Summary
Qui descriviamo i protocolli per tre tipi di colture di espianti di pelle embrionale aviaria che possono essere utilizzate per esaminare le interazioni tissutali, il filmato timelapse di imaging 4D (3D più tempo), la perturbazione globale o locale della funzione molecolare e la caratterizzazione della biologia dei sistemi.
Abstract
Lo sviluppo della pelle aviaria durante l'embriogenesi è un modello unico in grado di fornire preziose informazioni sulla modellazione dei tessuti. Qui vengono descritte tre variazioni sulle colture di espianti cutanei per esaminare diversi aspetti dello sviluppo cutaneo. In primo luogo, le colture e le manipolazioni di organi ex vivo offrono ai ricercatori l'opportunità di osservare e studiare direttamente lo sviluppo dei boccioli di piume. La coltura di espianti cutanei può crescere per 7 giorni, consentendo l'analisi diretta del comportamento cellulare e l'imaging 4D a intervalli durante questo periodo di crescita. Ciò consente anche manipolazioni fisiche e molecolari delle condizioni di coltura per visualizzare la risposta dei tessuti. Ad esempio, le perle rivestite con fattore di crescita possono essere applicate localmente per indurre cambiamenti nel disegno delle piume in un'area limitata. In alternativa, la trasduzione virale può essere somministrata a livello globale nei terreni di coltura per aumentare o diminuire l'espressione genica. In secondo luogo, il protocollo di ricombinazione cutanea consente ai ricercatori di studiare le interazioni tissutali tra l'epidermide e il mesenchima che derivano da diverse regioni della pelle, diverse fasi di vita o diverse specie. Ciò offre l'opportunità di testare la finestra temporale in cui l'epitelio è competente a rispondere ai segnali e la sua capacità di formare diverse appendici cutanee in risposta a segnali provenienti da diverse fonti mesenchimali. In terzo luogo, la ricostituzione della pelle utilizzando cellule dermiche dissociate sovrapposte a epitelio intatto ripristina lo sviluppo della pelle e consente lo studio dei processi iniziali di patterning periodico. Questo approccio migliora anche la nostra capacità di manipolare l'espressione genica tra le cellule dissociate prima di creare l'espiante cutaneo ricostituito. Questo documento fornisce i tre protocolli di coltura ed esperimenti esemplari per dimostrarne l'utilità.
Introduction
Lo sviluppo della pelle degli embrioni aviari è un modello eccellente per studiare i meccanismi della morfogenesi a causa dei modelli distinti e dell'accessibilità alla microchirurgia e alla manipolazione 1,2. Tuttavia, la valutazione degli eventi cellulari e molecolari nei tessuti intatti può essere difficile perché la presenza di tessuti estranei può complicare le osservazioni microscopiche. Inoltre, la capacità di manipolare l'espressione genica per testare il loro ruolo nella morfogenesi cutanea non è sempre un compito semplice. Scopriamo che possiamo testare le funzioni geniche utilizzando la trasduzione retrovirale con un tasso di successo più elevato utilizzando modelli di espianti cutanei. Qui discutiamo i vantaggi di tre modelli di espianti di pelle che sono stati sviluppati.
La coltura embrionale aviaria della pelle è un potente sistema per valutare il comportamento cellulare, la regolazione genica e la funzione durante lo sviluppo delle gemme delle piume della pelle 3,4,5,6. Consente di valutare i meccanismi molecolari dello sviluppo delle gemme di piume attraverso l'aggiunta globale di fattori di crescita posti nei terreni di coltura o il loro rilascio locale da perle rivestite di fattore di crescita. I geni regolatori dello sviluppo possono anche essere manipolati utilizzando la trasduzione genica virale di forme negative intatte o dominanti per studi funzionali che valutano il loro ruolo in specifici eventi morfogenetici 7,8.
