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JoVE Journal Developmental Biology
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Developmental Biology

Utilisation d’explants de peau aviaire pour étudier la structuration et l’organogenèse des tissus

Published: September 15, 2023 doi: 10.3791/65580
Automatic Translation
1, 2, 3, 1, 1
1Department of Pathology, Keck School of Medicine of University of Southern California, 2Molecular and Computational Biology, University of Southern California, 3Department of Radiology, Keck School of Medicine of University of Southern California

Summary

Nous décrivons ici des protocoles pour trois types de cultures d’explants de peau embryonnaire aviaire qui peuvent être utilisés pour examiner les interactions tissulaires, le film timelapse d’imagerie 4D (3D plus temps), la perturbation globale ou locale de la fonction moléculaire et la caractérisation de la biologie des systèmes.

Abstract

Le développement de la peau aviaire au cours de l’embryogenèse est un modèle unique qui peut fournir des informations précieuses sur la structure des tissus. Ici, trois variations sur les cultures d’explants de peau pour examiner différents aspects du développement de la peau sont décrites. Tout d’abord, les cultures et les manipulations d’organes ex vivo offrent aux chercheurs la possibilité d’observer et d’étudier directement le développement des bourgeons de plumes. La culture d’explants de peau peut croître pendant 7 jours, ce qui permet une analyse directe du comportement cellulaire et l’imagerie 4D à intervalles réguliers pendant cette période de croissance. Cela permet également des manipulations physiques et moléculaires des conditions de culture pour visualiser la réponse tissulaire. Par exemple, des billes enrobées de facteur de croissance peuvent être appliquées localement pour induire des changements dans le motif des plumes dans une zone limitée. Alternativement, la transduction virale peut être administrée à l’échelle mondiale dans les milieux de culture pour réguler à la hausse ou à la baisse l’expression des gènes. Deuxièmement, le protocole de recombinaison cutanée permet aux chercheurs d’étudier les interactions tissulaires entre l’épiderme et le mésenchyme qui proviennent de différentes régions de la peau, de différents stades de vie ou de différentes espèces. Cela offre l’occasion de tester la fenêtre temporelle dans laquelle l’épithélium est capable de répondre aux signaux et sa capacité à former différents appendices cutanés en réponse à des signaux provenant de différentes sources mésenchymateuses. Troisièmement, la reconstitution de la peau à l’aide de cellules dermiques dissociées recouvertes d’un épithélium intact réinitialise le développement de la peau et permet d’étudier les processus initiaux de structuration périodique. Cette approche améliore également notre capacité à manipuler l’expression des gènes entre les cellules dissociées avant de créer l’explant de peau reconstituée. Cet article présente les trois protocoles de culture et des expériences exemplaires pour démontrer leur utilité.

Introduction

Le développement de la peau de l’embryon aviaire est un excellent modèle pour étudier les mécanismes de la morphogenèse en raison des motifs distincts et de l’accessibilité à la microchirurgie et à la manipulation 1,2. Cependant, l’évaluation des événements cellulaires et moléculaires dans les tissus intacts peut être difficile car la présence de tissus étrangers peut compliquer les observations microscopiques. De plus, la capacité de manipuler l’expression des gènes pour tester leur rôle dans la morphogenèse de la peau n’est pas toujours une tâche simple. Nous constatons que nous pouvons tester les fonctions des gènes en utilisant la transduction rétrovirale avec un taux de réussite plus élevé en utilisant des modèles d’explants de peau. Nous abordons ici les avantages de trois modèles d’explants de peau qui ont été développés.

La culture de peau embryonnaire aviaire est un système puissant pour évaluer le comportement cellulaire, la régulation des gènes et la fonction pendant le développement des bourgeons de plumes de la peau 3,4,5,6. Il permet d’évaluer les mécanismes moléculaires du développement des bourgeons de plumes par l’ajout global de facteurs de croissance placés dans le milieu de culture ou leur libération locale à partir de billes enrobées de facteurs de croissance. Les gènes régulateurs du développement peuvent également être manipulés à l’aide de la transduction de gènes viraux de formes négatives intactes ou dominantes pour des études fonctionnelles évaluant leurs rôles dans des événements morphogénétiques spécifiques 7,8.

