Summary
Här beskriver vi protokoll för tre typer av fågelembryonala hudexplantationskulturer som kan användas för att undersöka vävnadsinteraktioner, 4D-avbildning av timelapse-film (3D plus tid), global eller lokal störning av molekylär funktion och systembiologisk karakterisering.
Abstract
Att fågelhuden utvecklas under embryogenesen är en unik modell som kan ge värdefulla insikter om vävnadsmönster. Här beskrivs tre varianter av hudexplantationskulturer för att undersöka olika aspekter av hudens utveckling. För det första ger ex vivo organkulturer och manipulationer forskare möjligheter att observera och studera utvecklingen av fjäderknoppar direkt. Hudexplantationskulturen kan växa i 7 dagar, vilket möjliggör direkt analys av cellulärt beteende och 4D-avbildning med intervaller under denna tillväxtperiod. Detta möjliggör också fysiska och molekylära manipulationer av odlingsförhållanden för att visualisera vävnadssvar. Till exempel kan tillväxtfaktorbelagda pärlor appliceras lokalt för att inducera förändringar i fjädermönster på ett begränsat område. Alternativt kan viral transduktion levereras globalt i odlingsmediet för att upp- eller nedreglera genuttrycket. För det andra gör hudrekombinationsprotokollet det möjligt för forskare att undersöka vävnadsinteraktioner mellan epidermis och mesenkym som härrör från olika hudregioner, olika livsstadier eller olika arter. Detta ger en möjlighet att testa det tidsfönster där epitelet är kompetent att svara på signaler och dess förmåga att bilda olika hudbihang som svar på signaler från olika mesenkymala källor. För det tredje, hudrekonstitution med hjälp av dissocierade dermala celler överlagrade med intakt epitel återställer hudutvecklingen och möjliggör studier av de initiala processerna för periodisk mönsterbildning. Detta tillvägagångssätt förbättrar också vår förmåga att manipulera genuttrycket bland de dissocierade cellerna innan vi skapar den rekonstituerade hudexplanteringen. Detta dokument tillhandahåller de tre odlingsprotokollen och exemplifierande experiment för att visa deras användbarhet.
Introduction
Fågelembryons hudutveckling är en utmärkt modell för att studera mekanismerna för morfogenes på grund av de distinkta mönstren och tillgängligheten till mikrokirurgi och manipulation 1,2. Att utvärdera cellulära och molekylära händelser i intakta vävnader kan dock vara svårt eftersom närvaron av främmande vävnader kan komplicera mikroskopiska observationer. Dessutom är det inte alltid en enkel uppgift att manipulera genuttryck för att testa deras roll i hudens morfogenes. Vi finner att vi kan testa genfunktioner med hjälp av retroviral transduktion med en högre framgångsfrekvens med hjälp av hudexplantationsmodeller. Här diskuterar vi fördelarna med tre hudexplantationsmodeller som har utvecklats.
Fågelembryonal hudodling är ett kraftfullt system för att bedöma cellbeteende, genreglering och funktion under utvecklingen av hudens fjäderknoppar 3,4,5,6. Det gör det möjligt att utvärdera de molekylära mekanismerna för fjäderknoppsutveckling genom global tillsats av tillväxtfaktorer placerade i odlingsmediet eller deras lokala frisättning från tillväxtfaktorbelagda pärlor. Utvecklingsregulatoriska gener kan också manipuleras med hjälp av viral gentransduktion av intakta eller dominanta negativa former för funktionella studier som utvärderar deras roller i specifika morfogenetiska händelser 7,8.
