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Developmental Biology

ऊतक पैटर्निंग और ऑर्गेनोजेनेसिस का अध्ययन करने के लिए एवियन स्किन एक्सप्लांट्स का उपयोग करना

Published: September 15, 2023 doi: 10.3791/65580
Automatic Translation
1, 2, 3, 1, 1
1Department of Pathology, Keck School of Medicine of University of Southern California, 2Molecular and Computational Biology, University of Southern California, 3Department of Radiology, Keck School of Medicine of University of Southern California

Summary

यहां हम तीन प्रकार के एवियन भ्रूण त्वचा एक्सप्लांट संस्कृतियों के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जिनका उपयोग ऊतक इंटरैक्शन, 4 डी इमेजिंग टाइमलैप्स मूवी (3 डी प्लस टाइम), आणविक कार्य के वैश्विक या स्थानीय गड़बड़ी और सिस्टम जीव विज्ञान लक्षण वर्णन की जांच के लिए किया जा सकता है।

Abstract

भ्रूणजनन के दौरान विकासशील एवियन त्वचा एक अनूठा मॉडल है जो ऊतक पैटर्निंग में मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है। यहां त्वचा के विकास के विभिन्न पहलुओं की जांच करने के लिए त्वचा एक्सप्लांट संस्कृतियों पर तीन भिन्नताएं वर्णित हैं। सबसे पहले, पूर्व विवो अंग संस्कृतियों और जोड़तोड़ शोधकर्ताओं को सीधे पंख कलियों के विकास का निरीक्षण और अध्ययन करने के अवसर प्रदान करते हैं। त्वचा एक्सप्लांट संस्कृति इस विकास अवधि के दौरान अंतराल पर सेलुलर व्यवहार और 4 डी इमेजिंग के प्रत्यक्ष विश्लेषण को सक्षम करने के लिए 7 दिनों तक बढ़ सकती है। यह ऊतक प्रतिक्रिया की कल्पना करने के लिए संस्कृति की स्थिति के भौतिक और आणविक जोड़तोड़ के लिए भी अनुमति देता है। उदाहरण के लिए, विकास कारक लेपित मोती एक सीमित क्षेत्र में पंख patterning में परिवर्तन प्रेरित करने के लिए स्थानीय रूप से लागू किया जा सकता है. वैकल्पिक रूप से, वायरल पारगमन को जीन अभिव्यक्ति को ऊपर या नीचे करने के लिए संस्कृति मीडिया में विश्व स्तर पर वितरित किया जा सकता है। दूसरा, त्वचा पुनर्संयोजन प्रोटोकॉल शोधकर्ताओं को एपिडर्मिस और मेसेनचाइम के बीच ऊतक इंटरैक्शन की जांच करने की अनुमति देता है जो विभिन्न त्वचा क्षेत्रों, विभिन्न जीवन चरणों या विभिन्न प्रजातियों से प्राप्त होते हैं। यह उस समय खिड़की का परीक्षण करने का अवसर देता है जिसमें उपकला संकेतों का जवाब देने के लिए सक्षम है और विभिन्न मेसेनकाइमल स्रोतों से संकेतों के जवाब में विभिन्न त्वचा उपांग बनाने की क्षमता है। तीसरा, बरकरार उपकला के साथ मढ़ा अलग त्वचीय कोशिकाओं का उपयोग कर त्वचा पुनर्गठन त्वचा के विकास को रीसेट करता है और आवधिक patterning की प्रारंभिक प्रक्रियाओं के अध्ययन को सक्षम बनाता है. यह दृष्टिकोण पुनर्गठित त्वचा प्रत्यारोपण बनाने से पहले अलग-अलग कोशिकाओं के बीच जीन अभिव्यक्ति में हेरफेर करने की हमारी क्षमता को भी बढ़ाता है। यह पत्र उनकी उपयोगिता प्रदर्शित करने के लिए तीन संस्कृति प्रोटोकॉल और अनुकरणीय प्रयोग प्रदान करता है।

Introduction

एवियन भ्रूण त्वचा विकास अलग-अलग पैटर्न और माइक्रोसर्जरी और हेरफेर 1,2 तक पहुंच के कारण मॉर्फोजेनेसिस के तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल है। हालांकि, बरकरार ऊतकों में सेलुलर और आणविक घटनाओं का मूल्यांकन करना मुश्किल हो सकता है क्योंकि बाहरी ऊतकों की उपस्थिति सूक्ष्म टिप्पणियों को जटिल कर सकती है। इसके अलावा, त्वचा आकृति विज्ञान में उनकी भूमिका का परीक्षण करने के लिए जीन अभिव्यक्ति में हेरफेर करने की क्षमता हमेशा एक सरल कार्य नहीं होती है। हम पाते हैं कि हम त्वचा एक्सप्लांट मॉडल का उपयोग करके उच्च सफलता दर के साथ रेट्रोवायरल ट्रांसडक्शन का उपयोग करके जीन कार्यों का परीक्षण कर सकते हैं। यहां हम तीन त्वचा एक्सप्लांट मॉडल के फायदों पर चर्चा करते हैं जिन्हें विकसित किया गया है।

एवियन भ्रूण त्वचा संस्कृति त्वचा पंख कलीविकास 3,4,5,6 के दौरान सेल व्यवहार, जीन विनियमन, और समारोह का आकलन करने के लिए एक शक्तिशाली प्रणाली है. यह संस्कृति मीडिया में रखे गए विकास कारकों के वैश्विक जोड़ या विकास कारक-लेपित मोतियों से उनकी स्थानीय रिहाई के माध्यम से पंख कली विकास के आणविक तंत्र के मूल्यांकन की अनुमति देता है। विकासात्मक नियामक जीन भी कार्यात्मक अध्ययन के लिए बरकरार या प्रमुख नकारात्मक रूपों के वायरल जीन पारगमन का उपयोग कर हेरफेर किया जा सकता है विशिष्ट morphogenetic घटनाओं 7,8 में उनकी भूमिकाओं का मूल्यांकन.