La culture de recombinaison épithélio-mésenchymateuse aviaire permet aux chercheurs de déterminer les contributions de chaque composant de la peau au cours des premiers stades de la morphogenèse de la peau. L’utilisation de cette approche par Rawles a révélé que les interactions entre le mésenchyme et l’épithélium sont essentielles à la formation des appendices cutanés9. Le mésenchyme peut former des condensations et l’épithélium est nécessaire pour induire et maintenir les formations de condensation mésenchymateuse2. Plus tard, cette approche a été utilisée pour évaluer pourquoi les poulets sans écailles ne forment pas de plumes. On a découvert que le défaut se trouvait dans le mésenchyme10. Dhouailly a réalisé des études de recombinaison épithélio-mésenchymateuse tissulaire chez des embryons d’espèces différentes. Ces études ont fourni des informations développementales et évolutives sur les communications épithéliales-mésenchymateuses qui favorisent la morphogenèse de la peau3.

Cette étude a été utilisée pour mieux comprendre les facteurs qui contrôlent la croissance des plumes. La méthode améliore également la visualisation des événements cellulaires et moléculaires impliqués dans la structuration de la peau qui se produisent lors de l’initiation, du développement et de l’allongement des plumes le long de l’axe antéro-postérieur. Lorsque l’épithélium est séparé du mésenchyme et que les deux composants sont ensuite recombinés, de nouvelles interactions rétablissent le modelage de la peau. Cette approche nous permet d’évaluer les signaux inducteurs mésenchymateux et les molécules de compétence épithéliale qui permettent à l’épiderme de répondre aux signaux mésenchymateux11. L’expression moléculaire ultérieure en aval qui est nécessaire au développement des bourgeons de plumes et à la formation de motifs peut également être examinée. Ces études ont établi que l’emplacement des bourgeons est contrôlé par le mésenchyme. La rotation de l’épithélium de 90° avant la recombinaison avec le mésenchyme démontre que la direction de l’allongement du bourgeon de plume est contrôlée par l’épithélium. Cette méthode était essentielle pour nous permettre d’étudier le mécanisme moléculaire régulant l’orientation des bourgeons de plumes12.

La culture de reconstitution de la peau aviaire, dans laquelle le mésenchyme cutané est dissocié en cellules uniques avant d’être plaqué à haute densité cellulaire et recouvert d’un épithélium intact, réinitialise les cellules dermiques à un état primordial. L’explant s’auto-organise alors pour former un nouveau motif périodique indépendant des indices précédents13. Ce modèle de reconstitution cutanée peut être utilisé pour étudier les processus initiaux de la structuration périodique des plumes. Nous avons utilisé cette approche pour explorer comment la modulation du rapport entre les cellules mésenchymateuses et un seul morceau d’épithélium peut influencer la taille ou le nombre de bourgeons de plumes. On a constaté que le nombre de bourgeons augmentait, mais pas la taille des bourgeons, car le rapport des cellules mésenchymateuses augmentait. Un autre avantage de cette approche est que la transduction virale des cellules mésenchymateuses montre une efficacité plus élevée que dans les deux autres conditions de culture et peut produire des phénotypes plus évidents.

