Summary
Aqui, descrevemos protocolos para três tipos de culturas de explantes de pele embrionária aviária que podem ser usados para examinar interações teciduais, filme de lapso de tempo de imagem 4D (3D mais tempo), perturbação global ou local da função molecular e caracterização de biologia de sistemas.
Abstract
A pele aviária em desenvolvimento durante a embriogênese é um modelo único que pode fornecer informações valiosas sobre a padronização do tecido. Aqui, são descritas três variações nas culturas de explantes cutâneos para examinar diferentes aspectos do desenvolvimento da pele. Primeiro, culturas e manipulações de órgãos ex vivo oferecem aos pesquisadores oportunidades de observar e estudar diretamente o desenvolvimento de botões de penas. A cultura de explante cutâneo pode crescer por 7 dias, permitindo a análise direta do comportamento celular e imagens 4D em intervalos durante esse período de crescimento. Isso também permite manipulações físicas e moleculares das condições de cultura para visualizar a resposta do tecido. Por exemplo, contas revestidas com fator de crescimento podem ser aplicadas localmente para induzir mudanças no padrão de penas em uma área limitada. Alternativamente, a transdução viral pode ser entregue globalmente nos meios de cultura para aumentar ou diminuir a expressão gênica. Em segundo lugar, o protocolo de recombinação da pele permite que os pesquisadores investiguem as interações teciduais entre a epiderme e o mesênquima que são derivadas de diferentes regiões da pele, diferentes estágios de vida ou diferentes espécies. Isso oferece uma oportunidade de testar a janela de tempo na qual o epitélio é competente para responder a sinais e sua capacidade de formar diferentes apêndices cutâneos em resposta a sinais de diferentes fontes mesenquimais. Em terceiro lugar, a reconstituição da pele usando células dérmicas dissociadas revestidas com epitélio intacto redefine o desenvolvimento da pele e permite o estudo dos processos iniciais de padronização periódica. Essa abordagem também aumenta nossa capacidade de manipular a expressão gênica entre as células dissociadas antes de criar o explante de pele reconstituído. Este artigo fornece os três protocolos de cultura e experimentos exemplares para demonstrar sua utilidade.
Introduction
O desenvolvimento da pele do embrião aviário é um excelente modelo para estudar os mecanismos da morfogênese devido aos padrões distintos e à acessibilidade à microcirurgia e manipulação 1,2. No entanto, avaliar eventos celulares e moleculares em tecidos intactos pode ser difícil porque a presença de tecidos estranhos pode complicar as observações microscópicas. Além disso, a capacidade de manipular a expressão gênica para testar seu papel na morfogênese da pele nem sempre é uma tarefa simples. Descobrimos que podemos testar as funções dos genes usando transdução retroviral com uma taxa de sucesso mais alta usando modelos de explante de pele. Aqui discutimos as vantagens de três modelos de explante de pele que foram desenvolvidos.
A cultura da pele embrionária aviária é um sistema poderoso para avaliar o comportamento celular, a regulação gênica e a função durante o desenvolvimento dos botões das penas da pele 3,4,5,6. Permite a avaliação dos mecanismos moleculares do desenvolvimento dos botões de penas através da adição global de fatores de crescimento colocados nos meios de cultura ou sua liberação local de grânulos revestidos com fator de crescimento. Os genes reguladores do desenvolvimento também podem ser manipulados usando a transdução de genes virais de formas negativas intactas ou dominantes para estudos funcionais que avaliam seus papéis em eventos morfogenéticos específicos 7,8.
A cultura de recombinação epitelial-mesenquimal aviária permite que os investigadores determinem as contribuições de cada componente da pele durante os estágios iniciais da morfogênese da pele. O uso dessa abordagem por Rawles revelou que as interações entre o mesênquima e o epitélio são essenciais para a formação de apêndices cutâneos9. O mesênquima pode formar condensações e o epitélio é necessário para induzir e manter as formações de condensação mesenquimal2. Mais tarde, essa abordagem foi usada para avaliar por que as galinhas sem escamas não conseguem formar penas. Descobriu-se que o defeito estava no mesênquima10. Dhouailly realizou estudos de recombinação epitelial-mesenquimal tecidual em embriões de diferentes espécies. Esses estudos forneceram insights evolutivos e de desenvolvimento sobre as comunicações epitelial-mesenquimais que promovem a morfogênese da pele3.
