Summary
在这里,我们描述了三种类型的禽胚胎皮肤外植体培养物的方案,可用于检查组织相互作用、4D 成像延时电影(3D 加时间)、分子功能的全局或局部扰动以及系统生物学表征。
Abstract
在胚胎发生过程中发育的鸟类皮肤是一个独特的模型,可以为组织模式化提供有价值的见解。这里描述了皮肤外植体培养的三种变体,以检查皮肤发育的不同方面。首先, 离体 器官培养和操作为研究人员提供了直接观察和研究羽毛芽发育的机会。皮肤外植体培养物可以生长 7 天,从而能够直接分析细胞行为并在此生长期间每隔一段时间进行 4D 成像。这还允许对培养条件进行物理和分子操作,以可视化组织反应。例如,生长因子包被的珠子可以局部应用,以在有限的区域内诱导羽毛图案的变化。或者,病毒转导可以在培养基中在全球范围内递送,以上调或下调基因表达。其次,皮肤重组方案使研究人员能够研究表皮和间充质之间的组织相互作用,这些相互作用来自不同的皮肤区域、不同的生命阶段或不同的物种。这提供了一个机会来测试上皮细胞能够对信号做出反应的时间窗口,以及它形成不同皮肤附属物以响应来自不同间充质来源的信号的能力。第三,使用与完整上皮细胞覆盖的解离真皮细胞进行皮肤重建,可以重置皮肤发育,并能够研究周期性图案的初始过程。这种方法还增强了我们在创建重建的皮肤外植体之前操纵解离细胞中基因表达的能力。本文提供了三种培养方案和示例实验来证明其实用性。
Introduction
禽胚胎皮肤发育是研究形态发生机制的极好模型,因为它具有独特的模式以及显微外科手术和操作的可及性1,2。然而,评估完整组织中的细胞和分子事件可能很困难,因为外来组织的存在会使显微镜观察复杂化。此外,操纵基因表达以测试其在皮肤形态发生中的作用的能力并不总是一项简单的任务。我们发现我们可以使用逆转录病毒转导来测试基因功能,使用皮肤外植体模型具有更高的成功率。在这里,我们讨论了已经开发的三种皮肤外植体模型的优点。
禽胚胎皮肤培养是一种强大的系统,用于评估皮肤羽毛芽发育过程中的细胞行为、基因调控和功能3,4,5,6。它允许通过在培养基中放置生长因子的全局添加或它们从生长因子包被的珠子中局部释放来评估羽毛芽发育的分子机制。发育调控基因也可以使用完整或显性阴性形式的病毒基因转导进行操作,用于功能研究,评估它们在特定形态发生事件中的作用 7,8。
禽上皮-间充质重组培养 使研究人员能够确定每种皮肤成分在皮肤形态发生的早期阶段的贡献。罗尔斯(Rawles)对这种方法的使用揭示了间充质和上皮之间的相互作用对于形成皮肤附属物至关重要9。间充质可以形成凝结,需要上皮来诱导和维持间充质凝结的形成2.后来,这种方法被用来评估 为什么无鳞 鸡无法形成羽毛。发现缺陷位于间充质10 中。Dhouailly对不同物种的胚胎进行了组织上皮-间充质重组研究。这些研究为促进皮肤形态发生的上皮-间充质通讯提供了发育和进化的见解3.