एवियन एपिथेलियल-मेसेनकाइमल पुनर्संयोजन संस्कृति जांचकर्ताओं को त्वचा मोर्फोजेनेसिस के शुरुआती चरणों के दौरान प्रत्येक त्वचा घटक के योगदान को निर्धारित करने में सक्षम बनाती है। रॉल्स के इस दृष्टिकोण के उपयोग से पता चला कि मेसेनचाइम और उपकला के बीच बातचीत त्वचा उपांग9 बनाने के लिए आवश्यक है। मेसेनचाइम संघनन बना सकता है और मेसेनकाइमल संघनन संरचनाओं को प्रेरित करने और बनाए रखने के लिए उपकला की आवश्यकता होती है2. बाद में, इस दृष्टिकोण का उपयोग यह आकलन करने के लिए किया गया था कि स्केललेस मुर्गियां पंख बनाने में विफल क्यों होती हैं। दोष मेसेनचाइम10 में पाया गया था। धोईली ने विभिन्न प्रजातियों के भ्रूणों में ऊतक उपकला-मेसेनकाइमल पुनर्संयोजन अध्ययन किया। इन अध्ययनों ने उपकला-मेसेनकाइमल संचार में विकासात्मक और विकासवादी अंतर्दृष्टि प्रदान की जो त्वचा मोर्फोजेनेसिस3 को बढ़ावा देती है।

इस अध्ययन का उपयोग उन कारकों को बेहतर ढंग से समझने के लिए किया गया था जो पंख के विकास को नियंत्रित करते हैं। विधि त्वचा पैटर्निंग में शामिल सेलुलर और आणविक घटनाओं के दृश्य में भी सुधार करती है जो पंख दीक्षा, विकास और पूर्वकाल-पीछे अक्ष के साथ बढ़ाव के दौरान होती है। जब उपकला को मेसेनचाइम से अलग किया जाता है और दो घटकों को फिर से जोड़ा जाता है, तो नई बातचीत त्वचा पैटर्निंग को फिर से स्थापित करती है। यह दृष्टिकोण हमें मेसेनकाइमल उत्प्रेरण संकेतों और उपकला क्षमता अणुओं का मूल्यांकन करने की अनुमति देता है जो एपिडर्मिस को मेसेनकाइमल संकेतों11 का जवाब देने में सक्षम बनाता है। पंख कली के विकास और पैटर्न गठन के लिए आवश्यक बाद में बहाव आणविक अभिव्यक्ति की भी जांच की जा सकती है। इन अध्ययनों ने स्थापित किया है कि कलियों का स्थान मेसेनचाइम द्वारा नियंत्रित होता है। मेसेनचाइम के साथ पुनर्संयोजन से पहले उपकला 90ओ का रोटेशन दर्शाता है कि पंख कली बढ़ाव की दिशा उपकला द्वारा नियंत्रित होती है। यह विधि हमारे लिए पंख कली अभिविन्यास12 को विनियमित करने वाले आणविक तंत्र का अध्ययन करने के लिए आवश्यक थी।

एवियन त्वचा पुनर्गठन संस्कृति, जिसमें त्वचा मेसेनचाइम को उच्च कोशिका घनत्व पर चढ़ाना से पहले एकल कोशिकाओं से अलग किया जाता है और बरकरार उपकला के साथ मढ़ा जाता है, त्वचीय कोशिकाओं को एक मौलिक अवस्था में रीसेट करता है। एक्सप्लांट तब पिछले संकेतों13 से स्वतंत्र एक नया आवधिक पैटर्न बनाने के लिए स्व-आयोजन करता है। इस त्वचा पुनर्गठन मॉडल पंख आवधिक patterning की प्रारंभिक प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हमने इस दृष्टिकोण का उपयोग यह पता लगाने के लिए किया कि उपकला के एक टुकड़े के लिए मेसेनकाइमल कोशिकाओं के अनुपात को कैसे संशोधित करना पंख कलियों के आकार या संख्या को प्रभावित कर सकता है। कलियों की संख्या में वृद्धि पाई गई लेकिन कलियों के आकार में नहीं क्योंकि मेसेनकाइमल कोशिकाओं का अनुपात बढ़ गया। इस दृष्टिकोण का एक और लाभ यह है कि मेसेनकाइमल सेल वायरल पारगमन अन्य दो संस्कृति स्थितियों की तुलना में उच्च दक्षता दिखाता है और अधिक स्पष्ट फेनोटाइप उत्पन्न कर सकता है।

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Protocol

1. चिकन त्वचा एक्सप्लांट संस्कृति (चित्र 1)