Este estudo foi usado para entender melhor os fatores que controlam o crescimento das penas. O método também melhora a visualização de eventos celulares e moleculares envolvidos na padronização da pele que ocorrem durante a iniciação, desenvolvimento e alongamento das penas ao longo do eixo ântero-posterior. Quando o epitélio é separado do mesênquima e os dois componentes são recombinados, novas interações restabelecem o padrão da pele. Essa abordagem permite avaliar os sinais indutores mesenquimais e as moléculas de competência epitelial que permitem que a epiderme responda aos sinais mesenquimais11. A expressão molecular subsequente a jusante necessária para o desenvolvimento do botão de penas e a formação de padrões também pode ser examinada. Esses estudos estabeleceram que a localização dos botões é controlada pelo mesênquima. A rotação do epitélio 90o antes da recombinação com o mesênquima demonstra que a direção do alongamento do botão da pena é controlada pelo epitélio. Este método foi essencial para estudarmos o mecanismo molecular que regula a orientação dos botões das penas12.
A cultura de reconstituição da pele aviária, na qual o mesênquima da pele é dissociado em células únicas antes de ser plaqueado em alta densidade celular e revestido com epitélio intacto, redefine as células dérmicas a um estado primordial. O explante então se auto-organiza para formar um novo padrão periódico independente das pistas anteriores13. Este modelo de reconstituição da pele pode ser usado para estudar os processos iniciais de padronização periódica de penas. Usamos essa abordagem para explorar como a modulação da proporção de células mesenquimais para um único pedaço de epitélio pode influenciar o tamanho ou o número de botões de penas. Verificou-se que o número de gemas aumentou, mas não o tamanho das gemas, à medida que a proporção de células mesenquimais aumentou. Outra vantagem dessa abordagem é que a transdução viral de células mesenquimais mostra maior eficiência do que nas outras duas condições de cultura e pode produzir fenótipos mais óbvios.
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Protocol
1. Cultura de explante de pele de galinha (Figura 1)
- Incubar ovos de galinha fertilizados em uma incubadora umidificada a 38 ° C e estabelecê-los de acordo com Hamburger e Hamilton14.
- No estágio 28 (~E5.5), o segundo dedo do membro e o terceiro dedo do pé são mais longos que os outros; três dígitos e quatro dedos são distintos.
- No estágio 29 (~E6), a asa é dobrada no cotovelo; O segundo dígito é distintamente mais longo do que os outros.
- No estágio 30 (~ E6.5), duas fileiras de botões de penas dorsais de cada lado da medula espinhal são visíveis no nível braquial e três fileiras são vistas no nível das pernas.
- No estágio 31 (~ E7), existem ~ 7 fileiras de penas nos níveis jumbo-sacral.
- No estágio 32, onze ou mais fileiras de botões de penas estão presentes ao nível das pernas.
- Coloque um embrião de galinha estágio 28-32 em uma placa de Petri de 60 mm contendo solução salina tamponada de Hanks (HBSS) ou solução salina tamponada com fosfato (PBS).
- Disseque a pele dorsal do embrião entre a parte inferior do pescoço e a região da cauda. Use uma tesoura para remover a cabeça do pescoço. Puxe suavemente os botões dos membros para posicionar o lado ventral do corpo para baixo com os apêndices se espalhando para fora.
- Faça uma incisão anterior a posterior na pele ao longo dos dois lados laterais do corpo embrionário usando uma pinça de relojoeiro ou uma tesoura afiada. Certifique-se de estabilizar o corpo com uma pinça, beliscando os botões dos membros longitudinalmente. Descasque suavemente a pele do pescoço até a região da cauda ou da cauda até o pescoço usando uma pinça de relojoeiro.
