Summary
Her beskriver vi protokoller for tre typer fugleembryonale hudeksplanteringskulturer, der kan bruges til at undersøge vævsinteraktioner, 4D-billeddannelse timelapse-film (3D plus tid), global eller lokal forstyrrelse af molekylær funktion og systembiologisk karakterisering.
Abstract
Den udviklende fuglehud under embryogenese er en unik model, der kan give værdifuld indsigt i vævsmønstre. Her beskrives tre variationer af hudeksplantationskulturer for at undersøge forskellige aspekter af hudens udvikling. For det første giver ex vivo organkulturer og manipulationer forskere muligheder for at observere og studere udviklingen af fjerknopper direkte. Hudeksplanteringskultur kan vokse i 7 dage, hvilket muliggør direkte analyse af cellulær adfærd og 4D-billeddannelse med intervaller i denne vækstperiode. Dette giver også mulighed for fysiske og molekylære manipulationer af dyrkningsforhold for at visualisere vævsrespons. For eksempel kan vækstfaktorbelagte perler påføres lokalt for at fremkalde ændringer i fjermønster i et begrænset område. Alternativt kan viral transduktion leveres globalt i kulturmediet for at op- eller nedregulere genekspression. For det andet giver hudrekombinationsprotokollen forskere mulighed for at undersøge vævsinteraktioner mellem epidermis og mesenkym, der stammer fra forskellige hudregioner, forskellige livsstadier eller forskellige arter. Dette giver mulighed for at teste det tidsvindue, hvor epitelet er kompetent til at reagere på signaler og dets evne til at danne forskellige hudvedhæng som reaktion på signaler fra forskellige mesenkymale kilder. For det tredje nulstiller hudrekonstitution ved hjælp af dissocierede hudceller overlejret med intakt epitel hudens udvikling og muliggør undersøgelse af de indledende processer med periodisk mønster. Denne tilgang forbedrer også vores evne til at manipulere genekspression blandt de dissocierede celler, før vi skaber den rekonstituerede hudeksplant. Denne artikel giver de tre kulturprotokoller og eksemplariske eksperimenter for at demonstrere deres nytte.
Introduction
Udvikling af fugleembryons hud er en fremragende model til at studere mekanismerne for morfogenese på grund af de forskellige mønstre og tilgængeligheden til mikrokirurgi og manipulation 1,2. Det kan dog være vanskeligt at evaluere cellulære og molekylære begivenheder i intakt væv, fordi tilstedeværelsen af fremmede væv kan komplicere mikroskopiske observationer. Desuden er evnen til at manipulere genekspression for at teste deres rolle i hudens morfogenese ikke altid en simpel opgave. Vi finder, at vi kan teste genfunktioner ved hjælp af retroviral transduktion med en højere succesrate ved hjælp af hudeksplantationsmodeller. Her diskuterer vi fordelene ved tre hudeksplanteringsmodeller, der er blevet udviklet.
Fugleembryonal hudkultur er et kraftfuldt system til at vurdere celleadfærd, genregulering og funktion under udvikling af hudfjerknopper 3,4,5,6. Det giver mulighed for evaluering af de molekylære mekanismer for fjerknopudvikling gennem global tilsætning af vækstfaktorer placeret i kulturmediet eller deres lokale frigivelse fra vækstfaktorbelagte perler. Udviklingsregulatoriske gener kan også manipuleres ved hjælp af viral gentransduktion af intakte eller dominerende negative former til funktionelle undersøgelser, der evaluerer deres roller i specifikke morfogenetiske begivenheder 7,8.