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Protocol

1. Culture d’explants de peau de poulet (Figure 1)

  1. Incuber les œufs de poule fécondés dans un incubateur humidifié à 38 °C et les étaler selon Hamburger et Hamilton14.
    1. Au stade 28 (~E5.5), le deuxième doigt et le troisième orteil du membre sont plus longs que les autres ; Trois doigts et quatre orteils sont distincts.
    2. Au stade 29 (~E6), l’aile est pliée au niveau du coude ; Le deuxième doigt est nettement plus long que les autres.
    3. Au stade 30 (~E6.5), deux rangées de bourgeons plumaux dorsaux de chaque côté de la moelle épinière sont visibles au niveau brachial et trois rangées sont visibles au niveau des pattes.
    4. Au stade 31 (~E7), il y a ~7 rangées de plumes aux niveaux jumbo-sacrés.
    5. Au stade 32, onze rangées ou plus de bourgeons de plumes sont présentes au niveau des pattes.
  2. Placez un embryon de poulet de stade 28 à 32 dans une boîte de Pétri de 60 mm contenant une solution saline tamponnée de Hanks (HBSS) ou une solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
    1. Disséquez la peau dorsale de l’embryon entre le bas du cou et la région de la queue. Utilisez des ciseaux pour retirer la tête du cou. Tirez doucement sur les bourgeons des membres pour positionner la face ventrale du corps vers le bas, les appendices s’étendant vers l’extérieur.
    2. Faites une incision de l’avant vers l’arrière de la peau le long des deux côtés latéraux du corps de l’embryon à l’aide d’une pince d’horloger ou de ciseaux à ressort tranchants. Assurez-vous de stabiliser le corps avec une paire de pinces en pinçant les bourgeons des membres longitudinalement. Pelez doucement la peau du cou vers la région de la queue ou de la queue vers le cou à l’aide d’une pince d’horloger.
  3. Retirez délicatement les tissus sous-cutanés qui restent attachés à la peau pelée et lissez les bords de la peau avec les ciseaux à ressort tranchants.
  4. Ajouter 2 mL/puits de milieu d’aigle modifié (DMEM) de Dulbecco complété par 10 % de sérum de veau fœtal (FBS) et une solution de pénicilline/streptomycine (diluée 1:100) dans un puits dans une boîte à 6 puits. Une fois que le milieu et les antibiotiques ont été ajoutés, placez un insert de culture tissulaire stérile à l’intérieur du puits, de sorte que le milieu se trouve à l’extérieur de l’insert de culture.
  5. Transférez la peau à l’aide d’une spatule dans l’insert de culture, l’épiderme vers le haut et le mésenchyme vers le bas sur la membrane de l’insert. Pour vous assurer que la peau repose à plat sans aucun pli, tirez la peau sur la spatule en HBSS. Faites glisser la peau de la spatule avec le liquide pour faciliter le transfert de la peau sans plier.
  6. Retirez l’excès de HBSS de l’insert de culture à l’aide d’une pipette de 200 μL. Laissez une fine couche de HBSS à l’intérieur de l’insert de culture pour maintenir l’explant semi-humide afin de fournir une interface air-liquide.
  7. Incuber les cultures d’explants de peau à 37 °C en utilisant 5 % de CO2 et 95 % d’air. Changez de milieu tous les 2 jours.
    REMARQUE : Cette procédure a été publiée4. Ce système de culture peut également être utilisé avec la peau d’autres oiseaux tels que les cultures d’explants de peau de caille ou de pinson.