- Remova suavemente os tecidos subcutâneos que permanecem presos à pele descascada e alise as bordas da pele com a tesoura afiada de mola.
- Adicione 2 mL / poço de meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e solução de penicilina / estreptomicina (diluída 1:100) a um poço em um prato de 6 poços. Uma vez que o meio e os antibióticos tenham sido adicionados, coloque uma inserção de cultura de tecido estéril dentro do poço, de modo que a mídia fique na parte externa da inserção de cultura.
- Transfira a pele com uma espátula para a inserção da cultura com a epiderme voltada para cima e o mesênquima voltado para baixo na membrana da inserção. Para garantir que a pele fique plana sem vincos, puxe a pele para a espátula em HBSS. Deslize a pele da espátula com o líquido para facilitar a transferência da pele sem dobrar.
- Remova o excesso de HBSS do inserto de cultura com uma pipeta de 200 μL. Deixe uma fina camada de HBSS dentro do inserto de cultura para manter o explante semi-úmido para fornecer uma interface ar-líquido.
- Incubar as culturas de explantes cutâneos a 37 °C utilizando 5% de CO2 e 95% de ar. Troque o meio a cada 2 dias.
NOTA: Este procedimento foi publicado4. Este sistema de cultura também pode ser usado com a pele de outras aves, como culturas de explante de pele de codorna ou tentilhão.
2. Recombinação epitelial-mesenquimal da pele de galinha (Figura 2)
- Incubar ovos de galinha fertilizados em uma incubadora umidificada a 38 ° C e estadiar os embriões de acordo com Hamburger e Hamilton14 (seção 1.1).
- Prepare 2x solução salina livre de cálcio e magnésio (CMF) com tampão de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) a 0,25%.
- Faça 10x tampão CMF (NaCl (1,37 M) 80 g, KCl (0,04 M) 3 g, NaH2PO4 (0,004 M) 0,5 g, KH2PO4 (2 M) 0,25 g, NaHCO3 (0,12 M) 10 g, glicose (0,1 M) 20 g em 1.000 mL de água destilada. Ajuste o pH para 7,3. Para fazer 100 mL de 2x CMF com tampão EDTA a 0,25%, o EDTA deve ser dissolvido em 80 mL de água destilada primeiro e, em seguida, adicionar 20 mL de tampão CMF 10x para fazer 2x CMF com solução de trabalho EDTA a 0,25%.
- Dissecar as peles dorsais do embrião de galinha estágio 30-32 em HBSS conforme descrito acima (seção 1.2) e incubá-las em solução salina 2x CMF com 0,25% de EDTA em gelo por 15-20 min.
- Separe cuidadosamente o epitélio e o mesênquima usando uma pinça de relojoeiro. Transfira o epitélio e o mesênquima separados para um prato limpo contendo HBSS.
- Recombine o epitélio com o mesênquima, colocando primeiro o mesênquima em uma placa de Petri contendo HBSS e, em seguida, coloque o epitélio em cima do mesênquima. Coloque o epitélio ao longo do mesmo eixo ântero-posterior do mesênquima ou gire o epitélio 90odo eixo ântero-posterior do mesênquima para determinar qual componente regula diferentes aspectos da morfogênese da pele.
- Transfira as peles recombinadas para inserções de cultura em placas de cultura de 6 poços para crescimento e remova o excesso de HBSS ao redor da pele recombinada.
- Coloque 2 mL de meio de cultura DMEM com 10% de FBS no poço fora da inserção. Coloque uma fina camada de DMEM dentro da câmara de inserção para manter o explante semi-úmido para fornecer uma interface ar-líquido.
- Incubar os recombinantes cutâneos a 37 °C numa mistura de 5% de CO2 e 95% de ar. Troque o meio a cada 2 dias. Documente as mudanças fenotípicas nas fases iniciais do desenvolvimento da pele usando fotografia de lapso de tempo com uma câmera montada em um microscópio de dissecação.