  1. 38 डिग्री सेल्सियस पर एक आर्द्र इनक्यूबेटर में निषेचित चिकन अंडे सेते हैं और हैमबर्गर और हैमिल्टन14 के अनुसार उन्हें मंच.
    1. चरण 28 (~ ई 5.5) पर, अंग का दूसरा अंक और तीसरा पैर की अंगुली दूसरों की तुलना में लंबी होती है; तीन अंक और चार पैर की उंगलियां अलग हैं।
    2. चरण 29 (~ ई 6) पर, पंख कोहनी पर मुड़ा हुआ है; दूसरा अंक दूसरों की तुलना में स्पष्ट रूप से लंबा है।
    3. चरण 30 (~ E6.5) पर, रीढ़ की हड्डी के दोनों ओर दो पृष्ठीय पंख कली पंक्तियाँ ब्रेकियल स्तर पर दिखाई देती हैं और पैरों के स्तर पर तीन पंक्तियाँ दिखाई देती हैं।
    4. चरण 31 (~ ई 7) पर, जंबो-त्रिक स्तरों पर पंखों की ~ 7 पंक्तियां हैं।
    5. चरण 32 में, पंख की कलियों की ग्यारह या अधिक पंक्तियाँ पैरों के स्तर पर मौजूद होती हैं।
  2. हैंक्स बफर खारा समाधान (एचबीएसएस) या फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) युक्त एक 60 मिमी पेट्री डिश में एक चरण 28-32 चिकन भ्रूण रखें.
    1. पूंछ क्षेत्र के लिए निचले गर्दन के बीच भ्रूण पृष्ठीय त्वचा बाहर काटना. गर्दन से सिर निकालने के लिए कैंची का इस्तेमाल करें। धीरे अंग कलियों खींचें करने के लिए शरीर के उदर पक्ष नीचे की ओर स्थिति उपांगों के साथ बाहर की ओर फैलने.
    2. घड़ीसाज़ के संदंश या तेज वसंत कैंची का उपयोग करके भ्रूण शरीर के दो किनारों के साथ त्वचा में पीछे चीरा करने के लिए एक पूर्वकाल बनाओ। अंग कलियों अनुदैर्ध्य चुटकी द्वारा संदंश की एक जोड़ी के साथ शरीर को स्थिर करने के लिए सुनिश्चित करें. धीरे घड़ीसाज़ संदंश का उपयोग गर्दन से पूंछ क्षेत्र के लिए या गर्दन को पूंछ से गर्दन तक त्वचा छीलें.
  3. धीरे से चमड़े के नीचे के ऊतकों को हटा दें जो खुली त्वचा से जुड़े रहते हैं और तेज वसंत कैंची के साथ त्वचा के किनारों को चिकना करते हैं।
  4. Dulbecco के संशोधित ईगल के माध्यम (DMEM) के 2 एमएल / अच्छी तरह से 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन समाधान (पतला 1:100) के साथ एक 6 अच्छी तरह से पकवान में एक अच्छी तरह से करने के लिए जोड़ें. एक बार माध्यम और एंटीबायोटिक दवाओं जोड़ा गया है, अच्छी तरह से अंदर एक बाँझ ऊतक संस्कृति डालने जगह है, जैसे कि मीडिया संस्कृति डालने के बाहरी पर है.
  5. एपिडर्मिस चेहरे के साथ संस्कृति डालने के लिए एक रंग के साथ त्वचा को स्थानांतरित करें और डालने वाली झिल्ली पर मेसेनचाइम का सामना करना पड़ता है। यह सुनिश्चित करने के लिए कि त्वचा बिना किसी क्रीज के सपाट हो, त्वचा को एचबीएसएस में स्पैटुला पर खींचें। तह के बिना त्वचा के हस्तांतरण की सुविधा के लिए तरल के साथ स्पैटुला से त्वचा को स्लाइड करें।
  6. एक 200 माइक्रोन विंदुक के साथ संस्कृति डालने से अतिरिक्त एचबीएसएस निकालें। एक हवा-तरल इंटरफ़ेस प्रदान करने के लिए एक्सप्लांट को अर्ध-गीला रखने के लिए संस्कृति डालने के अंदर एचबीएसएस की एक पतली परत छोड़ दें।
  7. 5% सीओ2 और 95% हवा का उपयोग करके 37 डिग्री सेल्सियस पर त्वचा एक्सप्लांट संस्कृतियों को इनक्यूबेट करें। हर 2 दिन में माध्यम बदलें।
    नोट: यह प्रक्रिया 4 प्रकाशित की गईहै। इस संस्कृति प्रणाली का उपयोग अन्य पक्षियों की त्वचा जैसे बटेर या फिंच त्वचा एक्सप्लांट संस्कृतियों के साथ भी किया जा सकता है।

2. चिकन त्वचा उपकला-मेसेनकाइमल पुनर्संयोजन (चित्रा 2)