Fugleepitel-mesenkymal rekombinationskultur gør det muligt for efterforskere at bestemme bidragene fra hver hudkomponent i de tidlige stadier af hudens morfogenese. Rawles' brug af denne tilgang afslørede, at interaktioner mellem mesenkymet og epitelet er afgørende for dannelsen af hudvedhæng9. Mesenkymet kan danne kondensationer, og epitelet er nødvendigt for at inducere og opretholde mesenkymale kondensationsformationer2. Senere blev denne tilgang brugt til at vurdere, hvorfor skælløse kyllinger ikke danner fjer. Defekten blev opdaget at være i mesenkym10. Dhouailly udførte vævsepitel-mesenkymale rekombinationsundersøgelser i embryoner fra forskellige arter. Disse undersøgelser gav udviklingsmæssig og evolutionær indsigt i epitel-mesenkymal kommunikation, der fremmer hudens morfogenese3.
Denne undersøgelse blev brugt til bedre at forstå faktorer, der styrer fjervækst. Metoden forbedrer også visualiseringen af cellulære og molekylære begivenheder involveret i hudmønster, der finder sted under fjerinitiering, udvikling og forlængelse langs den forreste-bageste akse. Når epitelet adskilles fra mesenkymet, og de to komponenter derefter rekombineres, genetablerer nye interaktioner hudmønsteret. Denne tilgang giver os mulighed for at evaluere mesenkymale inducerende signaler og epitelkompetencemolekyler, der gør det muligt for epidermis at reagere på de mesenkymale signaler11. Den efterfølgende nedstrøms molekylære ekspression, der er nødvendig for fjerknopudvikling og mønsterdannelse, kan også undersøges. Disse undersøgelser har fastslået, at placeringen af knopper styres af mesenkymet. Rotation af epitelet 90o før rekombination med mesenkymet viser, at retningen af fjerknoppens forlængelse styres af epitelet. Denne metode var afgørende for, at vi kunne studere den molekylære mekanisme, der regulerer fjerknopens orientering12.
Fuglehudrekonstitutionskultur, hvor hudens mesenkym dissocieres til enkelte celler før plettering ved høj celletæthed og overlejret med intakt epitel, nulstiller hudceller til en urtilstand. Explanten organiserer sig derefter selv for at danne et nyt periodisk mønster uafhængigt af de tidligere signaler13. Denne hudrekonstitutionsmodel kan bruges til at studere de indledende processer med periodisk mønster af fjer. Vi brugte denne tilgang til at undersøge, hvordan modulering af forholdet mellem mesenkymale celler og et enkelt stykke epitel kan påvirke størrelsen eller antallet af fjerknopper. Antallet af knopper viste sig at stige, men ikke størrelsen af knopper, da forholdet mellem mesenkymale celler steg. En anden fordel ved denne tilgang er, at mesenkymal celleviral transduktion viser højere effektivitet end under de to andre dyrkningsbetingelser og kan producere mere tydelige fænotyper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Kyllingeskindsekstraktkultur (figur 1)
- Udruge befrugtede kyllingæg i en befugtet inkubator ved 38 °C og iscenesætte dem ifølge Hamburger og Hamilton14.
- På trin 28 (~E5.5) er lemmens andet ciffer og tredje tå længere end de andre; tre cifre og fire tæer er tydelige.
- På trin 29 (~E6) er vingen bøjet ved albuen; Det andet ciffer er tydeligt længere end de andre.
- På trin 30 (~E6.5) er to dorsale fjerknopper på hver side af rygmarven synlige på brachialniveau, og tre rækker ses på niveau med benene.
- På trin 31 (~E7) er der ~7 rækker af fjer på jumbo-sakrale niveauer.
- På trin 32 er elleve eller flere rækker af fjerknopper til stede på niveau med benene.
- Anbring et trin 28-32 kyllingeembryo i en 60 mm petriskål indeholdende Hanks' bufrede saltopløsning (HBSS) eller fosfatbufret saltvand (PBS).
- Disseker embryoets ryghud mellem den nederste hals til haleregionen. Brug en saks til at fjerne hovedet fra nakken. Træk forsigtigt i lemmernes knopper for at placere den ventrale side af kroppen nedad med vedhængene spredt udad.