2. Recombinaison épithéliale-mésenchymateuse de la peau de poulet (Figure 2)

  1. Incuber les œufs de poule fécondés dans un incubateur humidifié à 38 °C et stadifier les embryons selon Hamburger et Hamilton14 (section 1.1).
  2. Préparez 2 solutions salines sans calcium-magnésium (CMF) avec un tampon d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) à 0,25 %.
    1. Préparez 10 tampons CMF (NaCl (1,37 M) 80 g, KCl (0,04 M) 3 g, NaH2PO4 (0,004 M) 0,5 g, KH2PO4 (2 M) 0,25 g, NaHCO3 (0,12 M) 10 g, glucose (0,1 M) 20 g dans 1 000 mL d’eau distillée. Ajustez le pH à 7,3. Pour faire 100 ml de 2x CMF avec 0,25% de tampon EDTA, l’EDTA doit d’abord être dissous dans 80 mL d’eau distillée, puis ajouter 20 mL de 10x tampon CMF pour faire 2x CMF avec 0,25% de solution de travail EDTA.
  3. Disséquez les peaux dorsales d’embryons de poulet de stade 30 à 32 dans HBSS comme décrit ci-dessus (section 1.2) et incubez-les dans 2 doses de solution saline CMF avec 0,25 % d’EDTA sur de la glace pendant 15 à 20 min.
  4. Séparez soigneusement l’épithélium et le mésenchyme à l’aide d’une pince d’horloger. Transférez l’épithélium et le mésenchyme séparés dans une boîte propre contenant du HBSS.
  5. Recombinez l’épithélium avec le mésenchyme en plaçant d’abord le mésenchyme sur une boîte de Pétri contenant HBSS, puis placez l’épithélium sur le mésenchyme. Placez l’épithélium le long du même axe antéro-postérieur que le mésenchyme ou tournez l’épithélium de 90o par rapport à l’axe antéro-postérieur du mésenchyme pour déterminer quel composant régule différents aspects de la morphogenèse de la peau.
  6. Transférez les peaux recombinées dans des inserts de culture dans des boîtes de culture à 6 puits pour la croissance et retirez l’excès de HBSS autour de la peau recombinée.
  7. Placez 2 ml de milieu de culture DMEM avec 10 % de FBS dans le puits à l’extérieur de l’insert. Placez une fine couche de DMEM à l’intérieur de la chambre d’insertion pour maintenir l’explant semi-humide afin de fournir une interface air-liquide.
  8. Incuber les recombinants cutanés à 37 °C dans un mélange de 5% de CO2 et de 95% d’air. Changez de milieu tous les 2 jours. Documentez les changements phénotypiques dans les phases initiales du développement cutané à l’aide de photographies en accéléré avec un appareil photo monté sur un microscope à dissection.
    REMARQUE : Cette procédure a été publiée11.

3. Reconstitution de la peau de poulet (Figure 3)

  1. Incuber les œufs de poule fécondés dans un incubateur humidifié à 38 °C et stadifier les embryons selon Hamburger et Hamilton14 (section 1.1).
  2. Disséquer les peaux dorsales d’embryons de poulet de stade 30-33 dans HBSS. Incuber les peaux dans 2 solutions salines CMF avec 0,25 % d’EDTA sur de la glace pendant 15 à 20 minutes comme décrit ci-dessus (section 2.3).
  3. Séparez soigneusement l’épithélium et le mésenchyme à l’aide d’une pince d’horloger. Transférez l’épithélium et le mésenchyme séparés dans HBSS sur de la glace.
    REMARQUE : Veillez à ne pas endommager la couche basale de l’épithélium lorsque vous séparez l’épithélium du mésenchyme.
  4. Prélever le mésenchyme séparé dans un tube à centrifuger de 15 mL et incuber avec une solution de collagénase/trypsine à 0,1 % de PBS dans un bain-marie à 37 °C pendant 10 à 15 min.
  5. Dissocier le mésenchyme cutané à l’aide d’une pipette Pasteur pour obtenir une suspension unicellulaire. Ajoutez du DMEM avec 10% de FBS pour arrêter la digestion.
  6. Granulez et centrifugez les cellules à 233 × g pendant 5 min. Remise en suspension des cellules avec un milieu de culture à une concentration de 2 × 107 cellules/mL.
    REMARQUE : À cette étape, les cellules mésenchymateuses peuvent également être remises en suspension dans un milieu contenant le virus pendant 2 à 3 h sur de la glace pour la transduction génique.
  7. Placez un insert de culture cellulaire dans un puits d’une boîte à 6 puits. Déposez 10 μL de 2 × 10 cellules mésenchymateuses de7 cellules/mL sur l’insert de culture tissulaire. Placez 2 ml de milieu de culture DMEM avec 10 % de FBS dans le puits à l’extérieur de l’insert. Incuber les cellules mésenchymateuses en plaque à 37 °C à l’aide d’un incubateur à 5 % de CO2 et à 95 % d’air pendant 1 h pour permettre aux cellules de se fixer sur la membrane d’insertion.
  8. Transférez l’épithélium intact sur la gouttelette mésenchymateuse plaquée avec la couche de cellules basales de l’épithélium face aux cellules mésenchymateuses à l’aide d’une pipette de 1 mL.
    REMARQUE : Lors du transfert de l’épithélium dans la gouttelette mésenchymateuse, les cellules mésenchymateuses ne doivent pas être perturbées.
  9. Aplatir l’épithélium intact sur le mésenchyme pour faire explanter la peau reconstituée. Laissez une fine couche du milieu sur l’insert pour maintenir l’explant de peau reconstituée semi-humide afin de fournir une interface air-liquide. Incuber l’explant de peau reconstituée à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO2 et 95 % d’air. Changez de milieu tous les 2 jours.
    REMARQUE : Cette procédure a été publiée13.