  1. 38 डिग्री सेल्सियस पर एक आर्द्र इनक्यूबेटर में निषेचित चिकन अंडे सेते हैं और हैमबर्गर और हैमिल्टन14 (धारा 1.1) के अनुसार भ्रूण मंच.
  2. 0.25% एथिलीनडायमिनेटेट्राएसेटिक एसिड (ईडीटीए) बफर के साथ 2x कैल्शियम-मैग्नीशियम-मुक्त (सीएमएफ) खारा तैयार करें।
    1. 10x सीएमएफ बफर (NaCl (1.37 M) 80 ग्राम, KCl (0.04 M) 3 ग्राम, NaH2PO4 (0.004 M) 0.5 ग्राम, KH2PO4 (2 M) 0.25 ग्राम, NaHCO3 (0.12 M) 10 ग्राम, ग्लूकोज (0.1 M) आसुत जल के 1,000 mL में 20 ग्राम बनाएं। पीएच को 7.3 पर समायोजित करें। 0.25% EDTA बफर के साथ 2x CMF के 100 एमएल बनाने के लिए, EDTA को पहले 80 एमएल आसुत जल में भंग किया जाना चाहिए, फिर 0.25% EDTA कार्य समाधान के साथ 2x CMF बनाने के लिए 10x CMF बफर के 20 एमएल जोड़ें।
  3. एचबीएसएस में चरण 30-32 चिकन भ्रूण पृष्ठीय खाल को ऊपर वर्णित (धारा 1.2) विच्छेदन करें और उन्हें 15-20 मिनट के लिए बर्फ पर 0.25% ईडीटीए के साथ 2x सीएमएफ खारा में इनक्यूबेट करें।
  4. ध्यान से उपकला और mesenchyme घड़ीसाज़ संदंश का उपयोग अलग करें. अलग किए गए उपकला और मेसेनचाइम को एचबीएसएस युक्त एक साफ डिश में स्थानांतरित करें।
  5. पहले HBSS युक्त पेट्री डिश पर मेसेनचाइम रखकर मेसेनचाइम के साथ उपकला को पुनर्संयोजित करें, फिर उपकला को मेसेनचाइम के ऊपर रखें। उपकला को मेसेनचाइम के समान पूर्वकाल-पश्च अक्ष के साथ रखें या उपकला को मेसेनचाइम के पूर्वकाल-पीछे के अक्ष से 90ओ चालू करें ताकि यह निर्धारित किया जा सके कि कौन सा घटक त्वचा मोर्फोजेनेसिस के विभिन्न पहलुओं को नियंत्रित करता है।
  6. विकास के लिए 6-अच्छी तरह से संस्कृति व्यंजनों में संस्कृति आवेषण के लिए पुनर्संयोजित खाल को स्थानांतरित करें और पुनर्संयोजित त्वचा के आसपास अतिरिक्त एचबीएसएस को हटा दें।
  7. डालने के बाहर अच्छी तरह से 10% एफबीएस के साथ डीएमईएम संस्कृति माध्यम के 2 एमएल रखें। डालने कक्ष के अंदर DMEM की एक पतली परत रखें एक हवा तरल इंटरफ़ेस प्रदान करने के लिए संयंत्र अर्द्ध गीला रखने के लिए.
  8. 5% सीओ2 और 95% हवा के मिश्रण में 37 डिग्री सेल्सियस पर त्वचा पुनः संयोजक सेते हैं। हर 2 दिन में माध्यम बदलें। एक विदारक माइक्रोस्कोप पर घुड़सवार कैमरे के साथ समय चूक फोटोग्राफी का उपयोग करके त्वचा के विकास के प्रारंभिक त्वचा चरणों में दस्तावेज़ फेनोटाइपिक परिवर्तन।
    नोट: इस प्रक्रिया11 प्रकाशित किया गया है.

3. चिकन त्वचा पुनर्गठन (चित्र 3)

  1. 38 डिग्री सेल्सियस पर एक आर्द्र इनक्यूबेटर में निषेचित चिकन अंडे सेते हैं और हैमबर्गर और हैमिल्टन14 (धारा 1.1) के अनुसार भ्रूण मंच.
  2. HBSS में चरण 30-33 चिकन भ्रूण पृष्ठीय खाल काटना. ऊपर वर्णित (धारा 2.3) के रूप में 15-20 मिनट के लिए बर्फ पर 0.25% ईडीटीए के साथ 2x सीएमएफ खारा में खाल सेते हैं।
  3. ध्यान से उपकला और mesenchyme घड़ीसाज़ संदंश का उपयोग अलग करें. अलग उपकला और मेसेनचाइम को बर्फ पर एचबीएसएस में स्थानांतरित करें।
    नोट: उपकला को मेसेनचाइम से अलग करते समय उपकला की बेसल परत को नुकसान न पहुंचाने के लिए सावधान रहें।
  4. एक 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में अलग मेसेनचाइम लीजिए और 10-15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में पीबीएस में किए गए 0.1% कोलेजनेज / ट्रिप्सिन समाधान के साथ सेते हैं।
  5. एकल-सेल निलंबन बनाने के लिए एक पाश्चर पिपेट के साथ त्वचा मेसेनचाइम को अलग करें। पाचन को रोकने के लिए 10% FBS के साथ DMEM जोड़ें.
  6. गोली और 5 मिनट के लिए 233 × ग्राम पर कोशिकाओं अपकेंद्रित्र. 2 × 107 कोशिकाओं / एमएल की एकाग्रता पर संस्कृति माध्यम के साथ कोशिकाओं को निलंबित कर दिया।
    नोट: इस चरण में, मेसेनकाइमल कोशिकाओं को जीन पारगमन के लिए बर्फ पर 2-3 घंटे के लिए वायरस युक्त माध्यम में भी निलंबित किया जा सकता है।
  7. एक 6 अच्छी तरह से पकवान के एक अच्छी तरह से में एक सेल संस्कृति डालने रखें. टिशू कल्चर डालने पर 2 × 107 कोशिकाओं/एमएल मेसेनकाइमल कोशिकाओं के 10 माइक्रोन ड्रॉप करें। डालने के बाहर अच्छी तरह से में 10% एफबीएस के साथ डीएमईएम संस्कृति माध्यम के 2 मिलीलीटर रखें। कोशिकाओं को सम्मिलित झिल्ली पर बसने की अनुमति देने के लिए 1 घंटे के लिए 5% सीओ2 और 95% वायु इनक्यूबेटर का उपयोग करके 37 डिग्री सेल्सियस पर मढ़वाया मेसेनकाइमल कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
  8. 1 एमएल पिपेट का उपयोग करके मेसेनकाइमल कोशिकाओं का सामना करने वाले उपकला बेसल सेल परत के साथ मढ़वाया मेसेनकाइमल छोटी बूंद के शीर्ष पर बरकरार उपकला को स्थानांतरित करें।
    नोट: उपकला को मेसेनकाइमल छोटी बूंद में स्थानांतरित करते समय, मेसेनकाइमल कोशिकाओं को परेशान नहीं किया जाना चाहिए।
  9. पुनर्गठित त्वचा को बाहर निकालने के लिए मेसेनचाइम पर बरकरार उपकला को समतल करें। एक हवा-तरल इंटरफ़ेस प्रदान करने के लिए पुनर्गठित त्वचा प्रत्यारोपण अर्ध-गीला रखने के लिए डालने पर माध्यम की एक पतली परत छोड़ दें। 5% सीओ2 और 95% वायु इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर पुनर्गठित त्वचा प्रत्यारोपण को इनक्यूबेट करें। हर 2 दिन में माध्यम बदलें।
    नोट: इस प्रक्रिया13 प्रकाशित किया गया है.