NOTA: Este procedimento foi publicado11.
3. Reconstituição da pele de frango (Figura 3)
- Incubar ovos de galinha fertilizados em uma incubadora umidificada a 38 ° C e estadiar os embriões de acordo com Hamburger e Hamilton14 (seção 1.1).
- Dissecar as peles dorsais do embrião de galinha estágio 30-33 em HBSS. Incube as peles em solução salina 2x CMF com 0,25% de EDTA no gelo por 15-20 min, conforme descrito acima (seção 2.3).
- Separe cuidadosamente o epitélio e o mesênquima usando uma pinça de relojoeiro. Transfira o epitélio e o mesênquima separados para HBSS no gelo.
NOTA: Tenha cuidado para não danificar a camada basal do epitélio ao separar o epitélio do mesênquima. - Colete o mesênquima separado em um tubo de centrífuga de 15 mL e incube com solução de colagenase / tripsina a 0,1% feita em PBS em banho-maria a 37 ° C por 10-15 min.
- Dissocie o mesênquima da pele com uma pipeta de Pasteur para fazer uma suspensão unicelular. Adicione DMEM com 10% de FBS para interromper a digestão.
- Pulverize e centrifugue as células a 233 × g durante 5 min. Ressuspendeu as células com meio de cultura na concentração de 2 × 107 células/mL.
NOTA: Nesta etapa, as células mesenquimais também podem ser ressuspensas em meio contendo vírus por 2-3 h em gelo para transdução gênica. - Coloque uma inserção de cultura de células em um poço de um prato de 6 poços. Solte 10 μL de 2 × 107 células/mL de células mesenquimais no inserto de cultura de tecidos. Coloque 2 ml de meio de cultura DMEM com 10% de FBS no poço fora da inserção. Incubar as células mesenquimais plaqueadas a 37 °C utilizando uma incubadora de ar a 5% de CO2 e a 95% durante 1 h para permitir que as células se depositem na membrana de inserção.
- Transfira o epitélio intacto para cima da gotícula mesenquimal plaqueada com a camada de células basais do epitélio voltada para as células mesenquimais usando uma pipeta de 1 mL.
NOTA: Ao transferir o epitélio para a gotícula mesenquimal, as células mesenquimais não devem ser perturbadas. - Achate o epitélio intacto sobre o mesênquima para fazer o explante de pele reconstituída. Deixe uma fina camada do meio na inserção para manter o explante de pele reconstituída semi-úmido para fornecer uma interface ar-líquido. Incubar o explante cutâneo reconstituído a 37 °C numa incubadora de ar a 5% de CO2 e 95%. Troque o meio a cada 2 dias.
NOTA: Este procedimento foi publicado13.
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Representative Results
Culturas de explante cutâneo
O desenvolvimento de botões de penas de culturas de órgãos da pele ex vivo pode ser observado diretamente ao microscópio. Usando o modelo de cultura de explante de pele da pele dorsal do estágio 30 de frango, os placódios são visíveis ao longo da linha média. A frente morfogenética então se propaga gradualmente lateralmente em direção à periferia da pele com a formação de novos primórdios de penas. Esses primórdios de penas se desenvolverão em botões de penas curtas após 2 dias em cultura e botões de penas longas após 4 dias em cultura (Figura 1).
Culturas de recombinação da pele
Para a recombinação da pele, quando o epitélio e o mesênquima são recombinados, os placódios originais desaparecem. Novos placódios aparecerão logo após a recombinação e se desenvolverão para formar botões de penas curtas e botões de penas longas após 2 e 4 dias em cultura, respectivamente. Se o epitélio for girado 90° em relação ao mesênquima, a orientação dos botões alongados será determinada pelo epitélio (Figura 2).