Fågelepitel-mesenkymal rekombinationskultur gör det möjligt för forskare att bestämma bidragen från varje hudkomponent under de tidiga stadierna av hudmorfogenesen. Rawles användning av detta tillvägagångssätt avslöjade att interaktioner mellan mesenkym och epitel är avgörande för att bilda hudbihang9. Mesenkymet kan bilda kondensationer och epitelet behövs för att inducera och upprätthålla mesenkymala kondensationsbildningar2. Senare användes detta tillvägagångssätt för att bedöma varför fjälllösa kycklingar misslyckas med att bilda fjädrar. Defekten upptäcktes vara i mesenkym10. Dhouailly utförde vävnadsepitelial-mesenkymala rekombinationsstudier på embryon från olika arter. Dessa studier gav utvecklingsmässiga och evolutionära insikter i epitel-mesenkymala kommunikationer som främjar hudmorfogenes3.
Denna studie användes för att bättre förstå faktorer som styr fjädertillväxten. Metoden förbättrar också visualiseringen av cellulära och molekylära händelser som är involverade i hudmönster som äger rum under fjäderinitiering, utveckling och förlängning längs den främre-bakre axeln. När epitelet separeras från mesenkymet och de två komponenterna sedan rekombineras, återupprättar nya interaktioner hudmönstret. Detta tillvägagångssätt gör det möjligt för oss att utvärdera mesenkymala inducerande signaler och epitelkompetensmolekyler som gör det möjligt för epidermis att svara på de mesenkymala signalerna11. Det efterföljande nedströms molekylära uttrycket som krävs för fjäderknoppsutveckling och mönsterbildning kan också undersökas. Dessa studier har fastställt att placeringen av knoppar styrs av mesenkymet. Rotation av epitelet 90o före rekombination med mesenkymet visar att riktningen för fjäderknoppens förlängning styrs av epitelet. Denna metod var viktig för att vi skulle kunna studera den molekylära mekanismen som reglerar fjäderknoppens orientering12.
Kultur för rekonstitution av fågelhud, där hudens mesenkym dissocieras till enskilda celler innan det överläggs vid hög celldensitet och överlagras med intakt epitel, återställer dermala celler till ett ursprungligt tillstånd. Explanteringen självorganiserar sig sedan för att bilda ett nytt periodiskt mönster oberoende av de tidigare ledtrådarna13. Denna modell för hudrekonstitution kan användas för att studera de initiala processerna för fjäderperiodisk mönstring. Vi använde detta tillvägagångssätt för att utforska hur modulering av förhållandet mellan mesenkymala celler till ett enda stycke epitel kan påverka storleken eller antalet fjäderknoppar. Antalet knoppar visade sig öka men inte storleken på knopparna eftersom förhållandet mellan mesenkymala celler ökade. En annan fördel med detta tillvägagångssätt är att mesenkymal cellvirustransduktion visar högre effektivitet än i de andra två odlingsförhållandena och kan producera mer uppenbara fenotyper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Explanteringskultur av kycklingskinn (figur 1)
- Ruva befruktade kycklingägg i en fuktad inkubator vid 38 °C och dela dem enligt Hamburger och Hamilton14.
- I steg 28 (~E5.5) är lemmens andra fingrar och tredje tå längre än de andra; Tre fingrar och fyra tår är tydliga.
- Vid stage 29 (~E6) är vingen böjd vid armbågen; Den andra siffran är betydligt längre än de andra.
- Vid steg 30 (~E6.5) är två dorsala fjäderknoppsrader på vardera sidan av ryggmärgen synliga på brachialnivå och tre rader ses i nivå med benen.
- På stadium 31 (~E7) finns det ~7 rader med fjädrar på jumbo-sakrala nivåerna.
- I steg 32 finns elva eller fler rader av fjäderknoppar i nivå med benen.
- Placera ett kycklingembryo från stadium 28-32 i en 60 mm petriskål som innehåller Hanks buffrade koksaltlösning (HBSS) eller fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS).
- Dissekera ut embryots dorsala hud mellan nedre delen av halsen och svansområdet. Använd en sax för att ta bort huvudet från halsen. Dra försiktigt i lemmarnas knoppar för att placera den ventrala sidan av kroppen nedåt med bihangen som sprider sig utåt.