La coltura di ricombinazione epiteliale-mesenchimale aviaria consente ai ricercatori di determinare i contributi di ciascun componente cutaneo durante le prime fasi della morfogenesi cutanea. L'uso di questo approccio da parte di Rawles ha rivelato che le interazioni tra il mesenchima e l'epitelio sono essenziali per la formazione delle appendici cutanee9. Il mesenchima può formare condensazioni e l'epitelio è necessario per indurre e mantenere le formazioni di condensazione mesenchimale2. Successivamente, questo approccio è stato utilizzato per valutare il motivo per cui i polli senza squame non riescono a formare piume. Si è scoperto che il difetto era nel mesenchima10. Dhouailly ha eseguito studi di ricombinazione epiteliale-mesenchimale tissutale in embrioni di specie diverse. Questi studi hanno fornito informazioni sullo sviluppo e sull'evoluzione delle comunicazioni epitelio-mesenchimali che promuovono la morfogenesi cutanea3.
Questo studio è stato utilizzato per comprendere meglio i fattori che controllano la crescita delle piume. Il metodo migliora anche la visualizzazione degli eventi cellulari e molecolari coinvolti nel patterning cutaneo che si verificano durante l'inizio, lo sviluppo e l'allungamento delle piume lungo l'asse antero-posteriore. Quando l'epitelio viene separato dal mesenchima e i due componenti vengono quindi ricombinati, nuove interazioni ristabiliscono il pattern cutaneo. Questo approccio ci permette di valutare i segnali induttori mesenchimali e le molecole di competenza epiteliale che consentono all'epidermide di rispondere ai segnali mesenchimali11. Può essere esaminata anche la successiva espressione molecolare a valle, necessaria per lo sviluppo delle gemme di piume e la formazione del modello. Questi studi hanno stabilito che la posizione delle gemme è controllata dal mesenchima. La rotazione dell'epitelio di 90o prima della ricombinazione con il mesenchima dimostra che la direzione dell'allungamento della gemma della piuma è controllata dall'epitelio. Questo metodo è stato essenziale per noi per studiare il meccanismo molecolare che regola l'orientamento delle gemme delle piume12.
La coltura di ricostituzione della pelle aviaria, in cui il mesenchima cutaneo viene dissociato da singole cellule prima di essere placcato ad alta densità cellulare e ricoperto da epitelio intatto, ripristina le cellule dermiche a uno stato primordiale. L'espianto quindi si auto-organizza per formare un nuovo modello periodico indipendente dai segnali precedenti13. Questo modello di ricostituzione della pelle può essere utilizzato per studiare i processi iniziali del pattern periodico delle piume. Abbiamo utilizzato questo approccio per esplorare come la modulazione del rapporto tra cellule mesenchimali e un singolo pezzo di epitelio possa influenzare la dimensione o il numero di gemme di piume. È stato riscontrato che il numero di gemme aumenta, ma non le dimensioni delle gemme all'aumentare del rapporto tra le cellule mesenchimali. Un altro vantaggio di questo approccio è che la trasduzione virale delle cellule mesenchimali mostra un'efficienza maggiore rispetto alle altre due condizioni di coltura e può produrre fenotipi più evidenti.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Coltura di espiantazione di pelle di pollo (Figura 1)
- Incubare le uova di gallina fecondate in un'incubatrice umidificata a 38 °C e metterle in scena secondo Hamburger e Hamilton14.
- Allo stadio 28 (~E5.5), il secondo dito e il terzo dito dell'arto sono più lunghi degli altri; Tre dita e quattro dita dei piedi sono distinte.
- Al punto 29 (~E6), l'ala è piegata all'altezza del gomito; La seconda cifra è nettamente più lunga delle altre.
- Allo stadio 30 (~E6.5), due file di gemme di piume dorsali su entrambi i lati del midollo spinale sono visibili a livello brachiale e tre file sono visibili a livello delle zampe.
- Allo stadio 31 (~E7), ci sono ~7 file di piume ai livelli jumbo-sacrali.
- Allo stadio 32, sono presenti undici o più file di gemme di piume a livello delle zampe.
- Mettere un embrione di pollo allo stadio 28-32 in una piastra di Petri da 60 mm contenente la soluzione salina tamponata di Hanks (HBSS) o la soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
- Sezionare la pelle dorsale dell'embrione tra la parte inferiore del collo e la regione della coda. Usa le forbici per rimuovere la testa dal collo. Tirare delicatamente le gemme degli arti per posizionare il lato ventrale del corpo verso il basso con le appendici che si allargano verso l'esterno.
