Summary
Hier beschreiben wir Protokolle für drei Arten von embryonalen Hautexplantatkulturen von Vögeln, die zur Untersuchung von Gewebeinteraktionen, 4D-Bildgebungs-Zeitrafferfilmen (3D plus Zeit), globalen oder lokalen Störungen der molekularen Funktion und systembiologischer Charakterisierung verwendet werden können.
Abstract
Die sich entwickelnde Vogelhaut während der Embryogenese ist ein einzigartiges Modell, das wertvolle Einblicke in die Gewebemusterung liefern kann. Im Folgenden werden drei Varianten von Hautexplantatkulturen beschrieben, um verschiedene Aspekte der Hautentwicklung zu untersuchen. Erstens bieten Ex-vivo-Organkulturen und -Manipulationen den Forschern die Möglichkeit, die Entwicklung von Federknospen direkt zu beobachten und zu untersuchen. Die Explantatkultur der Haut kann 7 Tage lang wachsen, was eine direkte Analyse des zellulären Verhaltens und 4D-Bildgebung in Intervallen während dieser Wachstumsperiode ermöglicht. Dies ermöglicht auch physikalische und molekulare Manipulationen der Kulturbedingungen, um die Gewebereaktion sichtbar zu machen. Zum Beispiel können mit Wachstumsfaktoren beschichtete Kügelchen lokal aufgetragen werden, um Veränderungen in der Federmusterung in einem begrenzten Bereich zu induzieren. Alternativ kann die virale Transduktion global in den Nährmedien verabreicht werden, um die Genexpression zu erhöhen oder herunterzuregulieren. Zweitens ermöglicht das Hautrekombinationsprotokoll den Forschern, Gewebeinteraktionen zwischen Epidermis und Mesenchym zu untersuchen, die aus verschiedenen Hautregionen, verschiedenen Lebensstadien oder verschiedenen Arten stammen. Dies bietet die Möglichkeit, das Zeitfenster zu testen, in dem das Epithel in der Lage ist, auf Signale zu reagieren, und seine Fähigkeit, verschiedene Hautanhänge als Reaktion auf Signale aus verschiedenen mesenchymalen Quellen zu bilden. Drittens setzt die Hautrekonstitution mit dissoziierten Hautzellen, die mit intaktem Epithel überlagert sind, die Hautentwicklung zurück und ermöglicht die Untersuchung der anfänglichen Prozesse der periodischen Musterbildung. Dieser Ansatz verbessert auch unsere Fähigkeit, die Genexpression zwischen den dissoziierten Zellen zu manipulieren, bevor das rekonstituierte Hautexplantat erstellt wird. In diesem Artikel werden die drei Kulturprotokolle und beispielhafte Experimente vorgestellt, um ihren Nutzen zu demonstrieren.
Introduction
Die Entwicklung der Haut von Vogelembryonen ist aufgrund der unterschiedlichen Muster und des Zugangs zu Mikrochirurgie und -manipulation ein hervorragendes Modell für die Untersuchung der Mechanismen der Morphogenese 1,2. Die Bewertung zellulärer und molekularer Ereignisse in intaktem Gewebe kann jedoch schwierig sein, da das Vorhandensein von Fremdgewebe mikroskopische Beobachtungen erschweren kann. Darüber hinaus ist die Fähigkeit, die Genexpression zu manipulieren, um ihre Rolle bei der Morphogenese der Haut zu testen, nicht immer eine einfache Aufgabe. Wir stellen fest, dass wir Genfunktionen mittels retroviraler Transduktion mit einer höheren Erfolgsrate unter Verwendung von Hautexplantatmodellen testen können. Hier gehen wir auf die Vorteile von drei Hautexplantatmodellen ein, die entwickelt wurden.
Die embryonale Hautkultur von Vögeln ist ein leistungsfähiges System zur Beurteilung des Zellverhaltens, der Genregulation und der Funktion während der Entwicklung von Hautfederknospen 3,4,5,6. Es ermöglicht die Bewertung der molekularen Mechanismen der Entwicklung von Federknospen durch die globale Zugabe von Wachstumsfaktoren, die in das Kulturmedium eingebracht werden, oder deren lokale Freisetzung aus Wachstumsfaktor-beschichteten Kügelchen. Entwicklungsregulatorische Gene können auch durch virale Gentransduktion intakter oder dominanter negativer Formen für funktionelle Studien manipuliert werden, um ihre Rolle bei spezifischen morphogenetischen Ereignissen zu bewerten 7,8.