- Gör ett främre till bakre snitt i huden längs de två flankerande sidorna av embryokroppen med hjälp av en klockmakarpincett eller en vass fjädersax. Se till att stabilisera kroppen med en pincett genom att nypa ihop lemknopparna i längdriktningen. Dra försiktigt av huden från halsen till svansområdet eller från svansen till halsen med hjälp av en pincett.
- Ta försiktigt bort de subkutana vävnaderna som sitter kvar på den skalade huden och jämna ut kanterna på huden med den vassa fjädersaxen.
- Tillsätt 2 ml/brunn av Dulbeccos modifierade Eagle's medium (DMEM) kompletterat med 10 % fetalt bovint serum (FBS) och penicillin/streptomycinlösning (utspädd 1:100) till en brunn i en skål med 6 brunnar. När mediet och antibiotika har tillsatts, placera en steril vävnadskulturinsats inuti brunnen, så att mediet är på utsidan av kulturinsatsen.
- Överför huden med en spatel till odlingsinsatsen med epidermis uppåt och mesenkymet nedåt på insatsmembranet. För att säkerställa att huden ligger platt utan några veck, dra huden på spateln i HBSS. Skjut av huden från spateln med vätskan för att underlätta överföringen av huden utan att vika sig.
- Ta bort överflödig HBSS från odlingsinsatsen med en 200 μL pipett. Lämna ett tunt lager HBSS inuti odlingsinsatsen för att hålla explantatorn halvvåt för att ge ett luft-vätskegränssnitt.
- Inkubera hudexplantkulturerna vid 37 °C med 5 %CO 2 och 95 % luft. Byt medium varannan dag.
OBS: Denna procedur har publicerats4. Detta odlingssystem kan också användas med huden på andra fåglar som vaktel eller finkskinnsexplantationskulturer.
2. Epitel-mesenkymal rekombination av kycklinghud och kycklinghud (figur 2)
- Ruva befruktade kycklingägg i en fuktad inkubator vid 38 °C och stadieindelning av embryona enligt Hamburger och Hamilton14 (avsnitt 1.1).
- Förbered 2x kalcium-magnesiumfri (CMF) koksaltlösning med 0,25 % etylendiamintetraättiksyra (EDTA) buffert.
- Gör 10x CMF-buffert (NaCl (1,37 M) 80 g, KCl (0,04 M) 3 g, NaH2PO4 (0,004 M) 0,5 g, KH2PO4 (2 M) 0,25 g, NaHCO3 (0,12 M) 10 g, glukos (0,1 M) 20 g i 1 000 ml destillerat vatten. Justera pH till 7,3. För att göra 100 ml 2x CMF med 0,25 % EDTA-buffert bör EDTA först lösas upp i 80 ml destillerat vatten, sedan tillsätta 20 ml 10x CMF-buffert för att göra 2x CMF med 0,25 % EDTA-arbetslösning.
- Dissekera stadium 30-32 kycklingembryons ryggskinn i HBSS enligt beskrivningen ovan (avsnitt 1.2) och inkubera dem i 2x CMF-koksaltlösning med 0,25 % EDTA på is i 15-20 minuter.
- Separera försiktigt epitelet och mesenkymet med hjälp av en pincett. Överför det separerade epitelet och mesenkymet till en ren skål som innehåller HBSS.
- Rekombinera epitelet med mesenkymet genom att först placera mesenkymet på en petriskål som innehåller HBSS och sedan placera epitelet ovanpå mesenkymet. Placera epitelet längs samma främre-bakre axel som mesenkymet eller vrid epitelet 90o från den främre-bakre axeln av mesenkymet för att avgöra vilken komponent som reglerar olika aspekter av hudmorfogenes.
- Överför de rekombinerade skalen till odlingsinsatser i 6-brunnars odlingsskålar för tillväxt och ta bort överflödig HBSS runt den rekombinerade huden.
