Summary
ここでは、組織相互作用、4Dイメージング、タイムラプス動画(3Dプラス時間)、分子機能のグローバルまたはローカル摂動、およびシステム生物学の特性評価を調べるために使用できる3種類の鳥類胚性皮膚外植片培養のプロトコルについて説明します。
Abstract
胚発生中の鳥類の皮膚の発達は、組織のパターン形成に関する貴重な洞察を提供できるユニークなモデルです。ここでは、皮膚の発達のさまざまな側面を調べるための皮膚外植片培養の3つのバリエーションについて説明します。まず、 生体外 臓器の培養と操作により、研究者は羽芽の発達を直接観察し研究する機会を得ることができます。皮膚外植片培養は7日間成長するため、この成長期間中、細胞の挙動を直接分析し、間隔を空けて4Dイメージングを行うことができます。これにより、培養条件の物理的および分子的な操作が可能になり、組織の応答を視覚化することもできます。例えば、成長因子でコーティングされたビーズを局所的に適用して、限られた領域での羽毛パターンの変化を誘導することができます。あるいは、ウイルス形質導入を培地でグローバルに導入し、遺伝子発現をアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションすることもできます。第二に、皮膚組換えプロトコルにより、研究者は、異なる皮膚領域、異なるライフステージ、または異なる種に由来する表皮と間葉との間の組織相互作用を調査することができます。これにより、上皮が信号に応答する能力を持つ時間枠と、さまざまな間葉系源からの信号に応答してさまざまな皮膚付属器を形成する能力をテストする機会が得られます。第三に、解離した真皮細胞に無傷の上皮を重ねて皮膚を再構成すると、皮膚の発達がリセットされ、周期的なパターン形成の初期過程の研究が可能になります。このアプローチは、再構成された皮膚外植片を作成する前に、解離した細胞間の遺伝子発現を操作する能力も強化します。この論文では、3つの培養プロトコルと、その有用性を実証するための例示的な実験を提供します。
Introduction
鳥類の胚の皮膚発生は、明確なパターンとマイクロサージェリーおよび操作へのアクセスのしやすさから、形態形成のメカニズムを研究するための優れたモデルです1,2。しかし、無傷の組織における細胞イベントや分子イベントの評価は、外部組織の存在が顕微鏡観察を複雑にする可能性があるため、困難な場合があります。さらに、遺伝子発現を操作して皮膚の形態形成における遺伝子の役割を検証する能力は、必ずしも簡単な作業ではありません。私たちは、レトロウイルス形質導入を使用して遺伝子機能をテストでき、皮膚外植片モデルを使用してより高い成功率でテストできることを発見しました。ここでは、開発された3つのスキンエクスプラントモデルの利点について説明します。
鳥類胚性皮膚培養は、皮膚の羽芽発生中の細胞の挙動、遺伝子調節、および機能を評価するための強力なシステムです3,4,5,6。これにより、培地に配置された成長因子の全球的な添加または成長因子でコーティングされたビーズからの局所的な放出を通じて、羽芽発生の分子メカニズムの評価が可能になります。発生制御遺伝子は、特定の形態形成イベントにおけるそれらの役割を評価する機能研究のために、無傷またはドミナントネガティブ型のウイルス遺伝子導入を使用して操作することもできます7,8。
鳥類の上皮間葉組換え培養 により、研究者は皮膚形態形成の初期段階における各皮膚成分の寄与を判断できます。Rawlesによるこのアプローチの使用により、間葉と上皮との間の相互作用が皮膚付属器の形成に不可欠であることが明らかになった9。間葉は凝縮を形成する可能性があり、上皮は間葉系凝縮形成を誘導および維持するために必要です2。その後、このアプローチは、 スケールレス ニワトリが羽毛を形成できない理由を評価するために使用されました。この欠陥は間葉10にあることが発見されました。Dhouaillyは、異なる種の胚で組織上皮間葉系組換え研究を実施しました。これらの研究は、皮膚の形態形成を促進する上皮間葉系コミュニケーションに関する発生的および進化的洞察を提供しました3。
