Summary
Her beskriver vi protokoller for tre typer fugleembryonale hudeksplantasjonskulturer som kan brukes til å undersøke vevsinteraksjoner, 4D-avbildning timelapse-film (3D pluss tid), global eller lokal forstyrrelse av molekylær funksjon og systembiologisk karakterisering.
Abstract
Den utviklende fuglehuden under embryogenese er en unik modell som kan gi verdifull innsikt i vevsmønster. Her beskrives tre varianter av hudeksplantasjonskulturer for å undersøke ulike aspekter ved hudutvikling. For det første gir ex vivo organkulturer og manipulasjoner forskere muligheter til å observere og studere utviklingen av fjærknopper direkte. Hudeksplantasjonskultur kan vokse i 7 dager, noe som muliggjør direkte analyse av cellulær oppførsel og 4D-avbildning med intervaller i løpet av denne vekstperioden. Dette gir også mulighet for fysiske og molekylære manipulasjoner av kulturforhold for å visualisere vevsrespons. For eksempel kan vekstfaktorbelagte perler påføres lokalt for å indusere endringer i fjærmønster i et begrenset område. Alternativt kan viral transduksjon leveres globalt i kulturmediet for å opp- eller nedregulere genuttrykk. For det andre lar hudrekombinasjonsprotokollen forskere undersøke vevsinteraksjoner mellom epidermis og mesenkym som er avledet fra forskjellige hudregioner, forskjellige livsstadier eller forskjellige arter. Dette gir en mulighet til å teste tidsvinduet der epitelet er kompetent til å reagere på signaler og dets evne til å danne forskjellige hudvedheng som respons på signaler fra forskjellige mesenkymale kilder. For det tredje tilbakestiller hudrekonstitusjon ved bruk av dissosierte hudceller overlagt med intakt epitel hudutviklingen og muliggjør studiet av de første prosessene med periodisk mønster. Denne tilnærmingen forbedrer også vår evne til å manipulere genuttrykk blant de dissosierte cellene før vi lager den rekonstituerte hudeksplanten. Denne artikkelen gir de tre kulturprotokollene og eksemplariske eksperimentene for å demonstrere nytten av dem.
Introduction
Utvikling av fugleembryohud er en utmerket modell for å studere mekanismene for morfogenese på grunn av de distinkte mønstrene og tilgjengeligheten til mikrokirurgi og manipulasjon 1,2. Imidlertid kan det være vanskelig å evaluere cellulære og molekylære hendelser i intakt vev fordi tilstedeværelsen av fremmede vev kan komplisere mikroskopiske observasjoner. Videre er evnen til å manipulere genuttrykk for å teste deres rolle i hudens morfogenese ikke alltid en enkel oppgave. Vi finner at vi kan teste genfunksjoner ved hjelp av retroviral transduksjon med en høyere suksessrate ved å bruke hudeksplantasjonsmodeller. Her diskuterer vi fordelene med tre hudeksplantasjonsmodeller som er utviklet.
Fugleembryonal hudkultur er et kraftig system for å vurdere celleoppførsel, genregulering og funksjon under utvikling av hudfjærknopper 3,4,5,6. Det gir mulighet for evaluering av de molekylære mekanismene for utvikling av fjærknopper gjennom global tilsetning av vekstfaktorer plassert i kulturmediet eller deres lokale frigjøring fra vekstfaktorbelagte perler. Utviklingsregulatoriske gener kan også manipuleres ved hjelp av viral gentransduksjon av intakte eller dominerende negative former for funksjonelle studier som evaluerer deres roller i spesifikke morfogenetiske hendelser 7,8.
Fugleepitel-mesenkymal rekombinasjonskultur gjør det mulig for etterforskere å bestemme bidragene til hver hudkomponent i de tidlige stadiene av hudmorfogenese. Rawles' bruk av denne tilnærmingen avslørte at interaksjoner mellom mesenkymet og epitelet er avgjørende for å danne hudvedheng9. Mesenkymet kan danne kondensasjoner og epitelet er nødvendig for å indusere og opprettholde mesenkymale kondensasjonsformasjoner2. Senere ble denne tilnærmingen brukt til å vurdere hvorfor skjellløse kyllinger ikke klarer å danne fjær. Defekten ble oppdaget å være i mesenkym10. Dhouailly utførte vevsepitel-mesenkymale rekombinasjonsstudier på embryoer fra forskjellige arter. Disse studiene ga utviklingsmessig og evolusjonær innsikt i epitel-mesenkymal kommunikasjon som fremmer hudmorfogenese3.
Denne studien ble brukt til å bedre forstå faktorer som kontrollerer fjærvekst. Metoden forbedrer også visualiseringen av cellulære og molekylære hendelser involvert i hudmønster som finner sted under fjærinitiering, utvikling og forlengelse langs den fremre-bakre aksen. Når epitelet skilles fra mesenkymet og de to komponentene deretter rekombineres, gjenoppretter nye interaksjoner hudmønster. Denne tilnærmingen lar oss evaluere mesenkymale induserende signaler og epitelkompetansemolekyler som gjør det mulig for epidermis å reagere på de mesenkymale signalene11. Det påfølgende nedstrøms molekylære uttrykket som er nødvendig for utvikling av fjærknopper og mønsterdannelse kan også undersøkes. Disse studiene har fastslått at plasseringen av knopper styres av mesenkymet. Rotasjon av epitelet 90o før rekombinasjon med mesenkymet viser at retningen på fjærknoppforlengelsen styres av epitelet. Denne metoden var avgjørende for at vi kunne studere den molekylære mekanismen som regulerer fjærknoppens orientering12.