Culturas de reconstituição da pele
Para a reconstituição da pele, as culturas de órgãos ex vivo parecem homogêneas no início e, em seguida, as condensações dérmicas com espaçamento uniforme se formam simultaneamente após 1 dia de cultura. Deve-se notar que o número de botões de penas depende do número de células mesenquimais. Números mesenquimais mais baixos induziram menos gemas de tamanho semelhante para formar11. Os botões de penas curtas se formarão após 2-3 dias em cultura e os botões de penas longas se formarão após 4-5 dias em cultura (Figura 3).
A Figura 4 mostra diagramas resumidos de cultura de órgãos da pele ex vivo , cultura de órgãos de recombinação da pele e cultura de órgãos de reconstituição da pele.
Figura 1: Cultura de órgãos da pele ex vivo. A pele do embrião de galinha estágio 32 é dissecada em HBSS e cultivada em insertos de cultura de 6 poços (T0, no tempo 0) por 2 e 4 dias. Os primórdios de penas se desenvolvem em botões de penas curtas após 2 dias em cultura e botões de penas longas após 4 dias em cultura. Os placódios dérmicos são indicados pela seta branca. Observe que os botões na linha média são mais maduros do que os de ambos os lados laterais. Este método foi modificado de Jiang e Chuong4. Barra de escala = 500 μm. Abreviatura: HBSS = solução salina tamponada de Hank. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Cultura de órgãos de recombinação da pele ex vivo . A pele do embrião de galinha estágio 32 é dissecada em HBSS, e o epitélio e o mesenquimal são separados em tampão 2x CMF. O epitélio cutâneo e o mesênquima são recombinados com ou sem rotação e cultivados por 2 dias e 4 dias. Os novos placódios se desenvolvem em botões de penas curtos e longos após 2 e 4 dias em cultura. Se o epitélio for girado 90° em relação ao mesênquima, a orientação dos novos botões é determinada pelo epitélio12. Este método foi modificado de Chuong et al.11. Barra de escala = 500 μm. Abreviatura: CMF = livre de cálcio-magnésio. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Cultura de órgãos de reconstituição cutânea ex vivo . A pele do embrião de galinha do estágio 32 é dissecada e o epitélio e o mesênquima são separados em 2x tampão CMF. O mesênquima é dissociado em células únicas por colagenase e tripsina a 0,1% e peletizado em alta densidade celular em um inserto de cultura. O pellet de células dérmicas é reconstituído com um epitélio intacto (T0, no tempo 0) e cultivado por 6 h, 2 dias e 5 dias. Os explantes parecem homogêneos no início (6 h) e, em seguida, as condensações dérmicas com espaçamento uniforme se formam simultaneamente após 1 dia em cultura. Os botões de penas curtas se formarão após 2-3 dias em cultura e os botões de penas longas se formarão após 4-5 dias em cultura. Este método foi modificado a partir de Jiang et al.13. Barra de escala = 500 μm. Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.