この研究は、羽毛の成長を制御する要因をよりよく理解するために使用されました。また、この手法は、羽毛の開始、発生、および前後軸に沿った伸長中に起こる皮膚のパターン形成に関与する細胞および分子イベントの可視化を改善します。上皮が間葉から分離され、2つの成分が再結合されると、新しい相互作用が皮膚のパターンを再確立します。このアプローチにより、間葉系誘導シグナルと、表皮が間葉系シグナルに応答することを可能にする上皮能力分子を評価することができる11。また、羽芽の発達やパターン形成に必要なその後の下流の分子発現も調べることができます。これらの研究により、芽の位置は間葉によって制御されていることが確立されました。間葉と組換える前の上皮90° の回転は、羽芽の伸びの方向が上皮によって制御されていることを示しています。この方法は、羽芽の向きを制御する分子機構を研究するために不可欠でした12。
鳥類の皮膚再構成培養は、皮膚間葉を解離させてから高細胞密度でプレーティングし、無傷の上皮で覆うもので、真皮細胞を原始状態にリセットします。その後、外植片は自己組織化して、前の手がかり13から独立した新しい周期パターンを形成する。この皮膚再構成モデルは、羽毛の周期的パターン形成の初期過程を研究するために使用できます。このアプローチを使用して、間葉系細胞と1つの上皮細胞の比率を調節することが、羽芽のサイズまたは数にどのように影響するかを調査しました。芽の数は増加することがわかりましたが、間葉系細胞の比率が増加するにつれて芽のサイズは増加しないことがわかりました。このアプローチのもう一つの利点は、間葉系細胞のウイルス形質導入が他の2つの培養条件よりも高い効率を示し、より明白な表現型を産生できることです。
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Protocol
1. 鶏皮外植片培養(図1)
- 受精した鶏の卵を加湿インキュベーターで38°Cでインキュベートし、Hamburger and Hamilton14に従ってステージングします。
- ステージ 28 (~E5.5) では、四肢の 2 番目の指と 3 番目の指は他の指よりも長くなります。3本の数字と4本の足の指は区別されます。
- ステージ 29 (~E6) では、翼は肘で曲がります。2 桁目は他の桁よりも明らかに長いです。
- ステージ30(~E6.5)では、上腕レベルでは脊髄の両側に2列の背側羽芽列が見え、脚の高さでは3列が見られます。
- ステージ31(~E7)では、ジャンボ仙骨レベルに~7列の羽があります。
- ステージ32では、脚の高さに11列以上の羽芽が存在します。
- ステージ28-32のニワトリ胚を、ハンクス緩衝生理食塩水(HBSS)またはリン酸緩衝生理食塩水(PBS)が入った60mmのシャーレに入れます。
- 首の下から尾の領域まで胚の背側の皮膚を解剖します。はさみを使って首から頭を取り除きます。手足のつぼみをそっと引っ張って、付属肢を外側に広げて体の腹側を下向きに配置します。
- 時計職人の鉗子または鋭利なスプリングハサミを使用して、胚体の両側に沿って皮膚の前方から後方に切開を行います。手足の芽を縦につまむことにより、一対の鉗子で体を安定させるようにしてください。時計職人の鉗子を使用して、首から尾の部分まで、または尾から首にかけて皮膚をやさしく剥がします。
- 剥がした皮膚に付着したままの皮下組織をやさしく取り除き、鋭利なスプリングハサミで皮膚のエッジをなめらかにします。
- 10%ウシ胎児血清(FBS)とペニシリン/ストレプトマイシン溶液(1:100に希釈)を添加したダルベッコの改変イーグルス培地(DMEM)を2 mL/ウェルで6ウェル皿のウェルに加えます。培地と抗生物質を添加したら、培地が培養インサートの外側にくるように、ウェル内に無菌組織培養インサートを置きます。
- 表皮を上にし、間葉をインサートメンブレン上に向け、へらで皮膚を培養インサートに移します。皮膚がしわなく平らになるように、HBSSのへらに皮膚を引っ張ります。液体で皮膚をへらから滑り込ませて、折りたたむことなく皮膚の移動を容易にします。
- 200 μLのピペットで培養インサートから余分なHBSSを取り除きます。培養インサートの内側にHBSSの薄層を残して、外植片を半湿らせて気液界面を提供します。
- 皮膚外植片培養物を37°Cで5%のCO2 と95%の空気を使用してインキュベートします。2日ごとに媒体を交換してください。
注:この手順は公開されています4。この培養システムは、ウズラやフィンチの皮膚外植片培養などの他の鳥の皮膚にも使用できます。
2. ニワトリの皮上皮-間葉系組換え(図2)
- 受精した鶏の卵を38°Cの加湿インキュベーターでインキュベートし、Hamburger and Hamilton14 (セクション1.1)に従って胚をステージングします。
- 2倍カルシウム-マグネシウムフリー(CMF)生理食塩水と0.25%エチレンジアミン四酢酸(EDTA)緩衝液を調製します。