- Placera 2 ml DMEM-odlingsmedium med 10 % FBS i brunnen utanför insatsen. Placera ett tunt lager DMEM inuti insatskammaren för att hålla explantatorn halvvåt för att ge ett luft-vätskegränssnitt.
- Inkubera hudrekombinanterna vid 37 °C i en blandning av 5 %CO 2 och 95 % luft. Byt medium varannan dag. Dokumentera fenotypiska förändringar i de initiala hudfaserna av hudutvecklingen med hjälp av time-lapse-fotografering med en kamera monterad på ett dissekerande mikroskop.
OBS: Denna procedur har publicerats11.
3. Rekonstitution av kycklingskinn (Figur 3)
- Ruva befruktade kycklingägg i en fuktad inkubator vid 38 °C och stadieindelning av embryona enligt Hamburger och Hamilton14 (avsnitt 1.1).
- Dissekera stadium 30-33 kycklingembryots dorsala skinn i HBSS. Ruva skinnen i 2x CMF-koksaltlösning med 0,25 % EDTA på is i 15-20 minuter enligt beskrivningen ovan (avsnitt 2.3).
- Separera försiktigt epitelet och mesenkymet med hjälp av en pincett. Överför det separerade epitelet och mesenkymet till HBSS på is.
OBS: Var försiktig så att du inte skadar epitelets basala skikt när du separerar epitelet från mesenkymet. - Samla upp det separerade mesenkymet i ett 15 ml centrifugrör och inkubera med 0,1 % kollagenas/trypsinlösning gjord i PBS i ett 37 °C vattenbad i 10-15 minuter.
- Dissociera hudens mesenkym med en Pasteur-pipett för att göra en encellssuspension. Tillsätt DMEM med 10% FBS för att stoppa matsmältningen.
- Pellet och centrifugera cellerna vid 233 × g i 5 min. Återsuspenderade cellerna med odlingsmedium i en koncentration av 2 × 107 celler/ml.
OBS: I detta steg kan de mesenkymala cellerna också återsuspenderas i virusinnehållande medium i 2-3 timmar på is för gentransduktion. - Placera en cellkulturinsats i en brunn i en skål med 6 brunnar. Droppa 10 μL av 2 × 107 celler/ml mesenkymala celler på vävnadsodlingsinsatsen. Placera 2 ml DMEM-odlingsmedium med 10 % FBS i brunnen utanför insatsen. Inkubera de pläterade mesenkymala cellerna vid 37 °C med hjälp av en 5 %CO 2 och 95 % luftinkubator i 1 timme så att cellerna kan sätta sig på det införda membranet.
- Överför det intakta epitelet ovanpå den pläterade mesenkymala droppen med epitelebasalcelskiktet vänt mot de mesenkymala cellerna med hjälp av en 1 ml pipett.
OBS: Vid överföring av epitel till den mesenkymala droppen bör de mesenkymala cellerna inte störas. - Platta till det intakta epitelet över mesenkymet för att få den rekonstituerade huden att explantera. Lämna ett tunt lager av mediet på insatsen för att hålla den rekonstituerade huden halvvåt för att ge ett luft-vätskegränssnitt. Inkubera den rekonstituerade hudexplantan vid 37 °C i en luftinkubator med 5 %CO 2 och 95 %. Byt medium varannan dag.
OBS: Denna procedur har publicerats13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Explantationskulturer från huden
Fjäderknoppsutveckling från ex vivo hudorgankulturer kan direkt observeras under mikroskopet. Med hjälp av hudexplantationskulturmodellen av kycklingstadium 30 rygghud är plakoderna synliga längs mittlinjen. Den morfogenetiska fronten fortplantar sig sedan gradvis lateralt mot hudens periferi med bildandet av nya fjäderprimordier. Dessa fjäderprimordier kommer att utvecklas till korta fjäderknoppar efter 2 dagar i odling och långa fjäderknoppar efter 4 dagar i odling (Figur 1).