Die epithelial-mesenchymale Rekombinationskultur von Vögeln ermöglicht es den Forschern, die Beiträge der einzelnen Hautkomponenten in den frühen Stadien der Hautmorphogenese zu bestimmen. Rawles' Anwendung dieses Ansatzes zeigte, dass Wechselwirkungen zwischen dem Mesenchym und dem Epithel für die Bildung von Hautanhängen unerlässlich sind9. Das Mesenchym kann Kondensationen bilden, und das Epithel wird benötigt, um mesenchymale Kondensationsbildungen zu induzieren und aufrechtzuerhalten2. Später wurde dieser Ansatz verwendet, um zu beurteilen, warum schuppenlose Hühner keine Federn bilden. Es wurde festgestellt, dass der Defekt im Mesenchym10 liegt. Dhouailly führte Studien zur epithelial-mesenchymalen Rekombination von Gewebe an Embryonen verschiedener Spezies durch. Diese Studien lieferten entwicklungs- und evolutionäre Einblicke in die epithelial-mesenchymale Kommunikation, die die Morphogenese der Haut fördert3.
Diese Studie wurde verwendet, um Faktoren, die das Federwachstum steuern, besser zu verstehen. Die Methode verbessert auch die Visualisierung zellulärer und molekularer Ereignisse, die an der Hautmusterung beteiligt sind und während der Initiierung, Entwicklung und Verlängerung der Federn entlang der anterior-posterioren Achse stattfinden. Wenn das Epithel vom Mesenchym getrennt wird und die beiden Komponenten dann wieder kombiniert werden, stellen neue Wechselwirkungen die Hautmusterung wieder her. Dieser Ansatz ermöglicht es uns, mesenchymale induzierende Signale und epitheliale Kompetenzmoleküle zu bewerten, die es der Epidermis ermöglichen, auf die mesenchymalen Signale zu reagieren11. Die anschließende nachgeschaltete molekulare Expression, die für die Entwicklung der Federknospen und die Musterbildung erforderlich ist, kann ebenfalls untersucht werden. Diese Studien haben gezeigt, dass die Position der Knospen durch das Mesenchym gesteuert wird. Die Rotation des Epithels um 90o vor der Rekombination mit dem Mesenchym zeigt, dass die Richtung der Federknospenverlängerung durch das Epithel gesteuert wird. Diese Methode war für uns unerlässlich, um den molekularen Mechanismus zu untersuchen, der die Ausrichtung der Federknospen reguliert12.
Die Rekonstitutionskultur der Vogelhaut, in der das Hautmesenchym in einzelne Zellen dissoziiert wird, bevor es mit hoher Zelldichte plattiert und mit intaktem Epithel überlagert wird, versetzt die Hautzellen in einen primordialen Zustand. Das Explantat organisiert sich dann selbst, um ein neues periodisches Muster zu bilden, das unabhängig von den vorherigen Hinweisen13 ist. Dieses Hautrekonstitutionsmodell kann verwendet werden, um die ersten Prozesse der periodischen Musterbildung von Federn zu untersuchen. Wir haben diesen Ansatz verwendet, um zu untersuchen, wie die Modulation des Verhältnisses von mesenchymalen Zellen zu einem einzelnen Stück Epithel die Größe oder Anzahl der Federknospen beeinflussen kann. Es wurde festgestellt, dass die Anzahl der Knospen zunahm, aber nicht die Größe der Knospen, da das Verhältnis der mesenchymalen Zellen zunahm. Ein weiterer Vorteil dieses Ansatzes besteht darin, dass die mesenchymale zelluläre Virustransduktion eine höhere Effizienz aufweist als unter den beiden anderen Kulturbedingungen und offensichtlichere Phänotypen hervorbringen kann.
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Protocol
1. Explantatkultur aus Hühnerhaut (Abbildung 1)
- Befruchtete Hühnereier in einem befeuchteten Brutkasten bei 38 °C inkubieren und nach Hamburger und Hamilton14 inszenieren.