- Lav et forreste til bageste snit i huden langs de to flankerende sider af fosterlegemet ved hjælp af urmagerpincet eller en skarp fjedersaks. Sørg for at stabilisere kroppen med en pincet ved at klemme lemmernes knopper i længderetningen. Skræl forsigtigt huden fra halsen til haleregionen eller fra halen til halsen ved hjælp af urmagerpincet.
- Fjern forsigtigt det subkutane væv, der forbliver fastgjort til den skrællede hud, og glat hudens kanter med den skarpe fjedersaks.
- Tilsæt 2 ml/brønd af Dulbeccos modificerede ørnemedium (DMEM) suppleret med 10 % føtalt bovint serum (FBS) og penicillin/streptomycinopløsning (fortyndet 1:100) til en brønd i en 6-brønds skål. Når mediet og antibiotika er tilsat, placeres en steril vævskulturindsats inde i brønden, således at mediet er på ydersiden af kulturindsatsen.
- Overfør huden med en spatel til kulturindsatsen med epidermis opad og mesenkymet nedad på indsatsmembranen. For at sikre, at huden ligger fladt uden folder, trækkes huden op på spatelen i HBSS. Skub huden af spatelen med væsken for at lette overførslen af huden uden at folde.
- Fjern overskydende HBSS fra kulturindsatsen med en 200 μL pipette. Efterlad et tyndt lag HBSS inde i kulturindsatsen for at holde eksplanten halvvåd for at give en luft-væske-grænseflade.
- Inkuber skindets eksplanteringskulturer ved 37 °C ved hjælp af 5 % CO2 og 95 % luft. Skift mediet hver 2. dag.
BEMÆRK: Denne procedure er blevet offentliggjort4. Dette kultursystem kan også bruges med huden fra andre fugle såsom vagtler eller finkeskindsudplantekulturer.
2. Epitel-mesenkymal rekombination af kyllingeskind (figur 2)
- Udruge befrugtede kyllingeæg i en fugtet inkubator ved 38 °C og stadie embryonerne i henhold til Hamburger og Hamilton14 (afsnit 1.1).
- Forbered 2x calcium-magnesiumfrit (CMF) saltvand med 0,25% ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) buffer.
- Lav 10x CMF-buffer (NaCl (1,37 M) 80 g, KCl (0,04 M) 3 g, NaH2PO4 (0,004 M) 0,5 g, KH2PO4 (2 M) 0,25 g, NaHCO3 (0,12 M) 10 g, glukose (0,1 M) 20 g i 1,000 ml destilleret vand. Juster pH til 7,3. For at lave 100 ml 2x CMF med 0,25 % EDTA-buffer skal EDTA først opløses i 80 ml destilleret vand, derefter tilsættes 20 ml 10x CMF-buffer for at lave 2x CMF med 0,25 % EDTA-arbejdsopløsning.
- Disseker stadie 30-32 kyllingeembryos rygskind i HBSS som beskrevet ovenfor (afsnit 1.2) og udruger dem i 2x CMF-saltvand med 0,25 % EDTA på is i 15-20 minutter.
- Adskil forsigtigt epitelet og mesenkymet ved hjælp af urmagerpincet. Overfør det adskilte epitel og mesenkym til et rent fad indeholdende HBSS.
- Rekombiner epitelet med mesenkymet ved først at placere mesenkymet på en petriskål indeholdende HBSS, og læg derefter epitelet oven på mesenkymet. Placer epitelet langs den samme forreste-bageste akse som mesenkymet eller drej epitelet 90o fra den forreste-bageste akse af mesenkymet for at bestemme, hvilken komponent der regulerer forskellige aspekter af hudens morfogenese.
- Overfør de rekombinerede skind til kulturindsatser i 6-brønds kulturskåle for vækst og fjern overskydende HBSS omkring den rekombinerede hud.
- Anbring 2 ml DMEM-dyrkningsmedium med 10 % FBS i brønden uden for indsatsen. Placer et tyndt lag DMEM inde i indsatskammeret for at holde eksplanten halvvåd for at give en luft-væske-grænseflade.
