयुक्त है, इस प्रकार मोनोन्यूक्लियर मैक्रोफेज निकालने के लिए आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले पिछले तरीकों में देखी गई बोझिल और समय लेने वाली कठिनाइयों पर काबू पाने के लिए। कुल मिलाकर, माध्यमिक पालन विधि द्वारा निकाले गए बीएमएम को इन विट्रो में ओस्टियोक्लास्ट में सफलतापूर्वक विभेदित किया जा सकता है, इस प्रकार ओस्टियोक्लास्ट के इन विट्रो अध्ययन के लिए एक स्थिर सेल मॉडल प्रदान किया जा सकता है।
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Disclosures
लेखकों ने घोषणा की है कि उनके पास कोई प्रतिस्पर्धी हित नहीं है।
Acknowledgments
इस काम को झेजियांग प्रांत के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया था (अनुदान सं। एलवाई 19 एच 060001) और झेजियांग पारंपरिक चीनी चिकित्सा विज्ञान और प्रौद्योगिकी योजना परियोजना (संख्या 2022 जेडबी 0 9 3)।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm2 cell climbing slices | NEST Biotechnology | 80102 | |
| Anti-cathepsin K | Abcam | ab19027 | 1:1,000 |
| Anti-CD11 isotype control | Abcam | ab172730 | 1 μg/test,1.675 mg/Ml |
| Anti-CD11b/c | Absin | abs124232 | 1μg/test, 1 mg/mL |
| Anti-TRAP | Abcam | ab191406 | 1:1,000 |
| Anti-β-actin | Beyotime | AF5003 | 1:1,000 |
| Cell climbing slices | NEST Biotechnology | 80102 | |
| Cell culture dish | corning | 430167 | |
| Cell culture flask | corning | 430168 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Gibco | C11995500BT | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10099141C | |
| Goat anti-rabbit IgG | Abcam | ab150077 | for IF, 1:2,000 |
| goat anti-rabbit IgG | Abcam | ab6721 | for WB, 1:2,000 |
| M-CSF | Pepro tech | 400-28 | |
| PBS | Biosharp | BL302A | |
| RANKL | Pepro tech | 400-30 | |
| SD rat | Shanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd | 1-10 days old | |
| SDS-PAGE gel preparation kit | Solarbio | P1200 | |
| TRAP/ALP Staining Kit | Wako | 294-67001 | |
| Trypsin-EDTA solution | Biosharp | BL512A | |
| Wright-Giemsa solution | Keygen Biotech | KGA225-1 |
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