这项研究被用来更好地了解控制羽毛生长的因素。该方法还改善了在羽毛起始、发育和沿前后轴伸长过程中发生的皮肤图案中涉及的细胞和分子事件的可视化。当上皮细胞与间充质分离,然后将两种成分重新组合时,新的相互作用会重新建立皮肤模式。这种方法使我们能够评估间充质诱导信号和上皮能力分子,这些信号和上皮能力分子使表皮能够对间充质信号做出反应11。还可以检查羽毛芽发育和模式形成所需的后续下游分子表达。这些研究已经确定,芽的位置是由间充质控制的。在与间充质重组之前,上皮细胞的旋转 90o 表明羽毛芽伸长的方向受上皮细胞的控制。该方法对于我们研究调控羽毛芽取向的分子机制至关重要12。
禽皮肤重建培养,其中皮肤间充质解离为单细胞,然后以高细胞密度铺板并覆盖完整的上皮,将真皮细胞重置为原始状态。然后,外植体自我组织,形成独立于先前线索的新周期性模式13。这种皮肤重建模型可用于研究羽毛周期性图案的初始过程。我们使用这种方法来探索调节间充质细胞与单块上皮细胞的比例如何影响羽毛芽的大小或数量。发现随着间充质细胞比例的增加,芽的数量增加,但芽的大小没有增加。这种方法的另一个优点是,间充质细胞病毒转导比其他两种培养条件显示出更高的效率,并且可以产生更明显的表型。
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Protocol
1.鸡皮外植体培养(图1)
- 在38°C的加湿培养箱中孵育受精的鸡蛋,并根据汉堡和汉密尔顿14进行分期。
- 在第 28 阶段 (~E5.5),肢体的第二趾和第三脚趾比其他趾长;三个手指和四个脚趾是不同的。
- 在第 29 阶段 (~E6),机翼在肘部弯曲;第二个数字明显比其他数字长。
- 在第 30 阶段 (~E6.5),在肱水平上可以看到脊髓两侧的两个背羽芽行,在腿水平上可以看到三排。
- 在第 31 阶段 (~E7),在巨骶层有 ~7 排羽毛。
- 在第 32 阶段,在腿的水平上存在 11 行或更多行的羽毛芽。
- 将阶段 28-32 鸡胚胎放入含有 Hanks 缓冲盐水溶液 (HBSS) 或磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 的 60 mm 培养皿中。
- 解剖下颈部到尾部区域之间的胚胎背侧皮肤。用剪刀将头部从颈部取下。轻轻拉动肢芽,将身体的腹侧向下放置,使附属物向外展开。
- 使用钟表匠的镊子或锋利的弹簧剪刀在胚胎体的两侧沿着皮肤做一个从前到后的切口。一定要用一把镊子纵向捏住肢芽来稳定身体。使用钟表师的镊子轻轻从颈部到尾部区域或从尾部到颈部轻轻剥离皮肤。
- 轻轻去除仍然附着在脱皮皮肤上的皮下组织,并用锋利的弹簧剪刀抚平皮肤边缘。
- 将 2 mL/孔补充有 10% 胎牛血清 (FBS) 和青霉素/链霉素溶液(1:100 稀释)的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 (DMEM) 加入 6 孔培养皿中的孔中。加入培养基和抗生素后,将无菌组织培养插入物放入孔内,使培养基位于培养物插入物的外部。
- 用刮刀将皮肤转移到培养插入物上,表皮朝上,间充质面朝下,插入膜上。为确保皮肤平坦无皱纹,请在 HBSS 中将皮肤拉到刮刀上。用液体将皮肤从刮刀上滑下,以促进皮肤的转移而不折叠。
- 用 200 μL 移液管从培养插入物中去除多余的 HBSS。在培养插入物内留下一层薄薄的 HBSS,以保持外植体半湿,以提供气液界面。
- 在37°C下使用5%CO2 和95%空气孵育皮肤外植体培养物。每 2 天更换一次培养基。
注意:此过程已发布4.该培养系统也可用于其他鸟类的皮肤,如鹌鹑或雀类皮肤外植体培养物。
2.鸡皮上皮-间充质重组(图2)
- 在38°C的潮湿培养箱中孵育受精的鸡蛋,并根据汉堡和汉密尔顿14 (第1.1节)对胚胎进行分期。
- 用 0.25% 乙二胺四乙酸 (EDTA) 缓冲液制备 2x 无钙镁 (CMF) 盐水。
- 制备10x CMF缓冲液(NaCl(1.37M)80g,KCl(0.04M)3g,NaH2PO 4(0.004M)0.5g,KH2PO 4(2M)0.25g,NaHCO3 (0.12M)10g,葡萄糖(0.1M)20g在1,000mL蒸馏水中。将 pH 值调节至 7.3。要用0.25%EDTA缓冲液制备100 mL 2x CMF,应先将EDTA溶解在80 mL蒸馏水中,然后加入20 mL 10x CMF缓冲液,用0.25%EDTA工作溶液制备2x CMF。
- 如上所述(第1.2节)在HBSS中解剖30-32个鸡胚背皮,并将它们在2x CMF盐水中用0.25%EDTA在冰上孵育15-20分钟。
- 使用钟表匠的镊子小心地分离上皮和间充质。将分离的上皮细胞和间充质转移到含有HBSS的干净培养皿中。
- 首先将间充质放在含有HBSS的培养皿上,然后将上皮细胞与间充质重新结合,然后将上皮细胞放在间充质的顶部。将上皮沿与间充质相同的前后轴放置,或将上皮从间充质的前后轴旋转 90o ,以确定哪种成分调节皮肤形态发生的不同方面。
- 将重组的皮肤转移到 6 孔培养皿中的培养插入物中进行生长,并去除重组皮肤周围多余的 HBSS。
- 将 2 mL 含有 10% FBS 的 DMEM 培养基放入插入物外的孔中。在插入室内放置一层薄薄的 DMEM,以保持外植体半湿,以提供气液界面。
- 在37°C的5%CO2 和95%空气的混合物中孵育皮肤重组体。每 2 天更换一次培养基。使用安装在解剖显微镜上的相机进行延时摄影,记录皮肤发育初始皮肤阶段的表型变化。
注意:此过程已发布11.