- Inkuber hudrekombinanterne ved 37 °C i en blanding af 5 % CO2 og 95 % luft. Skift mediet hver 2. dag. Dokumentér fænotypiske ændringer i de indledende hudfaser af hudens udvikling ved hjælp af timelapse-fotografering med et kamera monteret på et dissektionsmikroskop.
BEMÆRK: Denne procedure er offentliggjort11.
3. Rekonstitution af kyllingeskind (figur 3)
- Udruge befrugtede kyllingeæg i en fugtet inkubator ved 38 °C og stadie embryonerne i henhold til Hamburger og Hamilton14 (afsnit 1.1).
- Disseker stadie 30-33 kyllingeembryo rygskind i HBSS. Inkuber skallerne i 2x CMF-saltvand med 0,25 % EDTA på is i 15-20 minutter som beskrevet ovenfor (afsnit 2.3).
- Adskil forsigtigt epitelet og mesenkymet ved hjælp af urmagerpincet. Overfør det adskilte epitel og mesenkym til HBSS på is.
BEMÆRK VENLIGST: Pas på ikke at beskadige epitelets basallag, når du adskiller epitelet fra mesenkymet. - Opsaml det adskilte mesenkym i et 15 ml centrifugerør og inkuber med 0,1 % kollagenase/trypsinopløsning fremstillet i PBS i et 37 °C vandbad i 10-15 minutter.
- Dissocier hudens mesenkym med en Pasteur-pipet for at lave en enkeltcellet suspension. Tilsæt DMEM med 10% FBS for at stoppe fordøjelsen.
- Pellet og centrifuger cellerne ved 233 × g i 5 min. Resuspenderede cellerne med dyrkningsmedium i en koncentration på 2 × 107 celler/ml.
BEMÆRK: På dette trin kan de mesenkymale celler også resuspenderes i virusholdigt medium i 2-3 timer på is til gentransduktion. - Placer en cellekulturindsats i en brønd i en 6-brønds skål. Drop 10 μL af 2 × 107 celler/ml mesenkymale celler på vævskulturindsatsen. Anbring 2 ml DMEM-dyrkningsmedium med 10 % FBS i brønden uden for indsatsen. Inkuber de belagte mesenkymale celler ved 37 °C ved hjælp af en 5 % CO2 og 95 % luftinkubator i 1 time, så cellerne kan sætte sig på indsatsmembranen.
- Overfør det intakte epitel oven på den belagte mesenkymale dråbe med epitelets basalcellelag vendt mod mesenkymale celler ved hjælp af en 1 ml pipette.
BEMÆRK VENLIGST: Ved overførsel af epitel til den mesenkymale dråbe bør de mesenkymale celler ikke forstyrres. - Flad det intakte epitel ud over mesenkymet for at få den rekonstituerede hud til at eksplante. Efterlad et tyndt lag af mediet på indsatsen for at holde den rekonstituerede hudeksplant halvvåd for at give en luft-væske-grænseflade. Den rekonstituerede hudeksplantning inkuberes ved 37 °C i en 5 % CO2 og 95 % luftinkubator. Skift mediet hver 2. dag.
BEMÆRK: Denne procedure er offentliggjort13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hudeksplanteringskulturer
Udvikling af fjerknopper fra ex vivo hudorgankulturer kan observeres direkte under mikroskopet. Ved hjælp af skindeksplanteringskulturmodellen af kyllingestadie 30 ryghud er plakoderne synlige langs midterlinjen. Den morfogenetiske front formerer sig derefter gradvist lateralt mod hudens periferi med dannelsen af nye fjerprimordia. Disse fjerprimordier vil udvikle sig til korte fjerknopper efter 2 dage i kultur og lange fjerknopper efter 4 dage i kultur (figur 1).