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Representative Results

त्वचा एक्सप्लांट संस्कृतियों
पूर्व विवो त्वचा अंग संस्कृतियों से पंख कली का विकास सीधे माइक्रोस्कोप के नीचे देखा जा सकता है। चिकन स्टेज 30 पृष्ठीय त्वचा के स्किन एक्सप्लांट कल्चर मॉडल का उपयोग करते हुए, प्लेकोड मिडलाइन के साथ दिखाई देते हैं। मॉर्फोजेनेटिक फ्रंट फिर धीरे-धीरे नए पंख प्रिमोर्डिया के गठन के साथ त्वचा की परिधि की ओर पार्श्व रूप से फैलता है। ये पंख प्राइमोर्डिया संस्कृति में 2 दिनों के बाद छोटे पंख की कलियों और संस्कृति में 4 दिनों के बाद लंबे पंख कलियों में विकसित होंगे (चित्र 1)।

त्वचा पुनर्संयोजन संस्कृतियों
त्वचा के पुनर्संयोजन के लिए, जब उपकला और मेसेनचाइम को पुन: संयोजित किया जाता है, तो मूल प्लेकोड गायब हो जाते हैं। पुनर्संयोजन के तुरंत बाद नए प्लेकोड दिखाई देंगे और क्रमशः संस्कृति में 2 और 4 दिनों के बाद छोटे पंख की कलियों और लंबे पंख की कलियों को बनाने के लिए विकसित होंगे। यदि उपकला को मेसेनचाइम के सापेक्ष 90 ° घुमाया जाता है, तो लम्बी कलियों का उन्मुखीकरण उपकला(चित्रा 2)द्वारा निर्धारित किया जाएगा।

त्वचा पुनर्गठन संस्कृतियों
त्वचा पुनर्गठन के लिए, पूर्व विवो अंग संस्कृतियों पहली बार में सजातीय दिखाई देते हैं, और फिर संस्कृति में 1 दिन के बाद एक साथ रिक्ति रूप के साथ त्वचीय संघनन। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि पंख की कलियों की संख्या मेसेनकाइमल कोशिकाओं की संख्या पर निर्भर है। कम मेसेनकाइमल संख्या ने11 बनाने के लिए एक समान आकार की कम कलियों को प्रेरित किया। संस्कृति में 2-3 दिनों के बाद छोटी पंख कलियों का निर्माण होगा और संस्कृति में 4-5 दिनों के बाद लंबी पंख कलियों का निर्माण होगा(चित्र 3)।

चित्रा 4 पूर्व विवो त्वचा अंग संस्कृति, त्वचा पुनर्संयोजन अंग संस्कृति, और त्वचा पुनर्गठन अंग संस्कृति के सारांश आरेख दिखाता है।