- Praticare un'incisione anteriore o posteriore nella pelle lungo i due lati laterali del corpo dell'embrione utilizzando una pinza da orologiaio o forbici a molla affilate. Assicurati di stabilizzare il corpo con un paio di pinze pizzicando longitudinalmente le gemme degli arti. Sbucciare delicatamente la pelle dal collo alla regione della coda o dalla coda al collo usando una pinza da orologiaio.
- Rimuovere delicatamente i tessuti sottocutanei che rimangono attaccati alla pelle sbucciata e levigare i bordi della pelle con le forbici a molla affilate.
- Aggiungere 2 mL/pozzetto di terreno di Eagle's modificato (DMEM) di Dulbecco integrato con il 10% di siero fetale bovino (FBS) e soluzione di penicillina/streptomicina (diluita 1:100) in un pozzetto in un piatto a 6 pozzetti. Una volta aggiunti il terreno e gli antibiotici, posizionare un inserto di coltura tissutale sterile all'interno del pozzetto, in modo che il terreno si trovi all'esterno dell'inserto di coltura.
- Trasferire la pelle con una spatola sull'inserto di coltura con l'epidermide rivolta verso l'alto e il mesenchima rivolto verso il basso sulla membrana dell'inserto. Per garantire che la pelle sia piatta senza pieghe, tirare la pelle sulla spatola in HBSS. Far scivolare la pelle dalla spatola con il liquido per facilitare il trasferimento della pelle senza piegarla.
- Rimuovere l'eccesso di HBSS dall'inserto di coltura con una pipetta da 200 μl. Lasciare uno strato sottile di HBSS all'interno dell'inserto di coltura per mantenere l'espiante semi-umido e fornire un'interfaccia aria-liquido.
- Incubare le colture di espianti cutanei a 37 °C utilizzando il 5% di CO2 e il 95% di aria. Cambia il mezzo ogni 2 giorni.
NOTA: Questa procedura è stata pubblicata4. Questo sistema di coltura può essere utilizzato anche con la pelle di altri uccelli come le colture di espianti di quaglie o fringuelli.
2. Ricombinazione epiteliale-mesenchimale della pelle di pollo (Figura 2)
- Incubare le uova di gallina fecondate in un'incubatrice umidificata a 38 °C e mettere in scena gli embrioni secondo Hamburger e Hamilton14 (sezione 1.1).
- Preparare 2 soluzioni saline prive di calcio e magnesio (CMF) con tampone di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) allo 0,25%.
- Preparare 10 tamponi CMF (NaCl (1,37 M) 80 g, KCl (0,04 M) 3 g, NaH2PO4 (0,004 M) 0,5 g, KH2PO4 (2 M) 0,25 g, NaHCO3 (0,12 M) 10 g, glucosio (0,1 M) 20 g in 1.000 mL di acqua distillata. Regolare il pH a 7,3. Per ottenere 100 mL di 2x CMF con tampone EDTA allo 0,25%, l'EDTA deve essere prima sciolto in 80 mL di acqua distillata, quindi aggiungere 20 mL di tampone CMF 10x per ottenere 2x CMF con soluzione di lavoro EDTA allo 0,25%.
- Sezionare le pelli dorsali di embrioni di pollo allo stadio 30-32 in HBSS come descritto sopra (sezione 1.2) e incubarle in soluzione salina 2x CMF con EDTA allo 0,25% su ghiaccio per 15-20 minuti.
- Separare accuratamente l'epitelio e il mesenchima utilizzando una pinza da orologiaio. Trasferire l'epitelio e il mesenchima separati in un piatto pulito contenente HBSS.
- Ricombinare l'epitelio con il mesenchima posizionando prima il mesenchima su una piastra di Petri contenente HBSS, quindi posizionare l'epitelio sopra il mesenchima. Posizionare l'epitelio lungo lo stesso asse antero-posteriore del mesenchima o ruotare l'epitelio di 90o rispetto all'asse antero-posteriore del mesenchima per determinare quale componente regola i diversi aspetti della morfogenesi cutanea.
- Trasferire le pelli ricombinate negli inserti di coltura in piastre di coltura a 6 pozzetti per la crescita e rimuovere l'eccesso di HBSS attorno alla pelle ricombinata.