Kulturer för hudrekombination
För hudrekombination, när epitel och mesenkym rekombineras, försvinner de ursprungliga plakoderna. Nya plakoder kommer att dyka upp kort efter rekombination och utvecklas för att bilda korta fjäderknoppar och långa fjäderknoppar efter 2 respektive 4 dagar i odling. Om epitelet roteras 90° i förhållande till mesenkymet kommer orienteringen av de förlängande knopparna att bestämmas av epitelet (figur 2).
Kulturer för hudrekonstitution
Vid rekonstitution av huden verkar ex vivo-organkulturerna först homogena och sedan bildas dermal kondensation med jämnt avstånd samtidigt efter 1 dag i odlingen. Det bör noteras att antalet fjäderknoppar beror på antalet mesenkymala celler. Lägre mesenkymala antal inducerade färre knoppar av liknande storlek för att bilda11. Korta fjäderknoppar bildas efter 2-3 dagar i odling och långa fjäderknoppar kommer att bildas efter 4-5 dagar i odling (Figur 3).
Figur 4 visar sammanfattande diagram över ex vivo hudorgankultur, hudrekombinationsorgankultur och hudrekonstituerande organkultur.
Figur 1: Ex vivo odling av hudorgan. Steg 32 kycklingembryohud dissekeras i HBSS och odlas i 6-brunnars odlingsinsatser (T0, vid tidpunkt 0) i 2 och 4 dagar. Fjäderprimordierna utvecklas till korta fjäderknoppar efter 2 dagar i odling och långa fjäderknoppar efter 4 dagar i odling. Dermal placodes indikeras med den vita pilen. Observera att knopparna i mittlinjen är mer mogna än de på båda sidorna. Denna metod har modifierats från Jiang och Chuong4. Skalstapel = 500 μm. Förkortning: HBSS = Hanks buffrade koksaltlösning. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Ex vivo odling av organ för hudrekombination. Steg 32 kycklingembryohud dissekeras i HBSS, och epitel och mesenkymal separeras i 2x CMF-buffert. Hudepitel och mesenkym rekombineras med eller utan rotation och odlas i 2 dagar och 4 dagar. De nya plakoderna utvecklas till korta och långa fjäderknoppar efter 2 och 4 dagar i odling. Om epitelet roteras 90° i förhållande till mesenkymet, bestäms orienteringen av de nya knopparna av epitelet12. Denna metod har modifierats från Chuong et al.11. Skalstapel = 500 μm. Förkortning: CMF = kalcium-magnesiumfri. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Ex vivo kultur av organ för hudrekonstitution. Steg 32 kycklingembryohud dissekeras och epitel och mesenkym separeras i 2x CMF-buffert. Mesenkymet dissocieras till enskilda celler med 0,1 % kollagenas och trypsin och pelleteras vid hög celldensitet på en odlingsinsats. Dermalcellspelleten rekonstitueras med ett intakt epitel (T0, vid tidpunkt 0) och odlas i 6 timmar, 2 dagar och 5 dagar. Explantorna verkar först homogena (6 timmar) och sedan bildas dermala kondensationer med jämnt avstånd samtidigt efter 1 dag i odling. Korta fjäderknoppar kommer att bildas efter 2-3 dagar i kultur och långa fjäderknoppar bildas efter 4-5 dagar i kultur. Denna metod har modifierats från Jiang et al.13. Skalstapel = 500 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Diagram över ex vivo modeller för odling av hudorgan. Huden börjar vid E6.5 som ett enda lager av epitel som överlägger mesenkymala celler. Detta avbildas överst av de tre explantationsmetoderna. A) Odling av hudorgan ex vivo . Skalet pläteras intakt ovanpå en odlingsinsats vid luft: mediagränssnittet vid 37 °C i en inkubator med 5 %CO 2 och 95 % luft. B) Ex vivo odling av organ för hudrekombination. Hudepitelet separeras från mesenkymet och rekombineras sedan innan det pläteras på cellodlingsinsatsen vid luft-mediegränssnittet vid 37 °C i en inkubator med 5 %CO 2 och 95 % luft. C) Ex vivo odling av organ för hudrekonstituering. Hudepitelet separeras från mesenkymet. Mesenkymet dissocieras sedan till en encellssuspension och de mesenkymala cellerna pelleteras i en centrifug. De mesenkymala cellerna återsuspenderas sedan i en koncentration av 2 × 107 celler/ml och 10 μl av suspensionen placeras på odlingsinsatsen och läggs sedan över med ett intakt stycke epidermis. Grödan inkuberas vid gränsytan luft: media vid 37 °C i en inkubator med 5 %CO 2 och 95 % luft. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Kompletterande figur S1: Transduktion av mesenkymceller med GFP-uttryckande virus. Dissocierade mesenkymala celler (2 × 107 celler/ml) inkuberades under 3 timmar på is med >107 infektiösa enheter/ml replikationskompetent fågelsarkomvirus som uttrycker grönt fluorescerande protein (GFP). De mesenkymala cellerna användes sedan för att bilda rekonstituerade hudorgankulturer enligt beskrivningen i protokoll avsnitt 3 ovan och fotograferades 24 timmar senare. Data visar att ~40% av mesenkymala celler var märkta med GFP. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vävnadsrekombination ger en analys för att utforska de unika bidragen från epitelet och mesenkym. Hos kycklingar börjar fjädrar utvecklas vid embryonal dag 7 (E7) medan fjäll börjar vid E9. När mesenkym på E9-skalan rekombineras med E7-fjäderepitelet bildar den rekombinerade vävnaden fjäll, och när E7-fjädermesenkym rekombineras med E9-skalepitelefjädrar bildas11. Dessa studier har visat att mesenkymet styr mönsterbildningen, avståndet och organidentiteten. Naturligtvis måste epitelet vara kompetent för att kunna ta emot och tolka de mesenkymala signalerna på lämpligt sätt. Kompetens finns bara i epitelet under ett kort tidsintervall. I motsats till ovanstående resultat, överraskande nog när kycklingens munslemhinna och aborala E5-epitel rekombineras med E8-trunkmesenkym, bildar det aborala epitelet fjädrar; Den orala slemhinnan bildar dock flera tandliknande bihang15. Detta visar att medan hudstammens mesenkym styr det aborala epitelet att göra fjädrar, har det orala epitelet inte förmågan att göra fjädrar och kan bara göra tänder. Oralt epitel i denna studie kan redan ha varit engagerat i att bilda tänder vid E5. In situ hybridisering, RNAscope och immunfärgning kan användas för att bekräfta molekylärt uttryck i de rekombinerade explantaten för att verifiera identiteten hos vävnader som bildas. Med hjälp av denna analys kan störningar specifikt riktas mot epitelet eller mesenkymet.
Vävnadsrekonstitution återställer cellerna i mesenkymet till ett icke-engagerat tillstånd. E7-E8 fjäderhud har börjat bilda mesenkymala kondensationer i ryggkanalen innan huden dissocieras och mesenkymet dissocieras till enstaka celler. Genom att märka epitelceller eller mesenkymala celler i de ursprungliga knopp- eller interbudregionerna kan dermala celler hittas inuti eller utanför knopparna utan hänsyn till deras tidigare plats. Vid låg mesenkymal celldensitet bildar de rekonstituerade hudexplantaten få normalstora fjäderknoppar. När den mesenkymala celldensiteten ökar ökar antalet knoppar tills en maximal packningsdensitet uppnås13. Dessa data indikerar att cellerna omprogrammeras genom att de förlorar kontakten med sina ursprungliga grannar och genomgår en ny omgång av mönsterbildning. Dessa kulturer utvecklar också kondensationer och fjäderprimordier. Intressant nog bildas knoppar samtidigt över huden i motsats till den progressiva förökningen av knoppbildning som ses i hudexplantor och rekombinerade hudexplantor. Denna metod gör det möjligt att observera och manipulera cellulära och molekylära interaktioner i huden i ett tidigt skede. Molekylärt uttryck kan bedömas i odling med hjälp av promotor-reporter-analyser. Beredning mellan transgena linjer eller knockout-linjer kan hjälpa till att ytterligare analysera molekylernas roller i hudens mönstringsprocess. Viral transduktion förstärks i de dissocierade mesenkymala cellerna och kan ofta ge en ökad störning.