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Representative Results

Cultures d’explants de peau
Le développement des bourgeons de plumes à partir de cultures d’organes cutanés ex vivo peut être observé directement au microscope. À l’aide du modèle de culture d’explants de peau de poulet de stade 30, les placodes sont visibles le long de la ligne médiane. Le front morphogénétique se propage ensuite progressivement latéralement vers la périphérie de la peau avec la formation de nouvelles primordiums de plumes. Ces primordia à plumes se transformeront en petits bourgeons de plumes après 2 jours de culture et en longs bourgeons de plumes après 4 jours de culture (figure 1).

Cultures de recombinaison cutanée
Pour la recombinaison cutanée, lorsque l’épithélium et le mésenchyme sont recombinés, les placodes d’origine disparaissent. De nouvelles placodes apparaîtront peu de temps après la recombinaison et se développeront pour former de courts bourgeons de plumes et de longs bourgeons de plumes après 2 et 4 jours de culture, respectivement. Si l’épithélium est tourné de 90° par rapport au mésenchyme, l’orientation des bourgeons allongés sera déterminée par l’épithélium (Figure 2).

Cultures de reconstitution cutanée
Pour la reconstitution cutanée, les cultures d’organes ex vivo apparaissent homogènes dans un premier temps, puis les condensations dermiques avec un espacement régulier se forment simultanément après 1 jour de culture. Il convient de noter que le nombre de bourgeons de plumes dépend du nombre de cellules mésenchymateuses. Un nombre plus faible de mésenchymateux a induit moins de bourgeons de taille similaire pour former11. De courts bourgeons de plumes se formeront après 2-3 jours de culture et de longs bourgeons de plumes se formeront après 4-5 jours de culture (Figure 3).

La figure 4 présente des diagrammes récapitulatifs de la culture ex vivo d’organes de la peau, de la culture d’organes de recombinaison cutanée et de la culture d’organes de reconstitution de la peau.