- Inserire 2 mL di terreno di coltura DMEM con il 10% di FBS nel pozzetto all'esterno dell'inserto. Posizionare un sottile strato di DMEM all'interno della camera di inserimento per mantenere l'espiante semi-umido e fornire un'interfaccia aria-liquido.
- Incubare i ricombinanti cutanei a 37 °C in una miscela di 5% CO2 e 95% di aria. Cambia il mezzo ogni 2 giorni. Documenta i cambiamenti fenotipici nelle fasi iniziali dello sviluppo cutaneo utilizzando la fotografia time-lapse con una fotocamera montata su un microscopio da dissezione.
NOTA: Questa procedura è stata pubblicata11.
3. Ricostituzione della pelle di pollo (Figura 3)
- Incubare le uova di gallina fecondate in un'incubatrice umidificata a 38 °C e mettere in scena gli embrioni secondo Hamburger e Hamilton14 (sezione 1.1).
- Sezionare le pelli dorsali dell'embrione di pollo allo stadio 30-33 in HBSS. Incubare le pelli in 2x soluzione salina CMF con EDTA allo 0,25% su ghiaccio per 15-20 minuti come descritto sopra (paragrafo 2.3).
- Separare accuratamente l'epitelio e il mesenchima utilizzando una pinza da orologiaio. Trasferire l'epitelio e il mesenchima separati in HBSS su ghiaccio.
NOTA: Fare attenzione a non danneggiare lo strato basale dell'epitelio quando si separa l'epitelio dal mesenchima. - Raccogliere il mesenchima separato in una provetta da centrifuga da 15 mL e incubare con una soluzione di collagenasi/tripsina allo 0,1% prodotta in PBS in un bagno d'acqua a 37 °C per 10-15 minuti.
- Dissociare il mesenchima cutaneo con una pipetta Pasteur per ottenere una sospensione unicellulare. Aggiungi DMEM con il 10% di FBS per fermare la digestione.
- Pellettare e centrifugare le celle a 233 × g per 5 min. Risospendere le cellule con il terreno di coltura a una concentrazione di 2 × 107 cellule/mL.
NOTA: A questo punto, le cellule mesenchimali possono anche essere risospese in un terreno contenente virus per 2-3 ore su ghiaccio per la trasduzione genica. - Posizionare un inserto per colture cellulari in un pozzetto di un piatto a 6 pozzetti. Far cadere 10 μL di 2 × 107 cellule/mL di cellule mesenchimali sull'inserto di coltura tissutale. Posizionare 2 ml di terreno di coltura DMEM con il 10% di FBS nel pozzetto all'esterno dell'inserto. Incubare le cellule mesenchimali piastrate a 37 °C utilizzando un incubatore al 5% di CO2 e al 95% di aria per 1 ora per consentire alle cellule di depositarsi sulla membrana dell'inserto.
- Trasferire l'epitelio intatto sopra la gocciolina mesenchimale placcata con lo strato di cellule basali dell'epitelio rivolto verso le cellule mesenchimali utilizzando una pipetta da 1 mL.
NOTA: Quando si trasferisce l'epitelio alla gocciolina mesenchimale, le cellule mesenchimali non devono essere disturbate. - Appiattire l'epitelio intatto sopra il mesenchima per espiantare la pelle ricostituita. Lasciare uno strato sottile di terreno sull'inserto per mantenere l'espiante di pelle ricostituita semi-umido per fornire un'interfaccia aria-liquido. Incubare l'espianto cutaneo ricostituito a 37 °C in un incubatore al 5% di CO2 e al 95% di aria. Cambia il mezzo ogni 2 giorni.
NOTA: Questa procedura è stata pubblicata13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Colture di espianti cutanei
Lo sviluppo delle gemme delle piume da colture di organi cutanei ex vivo può essere osservato direttamente al microscopio. Utilizzando il modello di coltura di espiantazione della pelle dorsale di pollo allo stadio 30, i placodi sono visibili lungo la linea mediana. Il fronte morfogenetico si propaga poi gradualmente lateralmente verso la periferia cutanea con la formazione di nuovi primordi della piuma. Questi primordii di piume si svilupperanno in boccioli di piume corte dopo 2 giorni di coltura e in gemme di piume lunghe dopo 4 giorni di coltura (Figura 1).