Även om var och en av dessa experimentella metoder kan hjälpa utredare att utforska cellulära och molekylära händelser som äger rum under hudens morfogenes. Vi använder ofta var och en av dessa metoder och ser vilken som ger de bästa insikterna. Fynden kan sedan undersökas ytterligare under andra odlingsförhållanden eller med hjälp av intakta embryon.
Begränsningar med dessa metoder
Var och en av dessa tre analyser ger mycket reproducerbara resultat. Men eftersom dessa analyser kan reagera på samma störning i olika grad, är det ofta värt besväret att störa förhållandena med hjälp av alla tre analyserna om inga förändringar initialt påträffas. Även om hudexplantationskulturen ger en bra modell för tidig bildning av hudmönster och utveckling av hudbihang, kan explantan endast odlas i ~1 vecka. Detta utesluter deras användning i senare utveckling av hudbihang, till exempel processen för bildning av dermala papiller och follikelmorfogenes, även om metoderna förbättras för att odla dessa explantat längre. Hittills har cellerna i ett tidigt skede efter att ha gjort rekonstituerade hudexplantat suttit löst fästa vid sina substrat, vilket gör det svårt att analysera analyser som använder flera tvättar, till exempel in situ-hybridisering . Dessa kulturer binder sina substrat fastare efter 24 timmar, då kondens har bildats i hela kulturen.
Fågelembryonal hud är en utmärkt modell för att studera utvecklingen av hudbihang. Explantationskulturer har den fördelen att de gör det möjligt att manipulera de odlingsförhållanden under vilka ex vivo-hudorgankulturerna växer. Det möjliggör också långsiktig time-lapse-avbildning av utvecklingen för att se utbredningen av knoppar från mittlinjen till sidokanterna över tid. Dessutom kan odlingen startas med hjälp av olika embryonala stadier för att utforska olika händelser i fjädermönstring och tillväxt. För periodisk mönsterbildning kan huden odlas med början vid E6 och odlas i 4 dagar. För fjäderfollikelmorfogenes kan kulturen startas vid E8 och odlas i 4 dagar. Det är svårt att dissekera huden i stadier före E6. Med explantkulturer kan globala störningar göras genom att tillsätta tillväxtfaktorer eller hämmare till hudexplantationskulturmediet 8,16,17. Att störa huden lokalt kan uppnås genom att placera proteinbelagda pärlor på hudexplantan eller genom att viralt transducera celler för att modulera genuttryck 8,16,17. Explanteringskulturer underlättar avbildningen av det kollektiva cellbeteendet såsom kalciumaktiviteter6 och tillämpningen av biofysiska krafter såsom vävnadsspänning18 eller elektriska strömmar12. Dessa metoder erbjuder stora möjligheter att ge nya insikter om de faktorer som reglerar periodiska organmönster.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att redovisa.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av NIH NIAMS anslag R37 AR 060306, R01 AR 047364 och RO1 AR078050. Arbetet stöds också av ett forskningssamarbete mellan USC och China Medical University i Taiwan. Vi tackar USC BISC 480 Developmental Biology 2023-klassen för att framgångsrikt ha testat detta protokoll för fågelhudkultur under flera labbmoduler.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well culture dish | Falcon | REF 353502 | Air-Liquid Interface (ALI) Cultures |
| Cell culture inset | Falcon | REF 353090. | 0.4 µm Transparent PET Membrane |
| Collagenase Type 1 | Worthington Biochemical | LS004196 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Corning | 10-013-CV | 4.5 g/L glucose |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher | 16140-071 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Hanks’s buffered saline solution | Gibco | 14170-112 | No calcium, no magnesium |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15-140-122 | |
| Pogassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5379 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Sodium chloride (Nacl) | EMD | CAS 7647-14-5 | |
| Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) | Sigma-Aldrich | S0751 | |
| Trypsin | Gibco | 27250-042 |
References
- Lucas, A. M., Stettenheim, P. R. Avian anatomy: Integument part I and part II. Agriculture Handbook. 362, Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture, Washington D.C.. (1972).