Figure 1
चित्रा 1: पूर्व विवो त्वचा अंग संस्कृति। स्टेज 32 चिकन भ्रूण त्वचा HBSS में विच्छेदित है और 2 और 4 दिनों के लिए 6 अच्छी तरह से संस्कृति आवेषण (T0, समय 0 पर) में सुसंस्कृत. पंख प्राइमोर्डिया संस्कृति में 2 दिनों के बाद छोटे पंख की कलियों में विकसित होता है और संस्कृति में 4 दिनों के बाद लंबे पंख की कलियों में विकसित होता है। त्वचीय प्लेकोड सफेद तीर द्वारा इंगित किए जाते हैं। ध्यान दें कि मिडलाइन में कलियाँ दोनों पार्श्व पक्षों की तुलना में अधिक परिपक्व होती हैं। इस विधि जियांग और चुओंग4 से संशोधित किया गया है. स्केल बार = 500 माइक्रोन. संक्षिप्तीकरण: HBSS = हांक का बफर खारा समाधान। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: पूर्व विवो त्वचा पुनर्संयोजन अंग संस्कृति। स्टेज 32 चिकन भ्रूण त्वचा HBSS में विच्छेदित है, और उपकला और mesenchymal 2x CMF बफर में अलग कर रहे हैं. त्वचा उपकला और मेसेनचाइम को रोटेशन के साथ या बिना पुनर्संयोजित किया जाता है और 2 दिनों और 4 दिनों के लिए सुसंस्कृत किया जाता है। नए प्लेकोड संस्कृति में 2- और 4 दिनों के बाद छोटे और लंबे पंख की कलियों में विकसित होते हैं। यदि उपकला को मेसेनचाइम के सापेक्ष 90 ° घुमाया जाता है, तो नई कलियों का उन्मुखीकरण उपकला12 द्वारा निर्धारित किया जाता है। इस विधि Chuong एट al.11 से संशोधित किया गया है. स्केल बार = 500 माइक्रोन. संक्षिप्तीकरण: सीएमएफ = कैल्शियम-मैग्नीशियम मुक्त। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: पूर्व विवो त्वचा पुनर्गठन अंग संस्कृति। स्टेज 32 चिकन भ्रूण त्वचा विच्छेदित है, और उपकला और mesenchyme 2x सीएमएफ बफर में अलग कर रहे हैं. मेसेनचाइम को 0.1% कोलेजनेज और ट्रिप्सिन द्वारा एकल कोशिकाओं में अलग किया जाता है और एक संस्कृति डालने पर उच्च सेल घनत्व पर गोली दी जाती है। त्वचीय कोशिका गोली एक बरकरार उपकला (T0, समय 0 पर) के साथ पुनर्गठित है और 6 घंटे, 2 दिन, और 5 दिनों के लिए सुसंस्कृत. एक्सप्लांट पहले (6 एच) पर सजातीय दिखाई देते हैं और फिर संस्कृति में 1 दिन के बाद एक साथ रिक्ति रूप के साथ त्वचीय संघनन दिखाई देते हैं। कल्चर में 2-3 दिनों के बाद छोटे पंख की कलियाँ बनेंगी और कल्चर में 4-5 दिनों के बाद लंबी पंख की कली बनेगी। इस विधि जियांग एट अल.13 से संशोधित किया गया है. स्केल बार = 500 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: पूर्व विवो त्वचा अंग संस्कृति मॉडल के आरेख। त्वचा E6.5 पर उपकला ओवरलेइंग मेसेनकाइमल कोशिकाओं की एक परत के रूप में शुरू होती है। यह तीन एक्सप्लांट विधियों के शीर्ष पर दर्शाया गया है। (ए) पूर्व विवो त्वचा अंग संस्कृति। त्वचा को हवा में एक संस्कृति डालने के शीर्ष पर बरकरार रखा जाता है: 5% सीओ2 और 95% एयर इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर मीडिया इंटरफेस। (बी) पूर्व विवो त्वचा पुनर्संयोजन अंग संस्कृति। त्वचा उपकला mesenchyme से अलग है और फिर हवा में सेल संस्कृति डालने पर चढ़ाना से पहले recombined है: एक 5% सीओ2 और 95% हवा इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर मीडिया इंटरफ़ेस. (सी) पूर्व विवो त्वचा पुनर्गठन अंग संस्कृति। त्वचा उपकला को मेसेनचाइम से अलग किया जाता है। मेसेनचाइम को तब एकल-कोशिका निलंबन में अलग कर दिया जाता है और मेसेनकाइमल कोशिकाओं को एक अपकेंद्रित्र में गोली मार दी जाती है। मेसेनकाइमल कोशिकाओं को तब 2 × 107 कोशिकाओं/एमएल और निलंबन के 10 माइक्रोन की एकाग्रता पर फिर से निलंबित कर दिया जाता है, जिसे संस्कृति डालने पर रखा जाता है और फिर एपिडर्मिस के एक अक्षुण्ण टुकड़े के साथ मढ़ा जाता है। संस्कृति को हवा में इनक्यूबेट किया जाता है: 5% सीओ2 और 95% एयर इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर मीडिया इंटरफेस। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा एस 1: जीएफपी व्यक्त वायरस के साथ मेसेनचाइम कोशिकाओं का पारगमन। विघटित मेसेनकाइमल कोशिकाओं (2 × 107 कोशिकाओं / एमएल) को बर्फ पर 3 घंटे के लिए >107 संक्रामक इकाइयों / एमएल प्रतिकृति-सक्षम एवियन सारकोमा वायरस के साथ ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) व्यक्त करने के लिए इनक्यूबेट किया गया था। मेसेनकाइमल कोशिकाओं तो पुनर्गठित त्वचा अंग संस्कृतियों के रूप में ऊपर प्रोटोकॉल खंड 3 में वर्णित फार्म के लिए इस्तेमाल किया गया और 24 घंटे बाद फोटो खिंचवाया. आंकड़ों से पता चलता है कि ~ 40% मेसेनकाइमल कोशिकाओं को जीएफपी के साथ लेबल किया गया था। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