3. 鸡皮重建(图3)
- 在38°C的潮湿培养箱中孵育受精的鸡蛋,并根据汉堡和汉密尔顿14 (第1.1节)对胚胎进行分期。
- 在 HBSS 中解剖 30-33 阶段鸡胚背皮。如上所述,将皮肤在含有0.25%EDTA的2x CMF盐水中在冰上孵育15-20分钟(第2.3节)。
- 使用钟表匠的镊子小心地分离上皮和间充质。将分离的上皮细胞和间充质转移到冰上的HBSS中。
注意:在将上皮与间充质分离时,注意不要损坏上皮的基底层。 - 将分离的间充质收集在15mL离心管中,并在37°C水浴中与PBS中制备的0.1%胶原酶/胰蛋白酶溶液孵育10-15分钟。
- 用巴斯德移液管解离皮肤间充质,制成单细胞悬浮液。加入含有 10% FBS 的 DMEM 以停止消化。
- 将细胞沉淀并以 233 × g 离心 5 分钟。用浓度为 2 × 107 个细胞/mL 的培养基重悬细胞。
注意:在此步骤中,间充质细胞也可以在含病毒的培养基中在冰上重悬2-3小时以进行基因转导。 - 将细胞培养插入物放入 6 孔培养皿的一个孔中。将 10 μL 的 2 × 107 个细胞/mL 间充质细胞滴在组织培养插入物上。将 2 ml 含有 10% FBS 的 DMEM 培养基放入插入物外的孔中。使用5%CO2 和95%空气培养箱在37°C下孵育接种的间充质细胞1小时,以使细胞沉降在插入膜上。
- 使用 1 mL 移液管将完整的上皮转移到铺板的间充质液滴顶部,使上皮基底细胞层朝向间充质细胞。
注意:当将上皮转移到间充质液滴时,不应干扰间充质细胞。 - 将完整的上皮压平在间充质上,使重建的皮肤外植体。在插入物上留有一层薄薄的培养基,以保持重建的皮肤外植体半湿,以提供气液界面。在37°C的5%CO2 和95%空气培养箱中孵育重建的皮肤外植体。每 2 天更换一次培养基。
注意:此过程已发布13.
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Representative Results
皮肤外植体培养
从离体皮肤器官培养物中可以直接在显微镜下观察到羽毛芽的发育。使用鸡第 30 阶段背皮的皮肤外植体培养模型,沿中线可以看到斑块。然后,形态发生前沿逐渐向皮肤周边横向传播,形成新的羽毛原基。这些羽毛原基在培养 2 天后会发育成短羽毛芽,培养 4 天后会发育成长羽毛芽(图 1)。
皮肤重组培养
对于皮肤重组,当上皮细胞和间充质重新结合时,原始的斑块会消失。新的斑块将在重组后不久出现,并在培养 2 天和 4 天后分别发育形成短羽芽和长羽芽。如果上皮细胞相对于间充质旋转90°,则伸长芽的方向将由上皮细胞确定(图2)。
皮肤重建培养
对于皮肤重建, 离体 器官培养物首先看起来均匀,然后在培养 1 天后同时形成间距均匀的真皮凝结。应该注意的是,羽毛芽的数量取决于间充质细胞的数量。间充质数量越少,形成11 个大小相近的芽就越少。培养 2-3 天后会形成短羽毛芽,培养 4-5 天后会形成长羽毛芽(图 3)。
图4显示了 离体 皮肤器官培养、皮肤重组器官培养和皮肤重建器官培养的摘要图。
图 1: 离体 皮肤器官培养。 将阶段32鸡胚皮肤在HBSS中解剖,并在6孔培养插入物(T0,时间0)中培养2天和4天。羽毛原基在培养 2 天后发育成短羽毛芽,培养 4 天后发育成长羽毛芽。真皮斑块用白色箭头表示。请注意,中线的芽比两侧的芽更成熟。该方法已根据江和庄4进行了修改。比例尺 = 500 μm。缩写:HBSS = Hank's 缓冲盐水溶液。 请点击这里查看此图的较大版本.