- Im Stadium 28 (~E5.5) sind der zweite Zeh und die dritte Zehe der Gliedmaße länger als die anderen; Drei Zehen und vier Zehen sind unterschiedlich.
- Bei Stufe 29 (~E6) ist der Flügel am Ellbogen gebeugt; Die zweite Ziffer ist deutlich länger als die anderen.
- Im Stadium 30 (~E6.5) sind zwei Reihen der dorsalen Federknospen zu beiden Seiten des Rückenmarks auf der Höhe des Armes und drei Reihen auf Höhe der Beine sichtbar.
- Auf Stufe 31 (~E7) gibt es ~7 Reihen von Federn auf der Jumbo-Sakral-Ebene.
- Im Stadium 32 sind elf oder mehr Reihen von Federknospen auf Höhe der Beine vorhanden.
- Legen Sie einen Hühnerembryo im Stadium 28-32 in eine 60-mm-Petrischale, die Hanks-gepufferte Kochsalzlösung (HBSS) oder phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) enthält.
- Präparieren Sie die Rückenhaut des Embryos zwischen dem unteren Hals und der Schwanzregion. Verwenden Sie eine Schere, um den Kopf vom Hals zu entfernen. Ziehe vorsichtig an den Knospen der Gliedmaßen, um die Bauchseite des Körpers nach unten zu positionieren, wobei sich die Gliedmaßen nach außen spreizen.
- Machen Sie einen vorderen bis hinteren Schnitt in der Haut entlang der beiden flankierenden Seiten des Embryokörpers mit einer Uhrmacherzange oder einer scharfen Federschere. Achte darauf, den Körper mit einer Pinzette zu stabilisieren, indem du die Knospen der Gliedmaßen in Längsrichtung einklemmst. Schälen Sie die Haut vorsichtig vom Hals bis zum Schweif oder vom Schwanz bis zum Hals mit einer Uhrmacherzange.
- Entfernen Sie vorsichtig das Unterhautgewebe, das an der geschälten Haut haftet, und glätten Sie die Hautränder mit der scharfen Federschere.
- Geben Sie 2 ml/Vertiefung des modifizierten Eagle-Mediums (DMEM) von Dulbecco, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) und Penicillin/Streptomycin-Lösung (verdünnt 1:100), in eine Vertiefung in einer 6-Well-Schale. Nachdem das Medium und die Antibiotika hinzugefügt wurden, legen Sie einen sterilen Gewebekultureinsatz so in die Vertiefung, dass sich das Medium an der Außenseite des Kultureinsatzes befindet.
- Übertragen Sie die Haut mit einem Spatel auf den Kultureinsatz, wobei die Epidermis nach oben und das Mesenchym nach unten auf die Einlegemembran zeigt. Um sicherzustellen, dass die Haut flach und ohne Falten aufliegt, ziehen Sie die Haut auf den Spatel in HBSS. Schieben Sie die Haut mit der Flüssigkeit vom Spatel ab, um die Übertragung der Haut ohne Falten zu erleichtern.
- Entfernen Sie überschüssiges HBSS mit einer 200-μl-Pipette aus dem Kultureinsatz. Lassen Sie eine dünne Schicht HBSS im Kultureinsatz, um das Explantat halbnass zu halten und eine Luft-Flüssig-Grenzfläche zu schaffen.
- Inkubieren Sie die Hautexplantatkulturen bei 37 °C mit 5 % CO2 und 95 % Luft. Wechseln Sie das Medium alle 2 Tage.
HINWEIS: Dieses Verfahren wurde veröffentlicht4. Dieses Kultursystem kann auch mit der Haut anderer Vögel wie Explantatkulturen aus Wachtel- oder Finkenhaut verwendet werden.
2. Epithel-mesenchymale Rekombination von Hühnerhaut (Abbildung 2)
- Befruchtete Hühnereier werden in einem befeuchteten Inkubator bei 38 °C inkubiert und die Embryonen nach Hamburger und Hamilton14 (Abschnitt 1.1) in die Stadien gesetzt.
- Bereiten Sie 2x calcium-magnesiumfreie (CMF) Kochsalzlösung mit 0,25% Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) Puffer vor.