Figura 4: Diagramas de modelos de cultura de órgãos da pele ex vivo . A pele inicia em E6.5 como uma única camada de epitélio cobrindo as células mesenquimais. Isso é representado no topo dos três métodos de explante. (A) Cultura de órgãos cutâneos ex vivo. A pele é plaqueada intacta no topo de uma inserção de cultura na interface ar: meio a 37 °C em uma incubadora de ar a 5% de CO2 e 95%. (B) Cultura de órgãos de recombinação da pele ex vivo . O epitélio cutâneo é separado do mesênquima e, em seguida, recombinado antes de ser plaqueado no inserto de cultura de células na interface ar: meio a 37 °C em uma incubadora de ar a 5% de CO2 e 95%. (C) Cultura de órgãos de reconstituição cutânea ex vivo . O epitélio da pele é separado do mesênquima. O mesênquima é então dissociado em uma suspensão unicelular e as células mesenquimais são peletizadas em uma centrífuga. As células mesenquimais são então ressuspensas a uma concentração de 2 × 107 células/mL e 10 μL da suspensão colocada no inserto de cultura e, em seguida, revestida com um pedaço intacto de epiderme. A cultura é incubada no ar: interface de meio a 37 °C em uma incubadora de 5% de CO2 e 95% de ar. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura suplementar S1: Transdução de células mesenquimais com vírus que expressam GFP. Células mesenquimais dissociadas (2 × 107 células/mL) foram incubadas por 3 h em gelo com >107 unidades infecciosas/mL de vírus do sarcoma aviário competente para replicação expressando Proteína Fluorescente Verde (GFP). As células mesenquimais foram então usadas para formar culturas de órgãos de pele reconstituídas, conforme descrito na seção 3 do protocolo acima, e fotografadas 24 horas depois. Os dados mostram que ~ 40% das células mesenquimais foram marcadas com GFP. Clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
A recombinação tecidual fornece um ensaio para explorar as contribuições únicas do epitélio e do mesênquima. Nas galinhas, as penas começam a se desenvolver no dia embrionário 7 (E7), enquanto as escamas começam no E9. Quando o mesênquima de escamas E9 é recombinado com o epitélio de penas E7, o tecido recombinado forma escamas, e quando o mesênquima de penas E7 é recombinado com o epitélio de escamas E9, as penas são formadas11. Esses estudos demonstraram que o mesênquima controla a formação de padrões, o espaçamento e a identidade do órgão. Obviamente, o epitélio deve ser competente para poder receber e interpretar os sinais mesenquimais adequadamente. A competência só existe no epitélio por um curto intervalo de tempo. Em contraste com os resultados acima, surpreendentemente, quando a mucosa oral do frango e o epitélio E5 aboral são recombinados com o mesênquima do tronco E8, o epitélio aboral forma penas; no entanto, a mucosa oral forma múltiplos apêndices semelhantes a dentes15. Isso mostra que, enquanto o mesênquima do tronco da pele direciona o epitélio aboral para fazer penas, o epitélio oral não tem a capacidade de fazer penas e só pode fazer dentes. O epitélio oral neste estudo pode já ter sido comprometido com a formação de dentes em E5. Hibridização in situ , RNAscope e imunocoloração podem ser usados para confirmar a expressão molecular nos explantes recombinados para verificar a identidade dos tecidos que se formam. Usando este ensaio, as perturbações podem ser direcionadas especificamente para o epitélio ou mesênquima.
A reconstituição tecidual redefine as células dentro do mesênquima para um estado não comprometido. A pele das penas E7-E8 começou a formar condensações mesenquimais no trato dorsal antes que a pele seja dissociada e o mesênquima seja dissociado em células únicas. Ao rotular as células epiteliais ou mesenquimais nas regiões primordiais do botão ou interbotão, as células dérmicas podem ser encontradas dentro ou fora dos botões, independentemente de sua localização anterior. Com baixa densidade de células mesenquimais, os explantes de pele reconstituídos formam poucos botões de penas de tamanho normal. À medida que a densidade de células mesenquimais aumenta, o número de gemas aumenta até que uma densidade máxima de empacotamento seja alcançada13. Esses dados indicam que as células são reprogramadas por meio da perda de contato com seus vizinhos iniciais e passam por uma nova rodada de formação de padrões. Essas culturas também desenvolvem condensações e primórdios de penas. Curiosamente, os botões se formam simultaneamente na pele, em oposição à propagação progressiva da formação de botões observada em explantes de pele e explantes de pele recombinados. Este método permite a observação e manipulação de interações celulares e moleculares da pele em estágio inicial. A expressão molecular pode ser avaliada em cultura usando ensaios promotor-repórter. A reconstituição entre linhagens transgênicas ou nocaute pode ajudar a analisar melhor os papéis das moléculas no processo de padronização da pele. A transdução viral é aumentada nas células mesenquimais dissociadas e muitas vezes pode produzir uma perturbação aumentada.