- 10x CMFバッファー(NaCl(1.37 M)80 g、KCl(0.04 M)3 g、NaH2PO4(0.004 M)0.5 g、KH2PO4(2 M)0.25 g、NaHCO3 (0.12 M)10 g、グルコース(0.1 M)20 gを1,000 mLの蒸留水で調製します。pHを7.3に調整します。0.25% EDTAバッファーを含む2x CMF100 mLを調製するには、まずEDTAを80 mLの蒸留水に溶解し、次に10x CMFバッファー20 mLを添加して、0.25% EDTAワーキング溶液を含む2x CMFを調製する必要があります。
- 上記のように、ステージ30-32のニワトリ胚背側皮をHBSSで解剖し(セクション1.2)、氷上で0.25%EDTAを含む2x CMF生理食塩水で15-20分間インキュベートします。
- 時計職人の鉗子を使用して、上皮と間葉を慎重に分離します。分離した上皮と間葉をHBSSを含む清潔な皿に移します。
- 最初にHBSSを含むシャーレに間葉を配置し、次に上皮を間葉の上に置いて、上皮を間葉と再結合します。上皮を間葉と同じ前後軸に沿って配置するか、上皮を間葉の前後軸から90° 回転させて、どの成分が皮膚形態形成のさまざまな側面を調節するかを決定します。
- 再構築した皮膚を6ウェル培養皿の培養インサートに移して成長させ、再構築した皮膚の周りの余分なHBSSを取り除きます。
- 10% FBSを含む2 mLのDMEM培地をインサートの外側のウェルに入れます。インサートチャンバー内にDMEMの薄層を配置して、外植片を半湿らせて気液界面を提供します。
- 皮膚組換え体を37°Cで5%CO2 と95%の空気の混合物中でインキュベートします。2日ごとに媒体を交換してください。解剖顕微鏡に取り付けられたカメラによるタイムラプス撮影を使用して、皮膚発達の初期段階における表現型の変化を記録します。
注:この手順は公開されています11。
3. 鶏皮の再構成(図3)
- 受精した鶏の卵を38°Cの加湿インキュベーターでインキュベートし、Hamburger and Hamilton14 (セクション1.1)に従って胚をステージングします。
- HBSSでステージ30-33のニワトリ胚の背側の皮を解剖します。上記のように、0.25% EDTAを含む2x CMF生理食塩水でスキンを氷上で15〜20分間インキュベートします(セクション2.3)。
- 時計職人の鉗子を使用して、上皮と間葉を慎重に分離します。分離した上皮と間葉を氷上のHBSSに移します。
注:上皮を間葉から分離するときは、上皮の基底層を傷つけないように注意してください。 - 分離した間葉を15 mLの遠心チューブに集め、PBSで作製した0.1%コラゲナーゼ/トリプシン溶液と37°Cの水浴で10〜15分間インキュベートします。
- 皮膚間葉をパスツールピペットで解離し、単一細胞懸濁液を作製します。10% FBSを含むDMEMを添加して消化を停止します。
- 細胞をペレット化し、233 × g で5分間遠心分離します。細胞を2×107 細胞/mLの濃度の培地で再懸濁しました。
注:このステップでは、間葉系細胞を遺伝子導入のために氷上で2〜3時間ウイルス含有培地に再懸濁することもできます。 - 細胞培養インサートを6ウェルディッシュの1ウェルに入れます。2 × 107 細胞/mL間葉系細胞10 μLを組織培養インサートに滴下します。10% FBSを含む2 mLのDMEM培地をインサートの外側のウェルに置きます。5% CO2 および95%エアインキュベーターを使用して、めっきした間葉系細胞を37°Cで1時間インキュベートし、細胞がインサートメンブレン上に沈殿するまで待ちます。
- 1mLピペットを使用して、上皮基底細胞層を間葉系細胞に向け、無傷の上皮をめっきした間葉系液滴の上に移します。
注:上皮を間葉系液滴に移すとき、間葉系細胞を乱さないでください。 - 無傷の上皮を間葉の上に平らにして、再構成された皮膚の外植片を作ります。インサート上に培地の薄層を残して、再構成された皮膚外植片を半湿らせて気液界面を提供します。再構成した皮膚外植片を37°Cで5%CO2 および95%空気インキュベーターでインキュベートします。2日ごとに媒体を交換してください。
注:この手順は公開されています13。
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Representative Results
皮膚外植片培養