- Stellen Sie 10x CMF-Puffer (NaCl (1,37 M) 80 g, KCl (0,04 M) 3 g, NaH2PO4 (0,004 M) 0,5 g, KH2PO4 (2 M) 0,25 g, NaHCO3 (0,12 M) 10 g, Glukose (0,1 M) 20 g in 1.000 mL destilliertem Wasser her. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,3 ein. Um 100 mL 2x CMF mit 0,25% EDTA-Puffer herzustellen, sollte das EDTA zuerst in 80 mL destilliertem Wasser aufgelöst werden, dann 20 mL 10x CMF-Puffer hinzufügen, um 2x CMF mit 0,25% EDTA-Arbeitslösung herzustellen.
- Die Rückenhaut von Hühnerembryonen im Stadium 30-32 wird wie oben beschrieben (Abschnitt 1.2) in HBSS präpariert und in 2x CMF-Kochsalzlösung mit 0,25% EDTA auf Eis für 15-20 min inkubiert.
- Trennen Sie Epithel und Mesenchym vorsichtig mit einer Uhrmacherzange. Übertragen Sie das getrennte Epithel und Mesenchym in eine saubere Schüssel, die HBSS enthält.
- Kombinieren Sie das Epithel mit dem Mesenchym, indem Sie zuerst das Mesenchym auf eine Petrischale mit HBSS legen und dann das Epithel auf das Mesenchym legen. Platzieren Sie das Epithel entlang der gleichen anterior-posterioren Achse wie das Mesenchym oder drehen Sie das Epithel um 90° von der anterior-posterioren Achse des Mesenchyms, um zu bestimmen, welche Komponente verschiedene Aspekte der Hautmorphogenese reguliert.
- Übertragen Sie die rekombinierten Häute zum Wachstum in Kultureinsätze in 6-Well-Kulturschalen und entfernen Sie überschüssiges HBSS um die rekombinierte Haut.
- Geben Sie 2 ml DMEM-Kulturmedium mit 10 % FBS in die Vertiefung außerhalb des Einsatzes. Platzieren Sie eine dünne Schicht DMEM in der Einsatzkammer, um das Explantat halbnass zu halten und eine Luft-Flüssig-Grenzfläche zu schaffen.
- Die Hautrekombinanten werden bei 37 °C in einem Gemisch aus 5 % CO2 und 95 % Luft inkubiert. Wechseln Sie das Medium alle 2 Tage. Dokumentieren Sie phänotypische Veränderungen in den ersten Hautphasen der Hautentwicklung mittels Zeitrafferfotografie mit einer Kamera, die an einem Präpariermikroskop montiert ist.
HINWEIS: Dieses Verfahren wurde veröffentlicht11.
3. Rekonstitution der Hühnerhaut (Abbildung 3)
- Befruchtete Hühnereier werden in einem befeuchteten Inkubator bei 38 °C inkubiert und die Embryonen nach Hamburger und Hamilton14 (Abschnitt 1.1) in die Stadien gesetzt.
- Präparieren Sie die Rückenhaut von Hühnerembryonen im Stadium 30-33 bei HBSS. Inkubieren Sie die Häute in 2x CMF-Kochsalzlösung mit 0,25% EDTA auf Eis für 15-20 min wie oben beschrieben (Abschnitt 2.3).
- Trennen Sie Epithel und Mesenchym vorsichtig mit einer Uhrmacherzange. Übertragen Sie das getrennte Epithel und Mesenchym auf Eis auf HBSS.
HINWEIS: Achten Sie darauf, die Basalschicht des Epithels nicht zu beschädigen, wenn Sie das Epithel vom Mesenchym trennen. - Das abgetrennte Mesenchym in einem 15-ml-Zentrifugenröhrchen auffangen und mit 0,1%iger Kollagenase/Trypsin-Lösung aus PBS in einem 37 °C warmen Wasserbad für 10-15 min inkubieren.
- Dissoziieren Sie das Hautmesenchym mit einer Pasteurpipette, um eine einzellige Suspension herzustellen. Fügen Sie DMEM mit 10% FBS hinzu, um die Verdauung zu stoppen.
- Pelletieren und zentrifugieren Sie die Zellen bei 233 × g für 5 min. Die Zellen wurden mit Kulturmedium in einer Konzentration von 2 × 107 Zellen/ml resuspendiert.