Colture di ricombinazione cutanea
Per la ricombinazione della pelle, quando gli epiteli e il mesenchima vengono ricombinati, i placodi originali scompaiono. I nuovi placodi appariranno poco dopo la ricombinazione e si svilupperanno per formare boccioli di piume corte e gemme di piume lunghe dopo 2 e 4 giorni di coltura, rispettivamente. Se l'epitelio è ruotato di 90° rispetto al mesenchima, l'orientamento delle gemme allungate sarà determinato dall'epitelio (Figura 2).
Colture di ricostituzione cutanea
Per la ricostituzione della pelle, le colture di organi ex vivo appaiono inizialmente omogenee, e poi si formano simultaneamente condensazioni dermiche con spaziatura uniforme dopo 1 giorno di coltura. Va notato che il numero di gemme di piume dipende dal numero di cellule mesenchimali. Numeri mesenchimali più bassi hanno indotto un minor numero di gemme di dimensioni simili a formare11. I boccioli di piume corte si formeranno dopo 2-3 giorni di coltura e i boccioli di piume lunghe si formeranno dopo 4-5 giorni di coltura (Figura 3).
La Figura 4 mostra i diagrammi riassuntivi della coltura di organi cutanei ex vivo , della coltura di organi di ricombinazione cutanea e della coltura di organi di ricostituzione cutanea.
Figura 1: Coltura di organi cutanei ex vivo. La pelle dell'embrione di pollo allo stadio 32 viene sezionata in HBSS e coltivata in inserti di coltura a 6 pozzetti (T0, al tempo 0) per 2 e 4 giorni. I primordia delle piume si sviluppano in boccioli di piume corte dopo 2 giorni di coltura e in boccioli di piume lunghe dopo 4 giorni di coltura. I placodi dermici sono indicati dalla freccia bianca. Si noti che i boccioli nella linea mediana sono più maturi di quelli su entrambi i lati laterali. Questo metodo è stato modificato da Jiang e Chuong4. Barra della scala = 500 μm. Abbreviazione: HBSS = Soluzione salina tamponata di Hank. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Coltura di organi di ricombinazione cutanea ex vivo. La pelle dell'embrione di pollo allo stadio 32 viene sezionata in HBSS e l'epitelio e il mesenchimale vengono separati in 2x tampone CMF. L'epitelio cutaneo e il mesenchima vengono ricombinati con o senza rotazione e coltivati per 2 giorni e 4 giorni. I nuovi placodi si sviluppano in gemme di piume corte e lunghe dopo 2 e 4 giorni di coltura. Se l'epitelio viene ruotato di 90° rispetto al mesenchima, l'orientamento delle nuove gemme è determinato dall'epitelio12. Questo metodo è stato modificato da Chuong et al.11. Barra della scala = 500 μm. Abbreviazione: CMF = calcio-magnesio-free. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Coltura di organi di ricostituzione cutanea ex vivo. La pelle dell'embrione di pollo allo stadio 32 viene sezionata e l'epitelio e il mesenchima vengono separati in 2x tampone CMF. Il mesenchima è dissociato in singole cellule dallo 0,1% di collagenasi e tripsina e pellettato ad alta densità cellulare su un inserto di coltura. Il pellet di cellule dermiche viene ricostituito con un epitelio intatto (T0, al tempo 0) e coltivato per 6 ore, 2 giorni e 5 giorni. Gli espianti appaiono inizialmente omogenei (6 ore) e poi si formano contemporaneamente condensazioni dermiche con spaziatura uniforme dopo 1 giorno in coltura. I boccioli a piuma corta si formeranno dopo 2-3 giorni in coltura e i boccioli a piuma lunga si formeranno dopo 4-5 giorni in coltura. Questo metodo è stato modificato da Jiang et al.13. Barra della scala = 500 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Diagrammi di modelli di coltura di organi cutanei ex vivo . La pelle inizia a E6.5 come un singolo strato di epitelio che si sovrappone alle cellule mesenchimali. Questo è raffigurato nella parte superiore dei tre metodi di espianto. (A) Coltura di organi cutanei ex vivo. La pelle viene placcata intatta sopra un inserto di coltura all'interfaccia aria: terreno a 37 °C in un incubatore al 5% di CO2 e al 95% di aria. (B) Coltura di organi di ricombinazione cutanea ex vivo. L'epitelio cutaneo viene separato dal mesenchima e quindi ricombinato prima di essere placcato sull'inserto di coltura cellulare all'interfaccia aria: terreno a 37 °C in un incubatore al 5% di CO2 e al 95% di aria. (C) Coltura di organi di ricostituzione cutanea ex vivo. L'epitelio cutaneo è separato dal mesenchima. Il mesenchima viene quindi dissociato in una sospensione unicellulare e le cellule mesenchimali vengono pellettate in una centrifuga. Le cellule mesenchimali vengono quindi risospese a una concentrazione di 2 × 10,7 cellule/mL e 10 μL della sospensione, posizionate sull'inserto di coltura e quindi sovrapposte con un pezzo di epidermide intatto. La coltura viene incubata all'interfaccia aria: terreno a 37 °C in un incubatore al 5% di CO2 e al 95% di aria. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura S1 supplementare: Trasduzione di cellule mesenchimali con virus che esprime GFP. Le cellule mesenchimali dissociate (2 × 107 cellule/mL) sono state incubate per 3 ore su ghiaccio con >107 unità infettive/mL di virus del sarcoma aviario competente per la replicazione che esprime la proteina fluorescente verde (GFP). Le cellule mesenchimali sono state quindi utilizzate per formare colture di organi cutanei ricostituiti come descritto nella sezione 3 del protocollo di cui sopra e fotografate 24 ore dopo. I dati mostrano che ~40% delle cellule mesenchimali sono state marcate con GFP. Clicca qui per scaricare questo file.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
La ricombinazione tissutale fornisce un saggio per esplorare i contributi unici dell'epitelio e del mesenchima. Nei polli, le piume iniziano a svilupparsi al giorno embrionale 7 (E7) mentre le squame iniziano a E9. Quando il mesenchima della squama E9 viene ricombinato con l'epitelio della piuma E7, il tessuto ricombinato forma squame e quando il mesenchima della piuma E7 viene ricombinato con l'epitelio della squama E9 si formano11 penne. Questi studi hanno dimostrato che il mesenchima controlla la formazione del modello, la spaziatura e l'identità dell'organo. Naturalmente, l'epitelio deve essere competente per essere in grado di ricevere e interpretare i segnali mesenchimali in modo appropriato. La competenza esiste nell'epitelio solo per un breve intervallo di tempo. In contrasto con i risultati di cui sopra, sorprendentemente quando la mucosa orale del pollo e l'epitelio aborale E5 vengono ricombinati con il mesenchima del tronco E8, l'epitelio aborale forma piume; Tuttavia, la mucosa orale forma più appendici simili a denti15. Ciò dimostra che mentre il mesenchima del tronco cutaneo dirige l'epitelio aborale per fare le piume, l'epitelio orale non ha la capacità di fare le piume e può fare solo i denti. L'epitelio orale in questo studio potrebbe essere già stato impegnato a formare denti a E5. L'ibridazione in situ , l'RNAscope e l'immunocolorazione possono essere utilizzati per confermare l'espressione molecolare negli espianti ricombinati per verificare l'identità dei tessuti che si formano. Utilizzando questo test, le perturbazioni possono essere indirizzate specificamente all'epitelio o al mesenchima.
La ricostituzione dei tessuti ripristina le cellule all'interno del mesenchima a uno stato non impegnato. La pelle della piuma E7-E8 ha iniziato a formare condensazioni mesenchimali nel tratto dorsale prima che la pelle si dissocia e il mesenchima si dissocia in singole cellule. Marcando le cellule epiteliali o mesenchimali nelle regioni primordiali o intergemme, le cellule dermiche possono essere trovate all'interno o all'esterno delle gemme indipendentemente dalla loro posizione precedente. A bassa densità di cellule mesenchimali, gli espianti di pelle ricostituita formano pochi germogli di piume di dimensioni normali. All'aumentare della densità delle cellule mesenchimali, il numero di gemme aumenta fino a raggiungere una densità massima diimpacchettamento di 13. Questi dati indicano che le cellule vengono riprogrammate attraverso la perdita di contatto con i loro vicini iniziali e subiscono un nuovo ciclo di formazione del modello. Queste colture sviluppano anche condensazioni e primordi delle piume. È interessante notare che le gemme si formano simultaneamente sulla pelle rispetto alla propagazione progressiva della formazione di gemme osservata negli espianti di pelle e negli espianti di pelle ricombinati. Questo metodo consente l'osservazione e la manipolazione delle interazioni cellulari e molecolari della pelle in fase iniziale. L'espressione molecolare può essere valutata in coltura utilizzando saggi promotore-reporter. La ricostituzione tra linee transgeniche o knockout può aiutare ad analizzare ulteriormente i ruoli delle molecole nel processo di modellamento della pelle. La trasduzione virale è potenziata nelle cellule mesenchimali dissociate e spesso può produrre un aumento della perturbazione.