Hudrekombinationskulturer
Til hudrekombination, når epitel og mesenkym rekombineres, forsvinder de originale plakoder. Nye placodes vil dukke op kort efter rekombination og udvikle sig til at danne korte fjerknopper og lange fjerknopper efter henholdsvis 2 og 4 dage i kultur. Hvis epitelet drejes 90° i forhold til mesenkymet, vil orienteringen af de aflange knopper blive bestemt af epitelet (figur 2).
Kulturer til rekonstitution af huden
Til hudrekonstitution fremstår ex vivo-organkulturerne først homogene, og derefter dannes dermale kondensationer med jævn afstand samtidigt efter 1 dag i kultur. Det skal bemærkes, at antallet af fjerknopper afhænger af antallet af mesenkymale celler. Lavere mesenkymale tal inducerede færre knopper af samme størrelse til at danne11. Korte fjerknopper dannes efter 2-3 dage i kultur, og lange fjerknopper dannes efter 4-5 dage i kultur (figur 3).
Figur 4 viser oversigtsdiagrammer over ex vivo hudorgankultur, hudrekombinationsorgankultur og hudrekonstitutionsorgankultur.
Figur 1: Ex vivo hudorgankultur. Trin 32 kyllingeembryoskind dissekeres i HBSS og dyrkes i 6-brønds kulturindsatser (T0, på tid 0) i 2 og 4 dage. Fjerprimordierne udvikler sig til korte fjerknopper efter 2 dage i kultur og lange fjerknopper efter 4 dage i kultur. Dermale plakoder er angivet med den hvide pil. Bemærk, at knopperne i midterlinjen er mere modne end dem på begge sider. Denne metode er blevet modificeret fra Jiang og Chuong4. Skalabjælke = 500 μm. Forkortelse: HBSS = Hanks bufferede saltopløsning. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Ex vivo hudrekombinationsorgankultur. Trin 32 kyllingeembryohud dissekeres i HBSS, og epitel og mesenkymal adskilles i 2x CMF-buffer. Hudepitel og mesenkym rekombineres med eller uden rotation og dyrkes i 2 dage og 4 dage. De nye placodes udvikler sig til korte og lange fjerknopper efter 2 og 4 dage i dyrkning. Hvis epitelet drejes 90° i forhold til mesenkymet, bestemmes orienteringen af de nye knopper af epitelet12. Denne metode er blevet modificeret fra Chuong et al.11. Skalabjælke = 500 μm. Forkortelse: CMF = calcium-magnesium-fri. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Ex vivo organkultur til rekonstitution af huden. Trin 32 kyllingeembryohud dissekeres, og epitel og mesenkym adskilles i 2x CMF-buffer. Mesenkymet dissocieres i enkeltceller med 0,1% kollagenase og trypsin og pelleteres ved høj celletæthed på en kulturindsats. Hudcellepelleten rekonstitueres med et intakt epitel (T0, på tidspunkt 0) og dyrkes i 6 timer, 2 dage og 5 dage. Eksplanterne fremstår først homogene (6 timer) og derefter dermale kondensationer med jævn afstand dannes samtidigt efter 1 dag i kultur. Korte fjerknopper dannes efter 2-3 dage i kultur og lange fjerknopper dannes efter 4-5 dage i kultur. Denne metode er blevet modificeret fra Jiang et al.13. Skalabjælke = 500 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Diagrammer over ex vivo modeller for hudorgankultur. Huden starter ved E6.5 som et enkelt lag epitel, der overlejrer mesenkymale celler. Dette er afbildet øverst af de tre eksplanteringsmetoder. A) Ex vivo-kultur af hudorganer. Huden er belagt intakt oven på en kulturindsats ved luften: mediegrænseflade ved 37 °C i en 5 % CO2 og 95 % luftinkubator. B) Ex vivo hudrekombinationsorgankultur. Hudepitel adskilles fra mesenkymet og rekombineres derefter, før det pletteres på cellekulturindsatsen ved luft: mediegrænsefladen ved 37 °C i en 5 % CO2 og 95 % luftinkubator. C) Ex vivo organkultur til rekonstitution af huden. Hudepitel er adskilt fra mesenkymet. Mesenkymet dissocieres derefter til en encellet suspension, og de mesenkymale celler pelleteres i en centrifuge. De mesenkymale celler resuspenderes derefter i en koncentration på 2 × 107 celler/ml og 10 μL af suspensionen, anbringes på kulturindsatsen og overlejres derefter med et intakt stykke epidermis. Kulturen inkuberes ved luften: mediegrænsefladen ved 37 °C i en 5 % CO2 og 95 % luftinkubator. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende figur S1: Transduktion af mesenkymceller med GFP-udtrykkende virus. Dissocierede mesenkymale celler (2 × 107 celler/ml) blev inkuberet i 3 timer på is med >107 infektiøse enheder/ml replikationskompetent aviær sarkomvirus, der udtrykker grønt fluorescerende protein (GFP). De mesenkymale celler blev derefter brugt til at danne rekonstituerede hudorgankulturer som beskrevet i protokol afsnit 3 ovenfor og fotograferet 24 timer senere. Dataene viser, at ~40% af mesenkymale celler var mærket med GFP. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vævsrekombination giver en analyse til at udforske epitelets og mesenkymets unikke bidrag. Hos kyllinger begynder fjer at udvikle sig på embryonal dag 7 (E7), mens skæl begynder ved E9. Når E9-skalamesenkym rekombineres med E7-fjerepitel, danner det rekombinerede væv skæl, og når E7-fjermesenkym rekombineres med E9-skalaepitelfjerdannes fjer 11. Disse undersøgelser har vist, at mesenkymet styrer mønsterdannelsen, afstanden og organidentiteten. Epitelet skal naturligvis være kompetent til at kunne modtage og fortolke de mesenkymale signaler korrekt. Kompetence eksisterer kun i epitelet i et kort tidsinterval. I modsætning til ovenstående resultater, overraskende nok når kyllingens mundslimhinde og aboral E5-epitel rekombineres med E8-stammemesenkym, danner aboral epitel fjer; mundslimhinden danner dog flere tandlignende vedhæng15. Dette viser, at mens hudstammens mesenkym dirigerer det abriale epitel til at lave fjer, har det orale epitel ikke evnen til at lave fjer og kan kun lave tænder. Oral epitel i denne undersøgelse kan allerede have været forpligtet til at danne tænder ved E5. In situ hybridisering, RNAscope og immunfarvning kan bruges til at bekræfte molekylær ekspression i de rekombinerede eksplantater for at verificere identiteten af væv, der dannes. Ved hjælp af denne analyse kan forstyrrelser specifikt rettes mod epitelet eller mesenkymet.
Vævsrekonstitution nulstiller celler i mesenkymet til en ikke-forpligtet tilstand. E7-E8 fjerhud er begyndt at danne mesenkymale kondensationer i rygkanalen, før huden dissocieres, og mesenkymet dissocieres til enkeltceller. Ved at mærke epitel- eller mesenkymale celler i urknopperne eller interbudregionerne kan hudcellerne findes inden i eller uden for knopper uden hensyn til deres tidligere placering. Ved lav mesenkymal celletæthed danner de rekonstituerede hudeksplantater få normalstore fjerknopper. Efterhånden som den mesenkymale celletæthed øges, øges antallet af knopper, indtil en maksimal pakningstæthed er opnået13. Disse data indikerer, at cellerne omprogrammeres gennem tab af kontakt med deres oprindelige naboer og gennemgår en ny runde af mønsterdannelse. Disse kulturer udvikler også kondensationer og fjerprimordia. Interessant nok dannes knopper samtidigt på tværs af huden i modsætning til den progressive udbredelse af knopper, der ses i hudeksplantater og rekombinerede hudeksplantater. Denne metode giver mulighed for observation og manipulation af tidlige hudcellulære og molekylære interaktioner. Molekylær ekspression kan vurderes i kultur ved hjælp af promotor-reporter-assays. Rekonstitution mellem transgene eller knockout-linjer kan hjælpe med yderligere at analysere molekylernes roller i hudmønsterprocessen. Viral transduktion forstærkes i de dissocierede mesenkymale celler og kan ofte give en øget forstyrrelse.