HINWEIS: In diesem Schritt können die mesenchymalen Zellen auch in virushaltigem Medium für 2-3 h auf Eis zur Gentransduktion resuspendiert werden. - Legen Sie einen Zellkultureinsatz in eine Vertiefung einer 6-Well-Schale. 10 μl von 2 × 107 Zellen/ml mesenchymale Zellen auf den Gewebekultureinsatz geben. Geben Sie 2 ml DMEM-Kulturmedium mit 10 % FBS in die Vertiefung außerhalb des Einsatzes. Inkubieren Sie die plattierten mesenchymalen Zellen bei 37 °C mit einem Inkubator mit 5 % CO2 und 95 % Luft für 1 h, damit sich die Zellen auf der Einlegemembran absetzen können.
- Übertragen Sie das intakte Epithel mit einer 1-ml-Pipette auf das plattierte mesenchymale Tröpfchen, wobei die Epithel-Basalzellschicht den mesenchymalen Zellen zugewandt ist.
HINWEIS: Bei der Übertragung von Epithel auf das mesenchymale Tröpfchen sollten die mesenchymalen Zellen nicht gestört werden. - Glätten Sie das intakte Epithel über dem Mesenchym, um die rekonstituierte Haut explantieren zu lassen. Lassen Sie eine dünne Schicht des Mediums auf dem Einsatz, um die rekonstituierte Haut halbnass zu halten und eine Luft-Flüssig-Grenzfläche zu schaffen. Das rekonstituierte Hautexplantat wird bei 37 °C in einem Inkubator mit 5 % CO2 und 95 % Luft inkubiert. Wechseln Sie das Medium alle 2 Tage.
HINWEIS: Dieses Verfahren wurde veröffentlicht13.
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Representative Results
Explantationskulturen der Haut
Die Entwicklung von Federknospen aus ex vivo Hautorgankulturen kann direkt unter dem Mikroskop beobachtet werden. Unter Verwendung des Hautexplantationskulturmodells der Rückenhaut von Hühnern im Stadium 30 sind die Plakoden entlang der Mittellinie sichtbar. Die morphogenetische Front vermehrt sich dann allmählich lateral in Richtung Hautperipherie mit der Bildung neuer Federprimordien. Diese Federprimordien entwickeln sich nach 2 Tagen Kultur zu kurzen Federknospen und nach 4 Tagen in Kultur zu langen Federknospen (Abbildung 1).
Rekombinationskulturen der Haut
Bei der Hautrekombination verschwinden bei der Rekombination von Epithelien und Mesenchym die ursprünglichen Plakoden. Neue Plakoden erscheinen kurz nach der Rekombination und entwickeln sich nach 2 bzw. 4 Tagen in Kultur zu kurzen Federknospen und langen Federknospen. Wenn das Epithel um 90° relativ zum Mesenchym gedreht wird, wird die Ausrichtung der länglichen Knospen durch das Epithel bestimmt (Abbildung 2).
Kulturen zur Rekonstitution der Haut
Für die Rekonstitution der Haut erscheinen die ex vivo-Organkulturen zunächst homogen, und dann bilden sich nach 1 Tag in Kultur gleichzeitig Hautkondensationen mit gleichmäßigen Abständen. Zu beachten ist, dass die Anzahl der Federknospen von der Anzahl der mesenchymalen Zellen abhängt. Eine niedrigere mesenchymale Anzahl führte dazu, dass weniger Knospen ähnlicher Größe wie dieBildung von 11 Knospen auftraten. Kurze Federknospen bilden sich nach 2-3 Tagen in Kultur und lange Federknospen bilden sich nach 4-5 Tagen in Kultur (Abbildung 3).
Abbildung 4 zeigt zusammenfassende Diagramme der ex vivo Hautorgankultur, der Hautrekombinationsorgankultur und der Hautrekonstitutionsorgankultur.