ex vivo皮膚器官培養物からの羽芽の発達は、顕微鏡下で直接観察できます。ニワトリのステージ30の背側の皮膚の皮膚外植片培養モデルを使用すると、プラコードは正中線に沿って見えます。その後、形態形成前線は徐々に皮膚周辺に向かって横方向に伝播し、新しい羽毛原基が形成されます。これらの羽毛原基は、培養2日後に短い羽芽に成長し、培養4日後には長い羽芽に成長します(図1)。
皮膚組換え培養
皮膚の組換えでは、上皮と間葉が組み換えられると、元のプラコードが消えます。新しいプラコードは、組換えの直後に現れ、培養で2日後と4日後にそれぞれ短い羽芽と長い羽芽を形成するように発達します。上皮が間葉に対して90°回転すると、伸びる芽の向きは上皮によって決定されます(図2)。
皮膚再構成文化
皮膚の再構成では、 ex vivo 臓器培養は最初は均一に見えますが、培養1日後には均一な間隔で真皮の凝縮が同時に形成されます。羽芽の数は間葉系細胞の数に依存することに注意すべきです。間葉系の数が少ないほど、同程度の大きさの芽が少なくなり、11を形成するようになった。短い羽芽は培養で2〜3日後に形成され、長い羽芽は培養で4〜5日後に形成されます(図3)。
図4は、 ex vivo 皮膚臓器培養、皮膚組換え臓器培養、皮膚再構成器官培養の要約図です。
図1: ex vivo 皮膚器官培養。 ステージ32のニワトリ胚皮をHBSSで解剖し、6ウェル培養インサート(T0、時間0)で2日間および4日間培養します。羽の原基は、培養で2日後に短い羽芽に成長し、培養で4日後に長い羽芽に成長します。真皮プラコードは白い矢印で示されます。正中線のつぼみは、両側のつぼみよりも成熟していることに注意してください。この方法は、Jiang and Chuong4から変更されています。スケールバー = 500 μm。略語:HBSS =ハンクの緩衝生理食塩水。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2: Ex vivo 皮膚組換え臓器培養。 ステージ32のニワトリ胚の皮をHBSSで解剖し、上皮と間葉系を2x CMFバッファーで分離します。皮膚上皮と間葉を回転の有無にかかわらず組み換え、2日間と4日間培養します。新しいプラコードは、培養で2日と4日後に短い羽芽と長い羽芽に成長します。上皮が間葉に対して90°回転する場合、新しい芽の向きは上皮12によって決定される。この方法は、Chuong et al.11から変更されています。スケールバー = 500 μm。略語:CMF = カルシウム-マグネシウムフリー。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3: Ex vivo 皮膚再構成器官培養。 ステージ32のニワトリ胚の皮膚を解剖し、上皮と間葉を2x CMFバッファーで分離します。間葉は、0.1%コラゲナーゼとトリプシンによって単一細胞に解離され、培養インサート上で高い細胞密度でペレット化されます。真皮細胞ペレットを無傷の上皮(T0、時間0)で再構成し、6時間、2日、および5日間培養します。外植片は最初は均一に見え(6時間)、培養1日後には均一な間隔で真皮の凝縮が同時に形成されます。短い羽のつぼみは、培養で2〜3日後に形成され、長い羽のつぼみは、培養で4〜5日後に形成されます。この方法は、Jiang et al.13から変更されています。スケールバー = 500 μm. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4: ex vivo 皮膚器官培養モデルの図。 皮膚は、間葉系細胞を覆う上皮の単層としてE6.5で開始されます。これは、3つの外植片法の上部に描かれています。(A) 生体外 皮膚器官培養。皮膚は、5% CO2 および95%の空気インキュベーターで37°Cの空気:培地界面の培養インサートの上にそのまま播種されます。(B)Ex vivo 皮膚組換え器官培養。皮膚上皮は間葉から分離され、その後、5% CO2 および95%空気インキュベーター内の37°Cの空気:培地界面で細胞培養インサートにプレーティングする前に再結合されます。(C) Ex vivo 皮膚再構成器官培養。皮膚上皮は間葉から分離されています。次に、間葉を単一細胞懸濁液に解離し、間葉系細胞を遠心分離機でペレット化します。次に、間葉系細胞を2×107 細胞/mLおよび10μLの懸濁液の濃度で再懸濁し、培養インサートに置き、無傷の表皮片で覆います。培養物は、5%CO2 および95%空気インキュベーターで37°Cの空気:培地界面でインキュベートされます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