图2: 离体 皮肤重组器官培养。 在HBSS中解剖第32阶段鸡胚皮肤,并在2x CMF缓冲液中分离上皮和间充质。将皮肤上皮和间充质在有或没有旋转的情况下重新组合,并培养2天和4天。新的板状物在培养 2 天和 4 天后发育成短羽毛芽和长羽毛芽。如果上皮细胞相对于间充质旋转 90°,则新芽的方向由上皮细胞12 确定。该方法已根据Chuong等人11进行了修改。比例尺 = 500 μm。缩写:CMF = 钙镁含量。 请点击这里查看此图的较大版本.
图3: 离体 皮肤重建器官培养。 解剖第32阶段鸡胚皮肤,并在2x CMF缓冲液中分离上皮和间充质。间充质通过0.1%胶原酶和胰蛋白酶解离成单细胞,并在培养插入物上以高细胞密度沉淀。将真皮细胞沉淀用完整的上皮细胞(T0,时间0)重建,并培养6小时,2天和5天。外植体首先看起来是均匀的(6小时),然后在培养1天后同时形成间距均匀的真皮凝结。培养 2-3 天后会形成短羽芽,培养 4-5 天后会形成长羽毛芽。该方法根据江等人13进行了修改。比例尺 = 500 μm. 请点击这里查看此图的较大版本.
图 4: 离体 皮肤器官培养模型图。 皮肤从 E6.5 开始,作为覆盖间充质细胞的单层上皮细胞。这在三种外植体方法的顶部进行了描述。(A) 离体 皮肤器官培养。将皮肤完整地铺在空气中的培养插入物顶部:在37°C的5%CO2 和95%空气培养箱中进行培养基界面。(B)离体 皮肤重组器官培养。将皮肤上皮从间充质中分离出来,然后重新结合,然后在空气中接种到细胞培养插入物上:在37°C的5%CO2 和95%空气培养箱中进行培养基界面。(C) 离体 皮肤重建器官培养。皮肤上皮与间充质分离。然后将间充质解离成单细胞悬浮液,并将间充质细胞在离心机中沉淀。然后将间充质细胞以 2 × 107 个细胞/mL 的浓度重悬,并将 10 μL 的悬浮液置于培养插入物上,然后覆盖有一块完整的表皮。培养物在空气中孵育:在37°C的5%CO2 和95%空气培养箱中进行培养基界面。 请点击这里查看此图的较大版本.
补充图S1:表达GFP病毒的间充质细胞转导。 将解离的间充质细胞(2 × 107 个细胞/mL)与表达绿色荧光蛋白 (GFP) 的 >107 个感染单位/mL 具有复制能力的禽肉瘤病毒在冰上孵育 3 小时。然后使用间充质细胞形成重建的皮肤器官培养物,如上述方案第3节所述,并在24小时后拍照。数据显示,~40%的间充质细胞用GFP标记。 请点击这里下载此文件。
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Discussion
组织重组提供了一种探索上皮细胞和间充质独特贡献的测定方法。在鸡中,羽毛在胚胎第 7 天 (E7) 开始发育,而鳞片从 E9 开始发育。当E9鳞片间充质与E7羽毛上皮重组时,重组组织形成鳞片,当E7羽毛间充质与E9鳞片上皮羽毛重组时形成11。这些研究表明,间充质控制着模式形成、间距和器官身份。当然,上皮细胞必须有能力能够适当地接收和解释间充质信号。能力只存在于上皮细胞中很短的时间间隔。与上述结果相反,令人惊讶的是,当鸡口腔粘膜和口腔E5上皮与E8躯干间充质重新结合时,口腔上皮形成羽毛;然而,口腔粘膜形成多个牙齿状附属物15。这表明,虽然皮肤躯干间充质指导口腔上皮制造羽毛,但口腔上皮不具备制造羽毛的能力,只能制造牙齿。在这项研究中,口腔上皮可能已经致力于在 E5 处形成牙齿。 原位 杂交、RNAscope 和免疫染色可用于确认重组外植体中的分子表达,以验证所形成组织的身份。使用这种测定,扰动可以专门针对上皮细胞或间充质。
组织重建将间充质内的细胞重置为非承诺状态。E7-E8羽毛皮肤在背道中已开始形成间充质凝结,然后皮肤被解离,间充质被解离成单细胞。通过在原始芽或芽间区域标记上皮细胞或间充质细胞,可以在芽内部或外部找到真皮细胞,而不考虑它们先前的位置。在间充质细胞密度低的情况下,重建的皮肤外植体形成少数正常大小的羽毛芽。随着间充质细胞密度的增加,芽的数量增加,直到达到最大堆积密度13。这些数据表明,这些细胞通过失去与其初始邻居的接触而被重新编程,并经历了新一轮的模式形成。这些培养物还发展出凝结和羽毛原基。有趣的是,芽在皮肤上同时形成,而不是在皮肤外植体和重组皮肤外植体中看到的芽形成的逐渐繁殖。该方法提供了对早期皮肤细胞和分子相互作用的观察和操作。可以使用启动子-报告基因测定法在培养物中评估分子表达。转基因或基因敲除系之间的重建有助于进一步分析分子在皮肤图案化过程中的作用。病毒转导在解离的间充质细胞中增强,通常会产生增加的扰动。
虽然这些实验方法中的每一种都可以帮助研究人员探索皮肤形态发生过程中发生的细胞和分子事件。我们经常使用这些方法中的每一种,看看哪一种能提供最好的见解。然后可以在其他培养条件下或使用完整的胚胎进一步探索研究结果。
这些方法的局限性