Abbildung 1: Ex-vivo-Kultur von Hautorganen. Die Haut des Hühnerembryos im Stadium 32 wird in HBSS präpariert und in 6-Well-Kultureinsätzen (T0, zum Zeitpunkt 0) für 2 und 4 Tage kultiviert. Die Federprimordien entwickeln sich nach 2 Tagen Kultur zu kurzen Federknospen und nach 4 Tagen Kultur zu langen Federknospen. Hautplakoden sind durch den weißen Pfeil gekennzeichnet. Beachte, dass die Knospen in der Mittellinie reifer sind als die auf beiden Seitenseiten. Diese Methode wurde von Jiang und Chuong4 modifiziert. Maßstabsleiste = 500 μm. Abkürzung: HBSS = Hank's gepufferte Kochsalzlösung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Ex-vivo-Kultur von Hautrekombinationsorganen. Die Haut des Hühnerembryos im Stadium 32 wird in HBSS präpariert, und Epithel und Mesenchym werden in 2x CMF-Puffer getrennt. Hautepithel und Mesenchym werden mit oder ohne Rotation rekombiniert und für 2 Tage und 4 Tage kultiviert. Die neuen Plakoden entwickeln sich nach 2- und 4-tägiger Kultur zu kurzen und langen Federknospen. Wird das Epithel um 90° relativ zum Mesenchym gedreht, so wird die Ausrichtung der neuen Knospen durch das Epithel12 bestimmt. Diese Methode wurde von Chuong et al.11 modifiziert. Maßstabsleiste = 500 μm. Abkürzung: CMF = Calcium-Magnesium-frei. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Ex-vivo-Organkultur zur Rekonstitution der Haut. Die Haut des Hühnerembryos im Stadium 32 wird präpariert und Epithel und Mesenchym werden in 2x CMF-Puffer getrennt. Das Mesenchym wird durch 0,1% Kollagenase und Trypsin in Einzelzellen dissoziiert und bei hoher Zelldichte auf einem Kultureinsatz pelletiert. Das Hautzellpellet wird mit einem intakten Epithel (T0, zum Zeitpunkt 0) rekonstituiert und für 6 h, 2 Tage und 5 Tage kultiviert. Die Explantate erscheinen zunächst homogen (6 h) und dann bilden sich nach 1 Tag in Kultur gleichzeitig Hautkondensationen mit gleichmäßigen Abständen. Kurze Federknospen bilden sich nach 2-3 Tagen in Kultur und lange Federknospen bilden sich nach 4-5 Tagen in Kultur. Diese Methode wurde von Jiang et al.13 modifiziert. Maßstabsleiste = 500 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Diagramme von ex vivo Hautorgankulturmodellen. Die Haut beginnt bei E6,5 als eine einzige Epithelschicht, die die mesenchymalen Zellen überlagert. Dies ist oben in den drei Explantationsmethoden dargestellt. (A) Ex-vivo-Kultur von Hautorganen. Die Haut wird intakt auf einem Kultureinsatz an der Luft plattiert: Medienschnittstelle bei 37 °C in einem Inkubator mit 5 % CO2 und 95 % Luft. (B) Ex-vivo-Rekombinationsorgankultur der Haut. Das Hautepithel wird vom Mesenchym getrennt und dann rekombiniert, bevor es an der Luft-Medien-Grenzfläche bei 37 °C in einem 5 % CO2 - und 95 % Luft-Inkubator auf den Zellkultureinsatz aufgebracht wird. (C) Ex-vivo-Organkultur zur Rekonstitution der Haut. Das Hautepithel wird vom Mesenchym getrennt. Das Mesenchym wird dann in eine einzellige Suspension dissoziiert und die mesenchymalen Zellen werden in einer Zentrifuge pelletiert. Die mesenchymalen Zellen werden dann in einer Konzentration von 2 × 10,7 Zellen/ml und 10 μl der Suspension resuspendiert, auf den Kultureinsatz aufgebracht und dann mit einem intakten Stück Epidermis überlagert. Die Kultur wird an der Luft: Medienschnittstelle bei 37 °C in einem 5% CO2 und 95% Luftinkubator inkubiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzende Abbildung S1: Transduktion von Mesenchymzellen mit GFP-exprimierenden Viren. Dissoziierte mesenchymale Zellen (2 × 107 Zellen/ml) wurden 3 Stunden lang auf Eis mit >107 infektiösen Einheiten/ml, replikationskompetentem aviärem Sarkomvirus, das das Grün fluoreszierende Protein (GFP) exprimiert, inkubiert. Die mesenchymalen Zellen wurden dann verwendet, um rekonstituierte Hautorgankulturen zu bilden, wie in Protokollabschnitt 3 beschrieben und 24 Stunden später fotografiert. Die Daten zeigen, dass ~40% der mesenchymalen Zellen mit GFP markiert wurden. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Die Geweberekombination bietet einen Assay, um die einzigartigen Beiträge des Epithels und des Mesenchyms zu untersuchen. Bei Hühnern beginnen sich die Federn am Embryonaltag 7 (E7) zu entwickeln, während die Schuppen am E9 beginnen. Wenn das Mesenchym der E9-Schuppe mit dem Federepithel E7 rekombiniert wird, bildet das rekombinierte Gewebe Schuppen, und wenn das Mesenchym der E7-Feder mit dem Epithelfeder der E9-Schuppen rekombiniert wird, werden Federn gebildet11. Diese Studien haben gezeigt, dass das Mesenchym die Musterbildung, den Abstand und die Organidentität steuert. Natürlich muss das Epithel kompetent sein, um die mesenchymalen Signale angemessen empfangen und interpretieren zu können. Kompetenz existiert im Epithel nur für ein kurzes Zeitintervall. Im Gegensatz zu den obigen Ergebnissen bildet das aborale Epithel überraschenderweise Federn, wenn die Mundschleimhaut des Huhns und das aborale E5-Epithel mit dem E8-Rumpfmesenchym rekombiniert werden; Die Mundschleimhaut bildet jedoch mehrere zahnartige Anhänge15. Dies zeigt, dass das Mesenchym des Hautstamms das aborale Epithel anweist, Federn zu bilden, während das orale Epithel nicht die Fähigkeit hat, Federn zu bilden, und nur Zähne bilden kann. Das orale Epithel in dieser Studie wurde möglicherweise bereits bei E5 für die Zahnbildung eingesetzt. In-situ-Hybridisierung , RNAscope und Immunfärbung können verwendet werden, um die molekulare Expression in den rekombinierten Explantaten zu bestätigen und die Identität der gebildeten Gewebe zu überprüfen. Mit diesem Assay können Störungen spezifisch auf das Epithel oder Mesenchym gerichtet werden.
Die Geweberekonstitution versetzt die Zellen im Mesenchym in einen nicht gebundenen Zustand. Die Federhaut von E7-E8 hat begonnen, mesenchymale Kondensationen im Rückentrakt zu bilden, bevor die Haut dissoziiert und das Mesenchym in einzelne Zellen dissoziiert wird. Durch die Markierung von Epithel- oder mesenchymalen Zellen in den primordialen Knospen- oder Interbudenregionen können die Hautzellen innerhalb oder außerhalb der Knospen gefunden werden, unabhängig von ihrer vorherigen Position. Bei geringer mesenchymaler Zelldichte bilden die rekonstituierten Hautexplantate nur wenige normal große Federknospen. Mit zunehmender mesenchymaler Zelldichte nimmt die Anzahl der Knospen zu, bis eine maximale Packungsdichte erreichtist 13. Diese Daten deuten darauf hin, dass die Zellen durch den Verlust des Kontakts zu ihren ursprünglichen Nachbarn umprogrammiert werden und eine neue Runde der Musterbildung durchlaufen. Diese Kulturen entwickeln auch Kondensationen und Federprimordien. Interessanterweise bilden sich die Knospen gleichzeitig auf der Haut, im Gegensatz zur fortschreitenden Vermehrung der Knospenbildung, die bei Hautexplantaten und rekombinierten Hautexplantaten zu beobachten ist. Diese Methode ermöglicht die Beobachtung und Manipulation von zellulären und molekularen Wechselwirkungen der Haut im Frühstadium. Die molekulare Expression kann in Kultur mit Promotor-Reporter-Assays bestimmt werden. Die Rekonstitution zwischen transgenen oder Knockout-Linien kann helfen, die Rolle von Molekülen im Prozess der Hautmusterung weiter zu analysieren. Die virale Transduktion ist in den dissoziierten mesenchymalen Zellen verstärkt und kann oft zu einer erhöhten Störung führen.
Jeder dieser experimentellen Ansätze kann den Forschern helfen, zelluläre und molekulare Ereignisse zu untersuchen, die während der Morphogenese der Haut stattfinden. Wir verwenden häufig jeden dieser Ansätze und sehen, welcher die besten Erkenntnisse liefert. Die Ergebnisse können dann unter anderen Kulturbedingungen oder mit intakten Embryonen weiter erforscht werden.