ऊतक पुनर्संयोजन उपकला और मेसेनचाइम के अद्वितीय योगदान का पता लगाने के लिए एक परख प्रदान करता है। मुर्गियों में, भ्रूण के दिन 7 (E7) पर पंख विकसित होने लगते हैं जबकि तराजू E9 से शुरू होते हैं। जब E9 पैमाने mesenchyme E7 पंख उपकला के साथ recombined है, recombined ऊतक तराजू रूपों, और E7 पंख mesenchyme E9 पैमाने उपकला पंख11 गठन कर रहे हैं के साथ recombined है जब ई 7 पंख mesenchyme है. इन अध्ययनों से पता चला है कि मेसेनचाइम पैटर्न, गठन, रिक्ति और अंग पहचान को नियंत्रित करता है। बेशक, उपकला को मेसेनकाइमल संकेतों को उचित रूप से प्राप्त करने और व्याख्या करने में सक्षम होना चाहिए। क्षमता केवल थोड़े समय के अंतराल के लिए उपकला में मौजूद है। उपरोक्त परिणामों के विपरीत, आश्चर्यजनक रूप से जब चिकन मौखिक श्लेष्म और एबोरल ई 5 उपकला को ई 8 ट्रंक मेसेनचाइम के साथ पुन: संयोजित किया जाता है, तो एबोरल एपिथेलियम पंख बनाता है; हालांकि, मौखिक श्लेष्म कई दांत की तरह उपांग15 रूपों है. इससे पता चलता है कि जबकि त्वचा ट्रंक मेसेनचाइम पंख बनाने के लिए एबोरल एपिथेलियम को निर्देशित करता है, मौखिक उपकला में पंख बनाने की क्षमता नहीं होती है और केवल दांत बना सकते हैं। इस अध्ययन में मौखिक उपकला पहले से ही ई 5 पर दांत बनाने के लिए प्रतिबद्ध हो सकती है। स्वस्थानी संकरण में, आरएनएस्कोप, और इम्यूनोस्टेनिंग का उपयोग पुनर्संयोजित एक्सप्लांट्स में आणविक अभिव्यक्ति की पुष्टि करने के लिए किया जा सकता है ताकि ऊतकों की पहचान को सत्यापित किया जा सके। इस परख का उपयोग करके, गड़बड़ी को विशेष रूप से उपकला या मेसेनचाइम के लिए निर्देशित किया जा सकता है।

ऊतक पुनर्गठन मेसेनचाइम के भीतर कोशिकाओं को एक गैर-प्रतिबद्ध स्थिति में रीसेट करता है। E7-E8 पंख वाली त्वचा ने त्वचा के अलग होने से पहले पृष्ठीय पथ में मेसेनकाइमल संघनन बनाना शुरू कर दिया है और मेसेनचाइम को एकल कोशिकाओं से अलग कर दिया गया है। प्राइमर्डियल कली या इंटरबड क्षेत्रों में उपकला या मेसेनकाइमल कोशिकाओं को लेबल करके, त्वचीय कोशिकाओं को उनके पिछले स्थान की परवाह किए बिना कलियों के अंदर या बाहर पाया जा सकता है। कम मेसेनकाइमल सेल घनत्व पर, पुनर्गठित त्वचा एक्सप्लांट कुछ सामान्य आकार के पंख की कलियों का निर्माण करते हैं। मेसेनकाइमल सेल घनत्व बढ़ जाती है के रूप में, कलियों की संख्या बढ़ जाती है जब तक एक अधिकतम पैकिंग घनत्व13 हासिल की है. इन आंकड़ों से संकेत मिलता है कि कोशिकाओं को उनके प्रारंभिक पड़ोसियों के साथ संपर्क के नुकसान के माध्यम से पुन: प्रोग्राम किया जाता है और पैटर्न गठन के एक नए दौर से गुजरना पड़ता है। ये संस्कृतियां संघनन और पंख प्राइमोर्डिया भी विकसित करती हैं। दिलचस्प बात यह है कि त्वचा के एक्सप्लांट्स और पुनर्संयोजित त्वचा एक्सप्लांट्स में देखी जाने वाली कली गठन के प्रगतिशील प्रसार के विपरीत त्वचा में कलियां एक साथ बनती हैं। यह विधि प्रारंभिक चरण की त्वचा, सेलुलर और आणविक इंटरैक्शन के अवलोकन और हेरफेर की अनुमति देती है। प्रमोटर-रिपोर्टर परख का उपयोग करके संस्कृति में आणविक अभिव्यक्ति का मूल्यांकन किया जा सकता है। ट्रांसजेनिक या नॉकआउट लाइनों के बीच पुनर्गठन त्वचा पैटर्निंग प्रक्रिया में अणुओं की भूमिकाओं का और विश्लेषण करने में मदद कर सकता है। वायरल पारगमन को अलग-अलग मेसेनकाइमल कोशिकाओं में बढ़ाया जाता है और अक्सर एक बढ़ी हुई गड़बड़ी पैदा कर सकता है।

जबकि इन प्रयोगात्मक दृष्टिकोणों में से प्रत्येक जांचकर्ताओं को त्वचा मोर्फोजेनेसिस के दौरान होने वाली सेलुलर और आणविक घटनाओं का पता लगाने में मदद कर सकता है। हम अक्सर इनमें से प्रत्येक दृष्टिकोण का उपयोग करते हैं और देखते हैं कि कौन सा सर्वोत्तम अंतर्दृष्टि प्रदान करता है। निष्कर्षों को तब अन्य संस्कृति स्थितियों के तहत या बरकरार भ्रूण का उपयोग करके आगे का पता लगाया जा सकता है।