- Sengel, P. In Morphogenesis of Skin, l-277. , Cambridge Univ. Press. New York. (1976).
- Dhouailly, D., Wilehm Roux, Formation of cutaneous appendages in dermo-epidermal recombinations between reptiles, birds and mammals. Archives of Developmental Biology. 177 (4), 323-340 (1975).
- Jiang, T. -X., Chuong, C. -M. Mechanism of feather morphogenesis: I. Analyses with antibodies to Adhesion Molecules Tenascin, N-CAM and Integrin. Developmental Biology. 150 (1), 82-98 (1992).
- Li, A., et al. Shaping organs by a Wnt / Notch / non-muscle myosin module which orients feather bud elongation. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 110 (16), E1452-E1461 (2013).
- Li, A., et al. Calcium oscillations coordinate feather mesenchymal cell movement by SHH dependent modulation of gap junction networks. Nature Communications. 9 (1), 5377 (2018).
- Ting-Berreth, S. A., Chuong, C. M. Local delivery of TGF beta2 can restore epithelium dependent organization of mesenchymal condensation during skin appendage morphogenesis. Developmental Biology. 179 (2), 347-359 (1996).
- Widelitz, R. B., Jiang, T. -X., Noveen, A., Chen, C. -W. J., Chuong, C. -M. FGF induces new feather buds from developing avian skin. Journal of Investigation Dermatology. 107 (6), 797-803 (1996).
- Rawles, M. E. Tissue interactions in scale and feather development as studies in dermal-epidermal recombinations. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 11, 765-789 (1963).
- McAleese, S. R., Sawyer, R. H. Correcting the phenotype of the epidermis from chick embryos homozygous for the gene scaleless (sc/sc). Science. 214 (4524), 1033-1034 (1981).
- Chuong, C. M., Widelitz, R. B., Ting-Berreth, S., Jiang, T. X. Early events during avian skin appendage regeneration: dependence on epithelial-mesenchymal interaction and order of molecular reappearance. J Invest Dermatol. 107 (4), 639-646 (1996).
- Jiang, T. X., et al. Global feather orientations changed by electric current. iScience. 24 (6), 102671 (2021).
- Jiang, T. X., Jung, H. S., Widelitz, R. B., Chuong, C. M. Self-organization of periodic patterns by dissociated feather mesenchymal cells and the regulation of size, number and spacing of primordia. Development. 126 (22), 4997-5009 (1999).
- Hamburger, V., Hamilton, H. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 188, 49-92 (1951).
- Chen, Y. P., et al. Conservation of early odontogenic signaling pathway in Aves. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 97 (18), 10044-10049 (2000).
- Chuong, C. -M., Ting, S. A., Widelitz, R. B., Lee, Y. S. Mechanism of Skin Morphogenesis: II. Retinoic acid gradient modulates axis orientation and phenotypes of skin appendages. Development. 115 (3), 839-852 (1992).
- Noveen, A., Jiang, T. -X., Chuong, C. -M. Protein kinase A and protein kinase C modulators have reciprocal effects on mesenchymal condensation during skin appendage morphogenesis. Developmental Biology. 171 (2), 677-693 (1995).
- Wu, X. S., et al. Self-assembly of biological networks via adaptive patterning revealed by avian intradermal muscle network formation. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 116 (22), 10858-10867 (2019).