这三种检测中的每一种都提供了高度可重复的结果。然而,由于这些测定可能在不同程度上对相同的扰动做出反应,因此,如果最初没有遇到任何改变,则使用所有三种测定来扰动条件通常是值得的。尽管皮肤外植体培养为早期皮肤模式形成和皮肤附属物发育提供了良好的模型,但外植体只能培养 ~1 周。这排除了它们在后期皮肤附属物发育中的使用,例如,真皮形成和毛囊形态发生的过程,尽管正在改进程序以更长时间地培养这些外植体。迄今为止,在制作重建皮肤外植体后的早期阶段,细胞会松散地附着在其基质上,这使得使用多次洗涤(例如 原位 杂交)的分析变得困难。这些培养物在24小时内更牢固地结合其底物,此时在整个培养物中形成冷凝。
禽类胚胎皮肤为研究皮肤附肢的发育提供了一个极好的模型。皮肤外植体培养物的优点是能够操纵离体皮肤器官培养物生长的培养条件。它还能够对发育进行长期延时成像,以观察芽从中线到侧线边缘随时间的传播。此外,可以使用不同的胚胎阶段开始培养,以探索羽毛图案和生长中的不同事件。对于周期性模式的形成,可以从 E6 开始培养皮肤并培养 4 天。对于羽毛毛囊形态发生,可以在 E8 开始培养并培养 4 天。在 E6 之前的阶段很难解剖皮肤。对于外植体培养,可以通过向皮肤外植体培养基中添加生长因子或抑制剂来进行全局扰动8,16,17。可以通过在皮肤外植体上放置蛋白质包被的珠子或通过病毒转导细胞来调节基因表达来实现局部扰动皮肤 8,16,17。外植体培养有助于对集体细胞行为(如钙活动)进行成像6 和应用生物物理力(如组织张力18 或电流12)。这些方法提供了很好的机会,可以为调节周期性器官模式的因素提供新的见解。
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Disclosures
提交人无需声明任何利益冲突。
Acknowledgments
这项工作得到了 NIH NIAMS 拨款 R37 AR 060306、R01 AR 047364 和 RO1 AR078050的支持。这项工作还得到了南加州大学和台湾中国医药大学之间的合作研究合同的支持。我们感谢 USC BISC 480 发育生物学 2023 课程在几个实验室模块中成功测试了这种禽类皮肤培养协议。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
6-well culture dish | Falcon | REF 353502 | Air-Liquid Interface (ALI) Cultures |
Cell culture inset | Falcon | REF 353090. | 0.4 µm Transparent PET Membrane |
Collagenase Type 1 | Worthington Biochemical | LS004196 | |
Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Corning | 10-013-CV | 4.5 g/L glucose |
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma-Aldrich | E5134 | |
Fetal bovine serum | ThermoFisher | 16140-071 | |
Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
Hanks’s buffered saline solution | Gibco | 14170-112 | No calcium, no magnesium |
Penicillin/streptomycin | Gibco | 15-140-122 | |
Pogassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5379 | |
Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9333 | |
Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S6014 | |
Sodium chloride (Nacl) | EMD | CAS 7647-14-5 | |
Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) | Sigma-Aldrich | S0751 | |
Trypsin | Gibco | 27250-042 |
References
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