इन दृष्टिकोणों की सीमाएं
इन तीन assays के प्रत्येक अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम प्रदान करता है. हालांकि, के रूप में इन assays अलग डिग्री के लिए एक ही गड़बड़ी का जवाब हो सकता है, यह अक्सर सभी तीन assays का उपयोग कर शर्तों परेशान करने के लिए सार्थक है अगर कोई परिवर्तन शुरू में सामना कर रहे हैं. हालांकि त्वचा एक्सप्लांट संस्कृति प्रारंभिक त्वचा पैटर्न गठन और त्वचा उपांग विकास के लिए एक अच्छा मॉडल प्रदान करती है, एक्सप्लांट को केवल ~ 1 सप्ताह के लिए सुसंस्कृत किया जा सकता है। यह बाद में त्वचा उपांग विकास में उनके उपयोग को रोकता है, उदाहरण के लिए, त्वचीय पैपिला गठन और कूप मॉर्फोजेनेसिस की प्रक्रिया हालांकि इन एक्सप्लांट्स को लंबे समय तक संस्कृति के लिए प्रक्रियाओं में सुधार किया जा रहा है। आज तक, पुनर्गठित त्वचा एक्सप्लांट बनाने के शुरुआती समय में कोशिकाएं शिथिल रूप से अपने सब्सट्रेट से जुड़ी होती हैं, जिससे विश्लेषण होता है जो कई वॉश का उपयोग करते हैं, जैसे कि सीटू संकरण, मुश्किल। ये संस्कृतियां अपने सब्सट्रेट को 24 घंटे तक अधिक मजबूती से बांधती हैं, जिस पर पूरे संस्कृति में संघनन बन गए हैं।

एवियन भ्रूण त्वचा त्वचा उपांगों के विकास का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल प्रदान करती है। त्वचा एक्सप्लांट संस्कृतियों को संस्कृति की स्थिति में हेरफेर को सक्षम करने का लाभ होता है जिसमें पूर्व विवो त्वचा अंग संस्कृतियां बढ़ती हैं। यह समय के साथ मिडलाइन से पार्श्व किनारों तक कलियों के प्रसार को देखने के लिए विकास की दीर्घकालिक समय-चूक इमेजिंग को भी सक्षम बनाता है। इसके अलावा, पंख पैटर्न और विकास में विभिन्न घटनाओं का पता लगाने के लिए विभिन्न भ्रूण चरणों का उपयोग करके संस्कृति शुरू की जा सकती है। आवधिक पैटर्न गठन के लिए, त्वचा को ई 6 से शुरू किया जा सकता है और 4 दिनों के लिए सुसंस्कृत किया जा सकता है। पंख कूप आकृति विज्ञान के लिए, संस्कृति E8 पर शुरू की जा सकती है और 4 दिनों के लिए सुसंस्कृत हो सकती है। E6 से पहले चरणों में त्वचा को काटना मुश्किल है। एक्सप्लांट संस्कृतियों के साथ, वैश्विक गड़बड़ी त्वचा संयंत्र संस्कृति माध्यम 8,16,17 के लिए विकास कारक या अवरोधकों को जोड़कर बनाया जा सकता है। स्थानीय रूप से त्वचा को परेशान करना त्वचा के प्रत्यारोपण पर प्रोटीन-लेपित मोती रखकर या जीन अभिव्यक्ति 8,16,17को संशोधित करने के लिए कोशिकाओं को वायरल रूप से ट्रांसड्यूस करके प्राप्त किया जा सकता है। एक्सप्लांट संस्कृतियों इस तरह केकैल्शियम गतिविधियों 6 और ऊतक तनाव18 या बिजली धाराओं12 के रूप में biophysical बलों के आवेदन के रूप में सामूहिक सेल व्यवहार की इमेजिंग की सुविधा. ये विधियां आवधिक अंग पैटर्न को विनियमित करने वाले कारकों में नई अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए महान अवसर प्रदान करती हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास घोषित करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

यह कार्य NIH NIAMS अनुदान R37 AR 060306, R01 AR 047364 और RO1 AR078050 द्वारा समर्थित है। यह काम ताइवान में यूएससी और चीन मेडिकल यूनिवर्सिटी के बीच एक सहयोगी अनुसंधान अनुबंध द्वारा भी समर्थित है। हम कई लैब मॉड्यूल के दौरान इस एवियन स्किन कल्चर प्रोटोकॉल का सफलतापूर्वक परीक्षण करने के लिए USC BISC 480 डेवलपमेंटल बायोलॉजी 2023 क्लास को धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6-well culture dish  Falcon REF 353502 Air-Liquid Interface (ALI) Cultures  
Cell culture inset  Falcon REF 353090. 0.4 µm Transparent PET Membrane
Collagenase Type 1 Worthington Biochemical LS004196
Dulbecco’s modified Eagle’s medium  Corning 10-013-CV 4.5 g/L glucose
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) Sigma-Aldrich E5134
Fetal bovine serum ThermoFisher 16140-071
Glucose Sigma-Aldrich G8270
Hanks’s buffered saline solution Gibco 14170-112 No calcium, no magnesium
Penicillin/streptomycin  Gibco 15-140-122
Pogassium phosphate monobasic (KH2PO4) Sigma-Aldrich P5379
Potassium chloride (KCl) Sigma-Aldrich P9333
Sodium bicarbonate (NaHCO3) Sigma-Aldrich S6014
Sodium chloride (Nacl) EMD  CAS 7647-14-5
Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) Sigma-Aldrich S0751
Trypsin Gibco 27250-042

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References

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कीवर्ड: एवियन त्वचा ऊतक पैटर्निंग organogenesis त्वचा Explant संस्कृति पंख कली विकास 4 डी इमेजिंग सेलुलर व्यवहार आणविक हेरफेर पुनर्योजी चिकित्सा
ऊतक पैटर्निंग और ऑर्गेनोजेनेसिस का अध्ययन करने के लिए एवियन स्किन एक्सप्लांट्स का उपयोग करना
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Jiang, T., Secor, M., Lansford, R., Widelitz, R. B., Chuong, C. M. Using Avian Skin Explants to Study Tissue Patterning and Organogenesis. J. Vis. Exp. (199), e65580, doi:10.3791/65580 (2023).

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