Mens hver af disse eksperimentelle tilgange kan hjælpe efterforskere med at udforske cellulære og molekylære begivenheder, der finder sted under hudens morfogenese. Vi bruger ofte hver af disse tilgange og ser, hvilken der giver den bedste indsigt. Resultaterne kan derefter udforskes yderligere under andre dyrkningsforhold eller ved hjælp af intakte embryoner.
Begrænsninger ved disse tilgange
Hver af disse tre assays giver meget reproducerbare resultater. Men da disse analyser kan reagere på den samme forstyrrelse i forskellig grad, er det ofte umagen værd at forstyrre forholdene ved hjælp af alle tre analyser, hvis der ikke umiddelbart er nogen ændringer. Selvom hudeksplanteringskulturen giver en god model for tidlig hudmønsterdannelse og udvikling af hudvedhæng, kan eksplantaten kun dyrkes i ~1 uge. Dette udelukker deres anvendelse i senere udvikling af hudvedhæng, for eksempel processen til dermal papilladannelse og follikelmorfogenese, selvom procedurerne forbedres til at dyrke disse eksplantater længere. Til dato er cellerne på tidlige tidspunkter efter at have lavet rekonstituerede hudeksplantationer løst bundet til deres substrater, hvilket gør analyser, der bruger flere vaske, såsom in situ-hybridisering , vanskelige. Disse kulturer binder deres substrater fastere efter 24 timer, hvor der er dannet kondens i hele kulturen.
Fugleembryonal hud giver en fremragende model til at studere udviklingen af hudvedhæng. Hudeksplanteringskulturer har den fordel, at de gør det muligt at manipulere de dyrkningsforhold, hvor ex vivo-hudorgankulturerne vokser. Det muliggør også langsigtet time-lapse-billeddannelse af udvikling for at se udbredelsen af knopper fra midterlinjen til laterale kanter over tid. Derudover kan kulturen startes ved hjælp af forskellige embryonale stadier til at udforske forskellige begivenheder i fjermønster og vækst. Til periodisk mønsterdannelse kan huden dyrkes fra E6 og dyrkes i 4 dage. Ved fjerfollikelmorfogenese kan dyrkningen startes ved E8 og dyrkes i 4 dage. Det er vanskeligt at dissekere huden på stadier før E6. Med eksplanteringskulturer kan globale forstyrrelser foretages ved at tilføje vækstfaktorer eller hæmmere til hudens eksplantationskulturmedium 8,16,17. Forstyrrelse af huden lokalt kan opnås ved at placere proteinovertrukne perler på hudeksplanten eller ved viralt at transducere celler for at modulere genekspression 8,16,17. Explantationskulturer letter billeddannelsen af kollektiv celleadfærd såsom calciumaktiviteter6 og anvendelsen af biofysiske kræfter såsom vævsspænding18 eller elektriske strømme12. Disse metoder giver gode muligheder for at give ny indsigt i de faktorer, der regulerer periodiske organmønstre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde er støttet af NIH NIAMS-bevilling R37 AR 060306, R01 AR 047364 og RO1 AR078050. Arbejdet understøttes også af en forskningssamarbejdskontrakt mellem USC og China Medical University i Taiwan. Vi takker USC BISC 480 Developmental Biology 2023-klassen for med succes at teste denne fuglehudkulturprotokol under flere laboratoriemoduler.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well culture dish | Falcon | REF 353502 | Air-Liquid Interface (ALI) Cultures |
| Cell culture inset | Falcon | REF 353090. | 0.4 µm Transparent PET Membrane |
| Collagenase Type 1 | Worthington Biochemical | LS004196 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Corning | 10-013-CV | 4.5 g/L glucose |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher | 16140-071 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Hanks’s buffered saline solution | Gibco | 14170-112 | No calcium, no magnesium |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15-140-122 | |
| Pogassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5379 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Sodium chloride (Nacl) | EMD | CAS 7647-14-5 | |
| Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) | Sigma-Aldrich | S0751 | |
| Trypsin | Gibco | 27250-042 |
References
- Lucas, A. M., Stettenheim, P. R. Avian anatomy: Integument part I and part II. Agriculture Handbook. 362, Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture, Washington D.C.. (1972).