Figure 1
Figure 1 : Culture ex vivo d’organes cutanés. La peau de l’embryon de poulet de stade 32 est disséquée dans HBSS et cultivée dans des inserts de culture à 6 puits (T0, à l’instant 0) pendant 2 et 4 jours. Les primordia à plumes se transforment en bourgeons à plumes courtes après 2 jours de culture et en bourgeons à plumes longues après 4 jours en culture. Les placodes dermiques sont indiqués par la flèche blanche. Notez que les bourgeons de la ligne médiane sont plus matures que ceux des deux côtés latéraux. Cette méthode a été modifiée à partir de Jiang et Chuong4. Barre d’échelle = 500 μm. Abréviation : HBSS = Hank’s buffered saline solution. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Culture d’organe de recombinaison cutanée ex vivo. La peau de l’embryon de poulet de stade 32 est disséquée dans HBSS, et l’épithélium et le mésenchyme sont séparés dans un tampon CMF 2x. L’épithélium cutané et le mésenchyme sont recombinés avec ou sans rotation et cultivés pendant 2 jours et 4 jours. Les nouveaux placodes se transforment en bourgeons de plumes courtes et longues après 2 et 4 jours de culture. Si l’épithélium est tourné de 90° par rapport au mésenchyme, l’orientation des nouveaux bourgeons est déterminée par l’épithélium12. Cette méthode a été modifiée à partir de Chuong et al.11. Barre d’échelle = 500 μm. Abréviation : CMF = sans calcium-magnésium. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Culture d’organe de reconstitution cutanée ex vivo. La peau de l’embryon de poulet de stade 32 est disséquée, et l’épithélium et le mésenchyme sont séparés dans un tampon 2x CMF. Le mésenchyme est dissocié en cellules uniques par la collagénase à 0,1 % et la trypsine et granulé à haute densité cellulaire sur un insert de culture. La pastille de cellules dermiques est reconstituée avec un épithélium intact (T0, au temps 0) et mise en culture pendant 6 h, 2 jours et 5 jours. Les explants apparaissent d’abord homogènes (6 h) puis des condensations dermiques avec un espacement régulier se forment simultanément après 1 jour de culture. Des bourgeons de plumes courtes se formeront après 2-3 jours de culture et de longs bourgeons de plumes se formeront après 4-5 jours de culture. Cette méthode a été modifiée à partir de Jiang et al.13. Barre d’échelle = 500 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Diagrammes de modèles de culture d’organes cutanés ex vivo. La peau s’initie en E6.5 sous la forme d’une seule couche d’épithélium recouvrant les cellules mésenchymateuses. Ceci est illustré en haut des trois méthodes d’explantation. (A) Culture ex vivo d’organes cutanés. La peau est plaquée intacte sur un insert de culture à l’interface air/milieu à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO2 et 95 % d’air. (B) Culture d’organes de recombinaison cutanée ex vivo. L’épithélium cutané est séparé du mésenchyme puis recombiné avant d’être placé sur l’insert de culture cellulaire à l’interface air/milieu à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO2 et 95 % d’air. (C) Culture d’organes de reconstitution cutanée ex vivo. L’épithélium cutané est séparé du mésenchyme. Le mésenchyme est ensuite dissocié en une suspension unicellulaire et les cellules mésenchymateuses sont granulées dans une centrifugeuse. Les cellules mésenchymateuses sont ensuite remises en suspension à une concentration de 2 × 10,7 cellules/mL et 10 μL de la suspension placées sur l’insert de culture, puis recouvertes d’un morceau d’épiderme intact. La culture est incubée à l’air : interface milieu à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO2 et 95 % d’air. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure supplémentaire S1 : Transduction de cellules de mésenchyme avec le virus exprimant la GFP. Des cellules mésenchymateuses dissociées (2 × 107 cellules/mL) ont été incubées pendant 3 h sur glace avec >10 7unités infectieuses /mL de virus du sarcome aviaire capable de réplication exprimant la protéine fluorescente verte (GFP). Les cellules mésenchymateuses ont ensuite été utilisées pour former des cultures d’organes cutanés reconstitués, comme décrit dans la section 3 du protocole ci-dessus et photographié 24 h plus tard. Les données montrent que ~40% des cellules mésenchymateuses ont été marquées avec la GFP. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