補足図S1:GFP発現ウイルスによる間葉細胞の形質導入。 解離した間葉系細胞(2 × 107 細胞/mL)を、緑色蛍光タンパク質(GFP)を発現する>107 感染性ユニット/mLの複製能力のある鳥肉腫ウイルスと氷上で3時間インキュベートしました。次いで、間葉系細胞を使用して、上記のプロトコルセクション3に記載されているように再構成された皮膚器官培養物を形成し、24時間後に写真を撮りました。データは、間葉系細胞の~40%がGFPで標識されたことを示しています。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
組織組換えは、上皮と間葉のユニークな寄与を探求するためのアッセイを提供します。ニワトリでは、羽毛は胚の7日目(E7)に発達し始め、鱗はE9から始まります。E9スケール間葉がE7羽毛上皮と再結合されると、再結合された組織は鱗屑を形成し、E7フェザー間葉がE9スケール上皮と再結合されると、羽毛が形成される11。これらの研究は、間葉がパターン形成、間隔、および器官の同一性を制御することを実証しています。もちろん、上皮は間葉系信号を適切に受信して解釈できる能力がなければなりません。能力は上皮に短時間しか存在しません。上記の結果とは対照的に、驚くべきことに、ニワトリの口腔粘膜と口腔E5上皮がE8体幹間葉と再結合されると、口腔上皮は羽を形成します。しかし、口腔粘膜は複数の歯のような付属器を形成している15。これは、皮膚の体幹間葉が口腔上皮に羽毛を作るように指示する一方で、口腔上皮には羽毛を作る能力がなく、歯を作ることしかできないことを示しています。この研究の口腔上皮は、E5ですでに歯の形成にコミットされている可能性があります。 In situ ハイブリダイゼーション、RNAscope、および免疫染色を使用して、組換え外植片の分子発現を確認し、形成する組織の同一性を確認できます。このアッセイを使用すると、摂動を上皮または間葉に特異的に向けることができます。
組織再構成は、間葉内の細胞を非コミット状態にリセットします。E7-E8羽毛の皮膚は、皮膚が解離し、間葉が単一細胞に解離する前に、背側路で間葉系凝縮を形成し始めています。原芽または芽間領域の上皮細胞または間葉系細胞を標識することにより、真皮細胞は、以前の位置に関係なく芽の内側または外側に見つけることができます。間葉系細胞密度が低い場合、再構成された皮膚外植片は、通常サイズの羽芽をほとんど形成しません。間葉系細胞密度が増加するにつれて、芽の数は増加し、最大充填密度13が達成される。これらのデータは、細胞が最初の隣接細胞との接触の喪失を通じて再プログラムされ、新たなパターン形成を受けることを示しています。これらの文化はまた、凝縮と羽毛の原基を発達させます。興味深いことに、芽は皮膚全体で同時に形成されますが、皮膚の外植片や組み換えの皮膚外植片に見られる芽形成の進行性伝播とは対照的です。この方法により、初期段階の皮膚細胞および分子相互作用の観察と操作が可能になります。分子発現は、プロモーターレポーターアッセイを使用して培養で評価できます。トランスジェニックラインまたはノックアウトライン間の再構成は、皮膚のパターン形成プロセスにおける分子の役割をさらに解析するのに役立ちます。ウイルス形質導入は、解離した間葉系細胞で増強され、しばしば摂動の増加を引き起こす可能性があります。
これらの実験的アプローチはそれぞれ、研究者が皮膚の形態形成中に起こる細胞および分子のイベントを調査するのに役立ちます。私たちはこれらのアプローチを頻繁に使用し、どれが最良の洞察を提供するかを確認します。その後、他の培養条件下で、または無傷の胚を使用して、調査結果をさらに調査することができます。
これらのアプローチの制限事項
これら3つのアッセイはそれぞれ、再現性の高い結果を提供します。ただし、これらのアッセイは同じ摂動に対して異なる程度で応答する可能性があるため、最初に変化が検出されない場合は、3つのアッセイすべてを使用して条件を摂動する価値があることがよくあります。皮膚外植片の培養は、初期の皮膚パターン形成と皮膚付属器の発達に適したモデルを提供しますが、外植片は~1週間しか培養できません。これは、後の皮膚付属器の発達、例えば、真皮乳頭形成および卵胞形態形成のプロセスにおけるそれらの使用を排除するが、これらの外植片をより長く培養するための手順は改善されている。これまで、再構成した皮膚外植片を作製した初期の段階では、細胞はそれらの基質にゆるく付着しているため、 in situ ハイブリダイゼーションなど、いくつかの洗浄を使用する分析は困難でした。これらの培養物は、培養物全体に凝縮が形成される24時間までに、基質をよりしっかりと結合します。