Grenzen dieser Ansätze
Jeder dieser drei Assays liefert hochgradig reproduzierbare Ergebnisse. Da diese Assays jedoch unterschiedlich stark auf die gleiche Störung reagieren können, lohnt es sich oft, die Bedingungen mit allen drei Assays zu stören, wenn zunächst keine Veränderungen festgestellt werden. Obwohl die Hautexplantatkultur ein gutes Modell für die frühe Bildung von Hautmustern und die Entwicklung von Hautanhangsgebilden darstellt, kann das Explantat nur ~1 Woche lang kultiviert werden. Dies schließt ihre Verwendung in der späteren Entwicklung der Hautanhange aus, z. B. bei der Bildung der dermalen Papille und der Follikelmorphogenese, obwohl die Verfahren verbessert werden, um diese Explantate länger zu kultivieren. Bisher sind die Zellen zu Beginn der Herstellung rekonstituierter Hautexplantate lose an ihre Substrate gebunden, was Analysen, die mehrere Waschgänge erfordern, wie z. B. die In-situ-Hybridisierung , erschwert. Diese Kulturen binden ihre Substrate nach 24 h fester, wenn sich in der gesamten Kultur Kondenswasser gebildet hat.
Die embryonale Haut von Vögeln ist ein hervorragendes Modell, um die Entwicklung der Hautanhangsgebilde zu untersuchen. Hautexplantatkulturen haben den Vorteil, dass sie die Manipulation der Kulturbedingungen ermöglichen, unter denen die ex vivo Hautorgankulturen wachsen. Es ermöglicht auch eine langfristige Zeitraffer-Bildgebung der Entwicklung, um die Ausbreitung der Knospen von der Mittellinie bis zu den seitlichen Rändern im Laufe der Zeit zu sehen. Darüber hinaus kann die Kultur in verschiedenen Embryonalstadien gestartet werden, um verschiedene Ereignisse in der Federmusterung und im Federwachstum zu untersuchen. Für die periodische Musterbildung kann die Haut ab E6 kultiviert und 4 Tage lang kultiviert werden. Für die Morphogenese der Federfollikel kann die Kultur bei E8 begonnen und 4 Tage lang kultiviert werden. Es ist schwierig, die Haut in Stadien vor E6 zu präparieren. Bei Explantatkulturen können globale Störungen durch Zugabe von Wachstumsfaktoren oder Inhibitoren zum Explantatkulturmedium der Haut erzeugt werden 8,16,17. Eine lokale Störung der Haut kann erreicht werden, indem proteinbeschichtete Kügelchen auf das Hautexplantat aufgebracht oder Zellen viral transduziert werden, um die Genexpression zu modulieren 8,16,17. Explantatkulturen erleichtern die Abbildung des kollektiven Zellverhaltens wie z. B. der Kalziumaktivität6 und die Anwendung biophysikalischer Kräfte wie Gewebespannung18 oder elektrischer Ströme12. Diese Methoden bieten große Chancen, neue Einblicke in die Faktoren zu gewinnen, die die periodische Organmusterung regulieren.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte anzugeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wird durch die NIH-NIAMS-Zuschüsse R37 AR 060306, R01 AR 047364 und RO1 AR078050 unterstützt. Die Arbeit wird auch durch einen gemeinsamen Forschungsvertrag zwischen der USC und der China Medical University in Taiwan unterstützt. Wir danken der Klasse USC BISC 480 Developmental Biology 2023 für die erfolgreiche Erprobung dieses Vogelhautkulturprotokolls in mehreren Labormodulen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well culture dish | Falcon | REF 353502 | Air-Liquid Interface (ALI) Cultures |
| Cell culture inset | Falcon | REF 353090. | 0.4 µm Transparent PET Membrane |
| Collagenase Type 1 | Worthington Biochemical | LS004196 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Corning | 10-013-CV | 4.5 g/L glucose |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher | 16140-071 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Hanks’s buffered saline solution | Gibco | 14170-112 | No calcium, no magnesium |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15-140-122 | |
| Pogassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5379 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Sodium chloride (Nacl) | EMD | CAS 7647-14-5 | |
| Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) | Sigma-Aldrich | S0751 | |
| Trypsin | Gibco | 27250-042 |
References
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