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Discussion

La recombinaison tissulaire permet d’explorer les contributions uniques de l’épithélium et du mésenchyme. Chez les poulets, les plumes commencent à se développer au jour embryonnaire 7 (E7) tandis que les écailles commencent à E9. Lorsque le mésenchyme de l’écaille E9 est recombiné avec l’épithélium de la plume E7, le tissu recombiné forme des écailles, et lorsque le mésenchyme de la plume E7 est recombiné avec l’épithélium de l’écaille E9, les plumes se forment11. Ces études ont démontré que le mésenchyme contrôle la formation des motifs, l’espacement et l’identité des organes. Bien sûr, l’épithélium doit être compétent pour pouvoir recevoir et interpréter correctement les signaux mésenchymateux. La compétence n’existe dans l’épithélium que pendant un court intervalle de temps. Contrairement aux résultats ci-dessus, étonnamment, lorsque la muqueuse buccale de poulet et l’épithélium E5 aboral sont recombinés avec le mésenchyme du tronc E8, l’épithélium aboral forme des plumes ; Cependant, la muqueuse buccale forme plusieurs appendices ressemblant à des dents15. Cela montre que tandis que le mésenchyme du tronc cutané dirige l’épithélium aboral pour fabriquer des plumes, l’épithélium buccal n’a pas la capacité de fabriquer des plumes et ne peut fabriquer que des dents. L’épithélium buccal dans cette étude peut déjà avoir été engagé dans la formation des dents à E5. L’hybridation in situ , l’ARNASCOPE et l’immunocoloration peuvent être utilisés pour confirmer l’expression moléculaire dans les explants recombinés afin de vérifier l’identité des tissus qui se forment. À l’aide de ce test, les perturbations peuvent être spécifiquement dirigées vers l’épithélium ou le mésenchyme.

La reconstitution tissulaire réinitialise les cellules du mésenchyme à un état non engagé. La peau des plumes E7-E8 a commencé à former des condensations mésenchymateuses dans le tractus dorsal avant que la peau ne soit dissociée et que le mésenchyme ne soit dissocié en cellules uniques. En marquant les cellules épithéliales ou mésenchymateuses dans les régions primordiales du bourgeon ou de l’interbourgeon, les cellules dermiques peuvent être trouvées à l’intérieur ou à l’extérieur des bourgeons sans tenir compte de leur emplacement précédent. À faible densité cellulaire mésenchymateuse, les explants de peau reconstituée forment quelques bourgeons de plumes de taille normale. Au fur et à mesure que la densité des cellules mésenchymateuses augmente, le nombre de bourgeons augmente jusqu’à ce qu’une densité maximale de13 soit atteinte. Ces données indiquent que les cellules sont reprogrammées par perte de contact avec leurs voisins initiaux et subissent un nouveau cycle de formation de motifs. Ces cultures développent également des condensations et des primordiums à plumes. Il est intéressant de noter que les bourgeons se forment simultanément sur la peau, contrairement à la propagation progressive de la formation des bourgeons observée dans les explants de peau et les explants de peau recombinés. Cette méthode permet d’observer et de manipuler les interactions cellulaires et moléculaires de la peau à un stade précoce. L’expression moléculaire peut être évaluée en culture à l’aide d’essais promoteur-rapporteur. La reconstitution entre les lignes transgéniques ou knock-out peut aider à analyser davantage les rôles des molécules dans le processus de structuration de la peau. La transduction virale est renforcée dans les cellules mésenchymateuses dissociées et peut souvent produire une perturbation accrue.

Bien que chacune de ces approches expérimentales puisse aider les chercheurs à explorer les événements cellulaires et moléculaires qui se produisent lors de la morphogenèse de la peau. Nous utilisons fréquemment chacune de ces approches et voyons laquelle fournit les meilleures informations. Les résultats peuvent ensuite être approfondis dans d’autres conditions de culture ou en utilisant des embryons intacts.

Limites de ces approches
Chacun de ces trois tests fournit des résultats hautement reproductibles. Cependant, comme ces tests peuvent répondre à la même perturbation à des degrés différents, il est souvent utile de perturber les conditions en utilisant les trois tests si aucune altération n’est initialement rencontrée. Bien que la culture d’explants de peau fournisse un bon modèle pour la formation précoce de motifs cutanés et le développement des appendices cutanés, l’explant ne peut être cultivé que pendant ~1 semaine. Cela empêche leur utilisation dans le développement ultérieur des appendices cutanés, par exemple, le processus de formation de la papille dermique et de la morphogenèse des follicules, bien que les procédures soient améliorées pour cultiver ces explants plus longtemps. À ce jour, dès les premiers moments de la fabrication d’explants de peau reconstituée, les cellules sont faiblement attachées à leurs substrats, ce qui rend difficiles les analyses utilisant plusieurs lavages, comme l’hybridation in situ . Ces cultures lient plus fermement leurs substrats par 24 heures où des condensations se sont formées dans toute la culture.