Mentre ciascuno di questi approcci sperimentali può aiutare i ricercatori a esplorare gli eventi cellulari e molecolari che si verificano durante la morfogenesi della pelle. Utilizziamo spesso ciascuno di questi approcci e vediamo quale fornisce le migliori intuizioni. I risultati possono quindi essere ulteriormente esplorati in altre condizioni di coltura o utilizzando embrioni intatti.
Limiti di questi approcci
Ciascuno di questi tre test fornisce risultati altamente riproducibili. Tuttavia, poiché questi saggi possono rispondere alla stessa perturbazione in misura diversa, spesso vale la pena perturbare le condizioni utilizzando tutti e tre i saggi se inizialmente non si riscontrano alterazioni. Sebbene la coltura dell'espianto cutaneo fornisca un buon modello per la formazione precoce del modello cutaneo e lo sviluppo dell'appendice cutanea, l'espiante può essere coltivato solo per ~ 1 settimana. Ciò preclude il loro uso nello sviluppo successivo dell'appendice cutanea, ad esempio il processo di formazione della papilla dermica e la morfogenesi del follicolo, sebbene le procedure siano state migliorate per coltivare questi espianti più a lungo. Ad oggi, nei primi momenti dopo aver effettuato espianti di pelle ricostituita, le cellule sono attaccate liberamente ai loro substrati, rendendo difficili le analisi che utilizzano diversi lavaggi, come l'ibridazione in situ . Queste colture legano i loro substrati più saldamente entro 24 ore in cui si sono formate condensazioni in tutta la coltura.
La pelle embrionale aviaria fornisce un modello eccellente per studiare lo sviluppo delle appendici cutanee. Le colture di espianti cutanei hanno il vantaggio di consentire la manipolazione delle condizioni di coltura in cui crescono le colture di organi cutanei ex vivo. Consente inoltre l'imaging time-lapse a lungo termine dello sviluppo per vedere la propagazione delle gemme dalla linea mediana ai bordi laterali nel tempo. Inoltre, la coltura può essere avviata utilizzando diversi stadi embrionali per esplorare diversi eventi nel modello e nella crescita delle piume. Per la formazione periodica del modello, la pelle può essere coltivata a partire da E6 e coltivata per 4 giorni. Per la morfogenesi del follicolo piumato, la coltura può essere avviata a E8 e coltivata per 4 giorni. È difficile sezionare la pelle nelle fasi precedenti all'E6. Con le colture di espianto, le perturbazioni globali possono essere effettuate aggiungendo fattori di crescita o inibitori al terreno di coltura di espianti cutanei 8,16,17. La perturbazione locale della pelle può essere ottenuta posizionando perle rivestite di proteine sull'espiantante cutaneo o trasducendo viralmente le cellule per modulare l'espressione genica 8,16,17. Le colture di espianti facilitano l'imaging del comportamento cellulare collettivo come le attività del calcio6 e l'applicazione di forze biofisiche come la tensione tissutale18 o le correnti elettriche12. Questi metodi offrono grandi opportunità per fornire nuove intuizioni sui fattori che regolano il pattern periodico degli organi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.