Embora cada uma dessas abordagens experimentais possa ajudar os investigadores a explorar eventos celulares e moleculares que ocorrem durante a morfogênese da pele. Freqüentemente, usamos cada uma dessas abordagens e vemos qual delas fornece os melhores insights. Os resultados podem então ser explorados mais detalhadamente em outras condições de cultura ou usando embriões intactos.
Limitações dessas abordagens
Cada um desses três ensaios fornece resultados altamente reprodutíveis. No entanto, como esses ensaios podem responder à mesma perturbação em diferentes graus, muitas vezes vale a pena perturbar as condições usando todos os três ensaios se nenhuma alteração for encontrada inicialmente. Embora a cultura do explante cutâneo forneça um bom modelo para a formação precoce do padrão cutâneo e o desenvolvimento do apêndice cutâneo, o explante só pode ser cultivado por ~ 1 semana. Isso impede seu uso no desenvolvimento posterior do apêndice cutâneo, por exemplo, no processo de formação da papila dérmica e morfogênese folicular, embora os procedimentos estejam sendo aprimorados para cultivar esses explantes por mais tempo. Até o momento, nos primeiros momentos após a realização de explantes de pele reconstituídos, as células estão frouxamente presas aos seus substratos, dificultando as análises que usam várias lavagens, como a hibridização in situ . Essas culturas ligam seus substratos com mais firmeza por 24 h, nas quais as condensações se formaram ao longo da cultura.
A pele embrionária aviária fornece um excelente modelo para estudar o desenvolvimento de apêndices cutâneos. As culturas de explantes cutâneos têm a vantagem de permitir a manipulação das condições de cultura nas quais as culturas de órgãos cutâneos ex vivo crescem. Ele também permite imagens de longo prazo do desenvolvimento com lapso de tempo para ver a propagação dos botões da linha média para as bordas laterais ao longo do tempo. Além disso, a cultura pode ser iniciada usando diferentes estágios embrionários para explorar diferentes eventos na padronização e crescimento das penas. Para a formação periódica de padrões, a pele pode ser cultivada a partir de E6 e cultivada por 4 dias. Para a morfogênese do folículo de penas, a cultura pode ser iniciada em E8 e cultivada por 4 dias. É difícil dissecar a pele em estágios anteriores a E6. Com culturas de explante, perturbações globais podem ser feitas adicionando fatores de crescimento ou inibidores ao meio de cultura de explante cutâneo 8,16,17. A perturbação local da pele pode ser alcançada colocando esferas revestidas de proteínas no explante da pele ou transduzindo células viralmente para modular a expressão gênica 8,16,17. As culturas de explantes facilitam a imagem do comportamento celular coletivo, como atividades de cálcio6 e a aplicação de forças biofísicas, como tensão tecidual18 ou correntes elétricas12. Esses métodos oferecem grandes oportunidades para fornecer novos insights sobre os fatores que regulam a padronização periódica de órgãos.
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Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.
Acknowledgments
Este trabalho é apoiado pelo NIH NIAMS grant R37 AR 060306, R01 AR 047364 e RO1 AR078050. O trabalho também é apoiado por um contrato de pesquisa colaborativa entre a USC e a China Medical University em Taiwan. Agradecemos à turma de Biologia do Desenvolvimento 2023 da USC BISC 480 por testar com sucesso este protocolo de cultura de pele aviária durante vários módulos de laboratório.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well culture dish | Falcon | REF 353502 | Air-Liquid Interface (ALI) Cultures |
| Cell culture inset | Falcon | REF 353090. | 0.4 µm Transparent PET Membrane |
| Collagenase Type 1 | Worthington Biochemical | LS004196 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Corning | 10-013-CV | 4.5 g/L glucose |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher | 16140-071 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Hanks’s buffered saline solution | Gibco | 14170-112 | No calcium, no magnesium |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15-140-122 | |
| Pogassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5379 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Sodium chloride (Nacl) | EMD | CAS 7647-14-5 | |
| Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) | Sigma-Aldrich | S0751 | |
| Trypsin | Gibco | 27250-042 |
References
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