La peau embryonnaire aviaire fournit un excellent modèle pour étudier le développement des appendices cutanés. Les cultures d’explants de peau ont l’avantage de permettre de manipuler les conditions de culture dans lesquelles les cultures d’organes de la peau ex vivo se développent. Il permet également d’obtenir une imagerie à long terme du développement pour voir la propagation des bourgeons de la ligne médiane vers les bords latéraux au fil du temps. De plus, la culture peut être commencée en utilisant différents stades embryonnaires pour explorer différents événements de la structure et de la croissance des plumes. Pour la formation périodique de motifs, la peau peut être cultivée à partir de E6 et cultivée pendant 4 jours. Pour la morphogenèse du follicule plumaire, la culture peut être commencée à E8 et cultivée pendant 4 jours. Il est difficile de disséquer la peau à des stades antérieurs à E6. Avec les cultures d’explants, des perturbations globales peuvent être apportées en ajoutant des facteurs de croissance ou des inhibiteurs au milieu de culture d’explants de peau 8,16,17. La perturbation locale de la peau peut être obtenue en plaçant des billes enrobées de protéines sur l’explant de peau ou en transduisant viralement des cellules pour moduler l’expression des gènes 8,16,17. Les cultures d’explants facilitent l’imagerie du comportement cellulaire collectif comme les activités calciques6 et l’application de forces biophysiques telles que la tension tissulaire18 ou les courants électriques12. Ces méthodes offrent de grandes opportunités pour fournir de nouvelles perspectives sur les facteurs qui régulent la structuration périodique des organes.

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Disclosures

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Acknowledgments

Ce travail est soutenu par les subventions R37 AR 060306, R01 AR 047364 et RO1 AR078050 du NIAMS. Le travail est également soutenu par un contrat de recherche collaboratif entre l’USC et l’Université médicale de Chine à Taïwan. Nous remercions la classe USC BISC 480 Developmental Biology 2023 d’avoir testé avec succès ce protocole de culture de peau aviaire au cours de plusieurs modules de laboratoire.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6-well culture dish  Falcon REF 353502 Air-Liquid Interface (ALI) Cultures  
Cell culture inset  Falcon REF 353090. 0.4 µm Transparent PET Membrane
Collagenase Type 1 Worthington Biochemical LS004196
Dulbecco’s modified Eagle’s medium  Corning 10-013-CV 4.5 g/L glucose
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) Sigma-Aldrich E5134
Fetal bovine serum ThermoFisher 16140-071
Glucose Sigma-Aldrich G8270
Hanks’s buffered saline solution Gibco 14170-112 No calcium, no magnesium
Penicillin/streptomycin  Gibco 15-140-122
Pogassium phosphate monobasic (KH2PO4) Sigma-Aldrich P5379
Potassium chloride (KCl) Sigma-Aldrich P9333
Sodium bicarbonate (NaHCO3) Sigma-Aldrich S6014
Sodium chloride (Nacl) EMD  CAS 7647-14-5
Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) Sigma-Aldrich S0751
Trypsin Gibco 27250-042

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References

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Mots-clés : Peau aviaire Structuration tissulaire Organogenèse Culture d’explants de peau Développement de bourgeons de plumes Imagerie 4D Comportement cellulaire Manipulation moléculaire Médecine régénérative
Utilisation d’explants de peau aviaire pour étudier la structuration et l’organogenèse des tissus
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Jiang, T., Secor, M., Lansford, R.,… More

Jiang, T., Secor, M., Lansford, R., Widelitz, R. B., Chuong, C. M. Using Avian Skin Explants to Study Tissue Patterning and Organogenesis. J. Vis. Exp. (199), e65580, doi:10.3791/65580 (2023).

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