鳥類の胚性皮膚は、皮膚付属器の発達を研究するための優れたモデルを提供します。皮膚外植片培養物は、ex vivo皮膚器官培養物が増殖する培養条件の操作を可能にするという利点を有する。また、開発の長期的なタイムラプスイメージングを可能にし、正中線から横方向のエッジへの芽の伝播を経時的に確認することができます。さらに、培養は、羽毛のパターン形成と成長のさまざまなイベントを探索するために、さまざまな胚段階を使用して開始できます。周期的なパターン形成のために、皮膚をE6から始めて4日間培養することができます。羽毛卵胞の形態形成については、E8で培養を開始し、4日間培養することができます。E6より前の段階で皮膚を解剖することは困難です。外植片培養では、成長因子または阻害剤を皮膚外植片培養培地8,16,17に添加することにより、全球的な摂動を行うことができる。局所的に皮膚を攪乱することは、タンパク質被覆ビーズを皮膚外植片上に配置するか、または細胞をウイルス的に形質導入して遺伝子発現を調節することによって達成することができる8,16,17。外植片培養は、カルシウム活性6などの集団細胞挙動のイメージングと、組織張力18または電流12などの生物物理学的力の適用を容易にする。これらの方法は、周期的な臓器パターン形成を調節する要因について新たな洞察を提供する絶好の機会を提供します。
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Disclosures
著者は、宣言する利益相反を持っていません。
Acknowledgments
この研究は、NIH NIAMS grant R37 AR 060306、R01 AR 047364、および RO1 AR078050 によってサポートされています。この研究は、USCと台湾の中国医科大学との間の共同研究契約によってもサポートされています。USC BISC 480 Developmental Biology 2023 クラスが、いくつかのラボモジュールでこの鳥類皮膚培養プロトコルのテストに成功してくれたことに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well culture dish | Falcon | REF 353502 | Air-Liquid Interface (ALI) Cultures |
| Cell culture inset | Falcon | REF 353090. | 0.4 µm Transparent PET Membrane |
| Collagenase Type 1 | Worthington Biochemical | LS004196 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Corning | 10-013-CV | 4.5 g/L glucose |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher | 16140-071 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Hanks’s buffered saline solution | Gibco | 14170-112 | No calcium, no magnesium |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15-140-122 | |
| Pogassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5379 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Sodium chloride (Nacl) | EMD | CAS 7647-14-5 | |
| Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) | Sigma-Aldrich | S0751 | |
| Trypsin | Gibco | 27250-042 |
References
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