- Sengel, P. In Morphogenesis of Skin, l-277. , Cambridge Univ. Press. New York. (1976).
- Dhouailly, D., Wilehm Roux, Formation of cutaneous appendages in dermo-epidermal recombinations between reptiles, birds and mammals. Archives of Developmental Biology. 177 (4), 323-340 (1975).
- Jiang, T. -X., Chuong, C. -M. Mechanism of feather morphogenesis: I. Analyses with antibodies to Adhesion Molecules Tenascin, N-CAM and Integrin. Developmental Biology. 150 (1), 82-98 (1992).
- Li, A., et al. Shaping organs by a Wnt / Notch / non-muscle myosin module which orients feather bud elongation. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 110 (16), E1452-E1461 (2013).
- Li, A., et al. Calcium oscillations coordinate feather mesenchymal cell movement by SHH dependent modulation of gap junction networks. Nature Communications. 9 (1), 5377 (2018).
- Ting-Berreth, S. A., Chuong, C. M. Local delivery of TGF beta2 can restore epithelium dependent organization of mesenchymal condensation during skin appendage morphogenesis. Developmental Biology. 179 (2), 347-359 (1996).
- Widelitz, R. B., Jiang, T. -X., Noveen, A., Chen, C. -W. J., Chuong, C. -M. FGF induces new feather buds from developing avian skin. Journal of Investigation Dermatology. 107 (6), 797-803 (1996).
- Rawles, M. E. Tissue interactions in scale and feather development as studies in dermal-epidermal recombinations. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 11, 765-789 (1963).
- McAleese, S. R., Sawyer, R. H. Correcting the phenotype of the epidermis from chick embryos homozygous for the gene scaleless (sc/sc). Science. 214 (4524), 1033-1034 (1981).
- Chuong, C. M., Widelitz, R. B., Ting-Berreth, S., Jiang, T. X. Early events during avian skin appendage regeneration: dependence on epithelial-mesenchymal interaction and order of molecular reappearance. J Invest Dermatol. 107 (4), 639-646 (1996).
- Jiang, T. X., et al. Global feather orientations changed by electric current. iScience. 24 (6), 102671 (2021).
- Jiang, T. X., Jung, H. S., Widelitz, R. B., Chuong, C. M. Self-organization of periodic patterns by dissociated feather mesenchymal cells and the regulation of size, number and spacing of primordia. Development. 126 (22), 4997-5009 (1999).
- Hamburger, V., Hamilton, H. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 188, 49-92 (1951).
- Chen, Y. P., et al. Conservation of early odontogenic signaling pathway in Aves. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 97 (18), 10044-10049 (2000).
- Chuong, C. -M., Ting, S. A., Widelitz, R. B., Lee, Y. S. Mechanism of Skin Morphogenesis: II. Retinoic acid gradient modulates axis orientation and phenotypes of skin appendages. Development. 115 (3), 839-852 (1992).
- Noveen, A., Jiang, T. -X., Chuong, C. -M. Protein kinase A and protein kinase C modulators have reciprocal effects on mesenchymal condensation during skin appendage morphogenesis. Developmental Biology. 171 (2), 677-693 (1995).
- Wu, X. S., et al. Self-assembly of biological networks via adaptive patterning revealed by avian intradermal muscle network formation. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 116 (22), 10858-10867 (2019).