Acknowledgments
Questo lavoro è supportato dalla sovvenzione NIH NIAMS R37 AR 060306, R01 AR 047364 e RO1 AR078050. Il lavoro è anche supportato da un contratto di ricerca collaborativa tra l'USC e la China Medical University di Taiwan. Ringraziamo la classe USC BISC 480 Developmental Biology 2023 per aver testato con successo questo protocollo di coltura della pelle aviaria durante diversi moduli di laboratorio.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well culture dish | Falcon | REF 353502 | Air-Liquid Interface (ALI) Cultures |
| Cell culture inset | Falcon | REF 353090. | 0.4 µm Transparent PET Membrane |
| Collagenase Type 1 | Worthington Biochemical | LS004196 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Corning | 10-013-CV | 4.5 g/L glucose |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher | 16140-071 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Hanks’s buffered saline solution | Gibco | 14170-112 | No calcium, no magnesium |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15-140-122 | |
| Pogassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5379 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Sodium chloride (Nacl) | EMD | CAS 7647-14-5 | |
| Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) | Sigma-Aldrich | S0751 | |
| Trypsin | Gibco | 27250-042 |
References
- Lucas, A. M., Stettenheim, P. R. Avian anatomy: Integument part I and part II. Agriculture Handbook. 362, Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture, Washington D.C.. (1972).
- Sengel, P. In Morphogenesis of Skin, l-277. , Cambridge Univ. Press. New York. (1976).
- Dhouailly, D., Wilehm Roux, Formation of cutaneous appendages in dermo-epidermal recombinations between reptiles, birds and mammals. Archives of Developmental Biology. 177 (4), 323-340 (1975).
- Jiang, T. -X., Chuong, C. -M. Mechanism of feather morphogenesis: I. Analyses with antibodies to Adhesion Molecules Tenascin, N-CAM and Integrin. Developmental Biology. 150 (1), 82-98 (1992).
- Li, A., et al. Shaping organs by a Wnt / Notch / non-muscle myosin module which orients feather bud elongation. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 110 (16), E1452-E1461 (2013).
- Li, A., et al. Calcium oscillations coordinate feather mesenchymal cell movement by SHH dependent modulation of gap junction networks. Nature Communications. 9 (1), 5377 (2018).
- Ting-Berreth, S. A., Chuong, C. M. Local delivery of TGF beta2 can restore epithelium dependent organization of mesenchymal condensation during skin appendage morphogenesis. Developmental Biology. 179 (2), 347-359 (1996).
- Widelitz, R. B., Jiang, T. -X., Noveen, A., Chen, C. -W. J., Chuong, C. -M. FGF induces new feather buds from developing avian skin. Journal of Investigation Dermatology. 107 (6), 797-803 (1996).
- Rawles, M. E. Tissue interactions in scale and feather development as studies in dermal-epidermal recombinations. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 11, 765-789 (1963).
- McAleese, S. R., Sawyer, R. H. Correcting the phenotype of the epidermis from chick embryos homozygous for the gene scaleless (sc/sc). Science. 214 (4524), 1033-1034 (1981).
- Chuong, C. M., Widelitz, R. B., Ting-Berreth, S., Jiang, T. X. Early events during avian skin appendage regeneration: dependence on epithelial-mesenchymal interaction and order of molecular reappearance. J Invest Dermatol. 107 (4), 639-646 (1996).
- Jiang, T. X., et al. Global feather orientations changed by electric current. iScience. 24 (6), 102671 (2021).
- Jiang, T. X., Jung, H. S., Widelitz, R. B., Chuong, C. M. Self-organization of periodic patterns by dissociated feather mesenchymal cells and the regulation of size, number and spacing of primordia. Development. 126 (22), 4997-5009 (1999).
- Hamburger, V., Hamilton, H. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 188, 49-92 (1951).
- Chen, Y. P., et al. Conservation of early odontogenic signaling pathway in Aves. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 97 (18), 10044-10049 (2000).
- Chuong, C. -M., Ting, S. A., Widelitz, R. B., Lee, Y. S. Mechanism of Skin Morphogenesis: II. Retinoic acid gradient modulates axis orientation and phenotypes of skin appendages. Development. 115 (3), 839-852 (1992).
- Noveen, A., Jiang, T. -X., Chuong, C. -M. Protein kinase A and protein kinase C modulators have reciprocal effects on mesenchymal condensation during skin appendage morphogenesis. Developmental Biology. 171 (2), 677-693 (1995).
- Wu, X. S., et al. Self-assembly of biological networks via adaptive patterning revealed by avian intradermal muscle network formation. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 116 (22), 10858-10867 (2019).