Fuglehudrekonstitusjonskultur, der hudens mesenkym dissosieres til enkeltceller før plating med høy celletetthet og overlegges med intakt epitel, tilbakestiller hudcellene til en primordial tilstand. Eksplanten organiserer seg deretter selv for å danne et nytt periodisk mønster uavhengig av de tidligere signalene13. Denne hudrekonstitueringsmodellen kan brukes til å studere de første prosessene med periodisk mønster av fjær. Vi brukte denne tilnærmingen til å utforske hvordan modulering av forholdet mellom mesenkymale celler til et enkelt stykke epitel kan påvirke størrelsen eller antallet fjærknopper. Antall knopper ble funnet å øke, men ikke størrelsen på knoppene ettersom forholdet mellom mesenkymale celler økte. En annen fordel med denne tilnærmingen er at mesenkymal celleviral transduksjon viser høyere effektivitet enn i de to andre kulturforholdene og kan produsere mer åpenbare fenotyper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Kyllingskinn eksplantasjonskultur (figur 1)
- Inkuber befruktede kyllingegg i en fuktet inkubator ved 38 °C og iscenesett dem i henhold til Hamburger og Hamilton14.
- På trinn 28 (~E5.5) er lemmens andre siffer og tredje tå lengre enn de andre; tre sifre og fire tær er distinkte.
- På trinn 29 (~E6) er vingen bøyd ved albuen; det andre sifferet er tydelig lengre enn de andre.
- På stadium 30 (~E6.5) er to ryggfjærknopprader på hver side av ryggmargen synlige på brachialnivå og tre rader sees på nivå med bena.
- På trinn 31 (~E7) er det ~7 rader med fjær på jumbo-sakrale nivåer.
- På trinn 32 er elleve eller flere rader med fjærknopper tilstede på nivå med bena.
- Plasser et trinn 28-32 kyllingembryo i en 60 mm petriskål som inneholder Hanks bufret saltoppløsning (HBSS) eller fosfatbufret saltvann (PBS).
- Disseker ut embryoets rygghud mellom nedre hals til haleregionen. Bruk saks for å fjerne hodet fra nakken. Trekk forsiktig i lemknoppene for å plassere den ventrale siden av kroppen nedover med vedhengene spredt utover.
- Lag et fremre til bakre snitt i huden langs de to flankerende sidene av embryokroppen ved hjelp av urmakertang eller skarp fjærsaks. Sørg for å stabilisere kroppen med en tang ved å klemme lemknoppene i lengderetningen. Skrell huden forsiktig fra nakken til haleregionen eller fra halen til nakken ved hjelp av urmakertang.
- Fjern forsiktig det subkutane vevet som forblir festet til den skrellede huden og glatt kantene på huden med den skarpe fjærsaksen.
- Tilsett 2 ml/brønn av Dulbeccos modifiserte Eagle's medium (DMEM) supplert med 10 % føtalt bovint serum (FBS) og Penicillin/streptomycinoppløsning (fortynnet 1:100) til en brønn i en 6-brønns tallerken. Når mediet og antibiotika er tilsatt, plasser en steril vevskulturinnsats inne i brønnen, slik at mediet er på utsiden av kulturinnsatsen.
- Overfør huden med en slikkepott til kulturinnsatsen med epidermis vendt opp og mesenkymet vendt ned på innsatsmembranen. For å sikre at huden ligger flatt uten skrukker, trekker du huden på slikkepotten i HBSS. Skyv huden av slikkepotten med væsken for å lette overføringen av huden uten å brette seg.
- Fjern overflødig HBSS fra kulturinnsatsen med en 200 μL pipette. La det være et tynt lag med HBSS inne i kulturinnsatsen for å holde eksplanten halvvåt for å gi et luft-væske-grensesnitt.
- Inkuber hudeksplanteringskulturene ved 37 °C med 5 % CO2 og 95 % luft. Bytt medium hver 2.
MERK: Denne prosedyren er publisert4. Dette kultursystemet kan også brukes med huden til andre fugler som vaktel- eller finkeskinnskulturer.
2. Epitel-mesenkymal rekombinasjon av kyllingskinn (figur 2)
- Inkuber befruktede kyllingegg i en fuktet inkubator ved 38 °C og iscenesett embryoene i henhold til Hamburger og Hamilton14 (pkt. 1.1).
- Forbered 2x kalsium-magnesiumfritt (CMF) saltvann med 0,25 % etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) buffer.
- Lag 10x CMF-buffer (NaCl (1,37 M) 80 g, KCl (0,04 M) 3 g, NaH2PO4 (0,004 M) 0,5 g, KH2PO4 (2 M) 0,25 g, NaHCO3 (0,12 M) 10 g, glukose (0,1 M) 20 g i 1,000 ml destillert vann. Juster pH til 7,3. For å lage 100 ml 2x CMF med 0,25 % EDTA-buffer, bør EDTA først oppløses i 80 ml destillert vann, og deretter tilsettes 20 ml 10x CMF-buffer for å lage 2x CMF med 0,25 % EDTA-arbeidsløsning.
- Disseker stadium 30-32 kyllingembryo ryggskinn i HBSS som beskrevet ovenfor (avsnitt 1.2) og inkuber dem i 2x CMF-saltvann med 0,25 % EDTA på is i 15-20 minutter.
- Skill epitelet og mesenkymet forsiktig ved hjelp av urmakerens tang. Overfør det separerte epitelet og mesenkymet til en ren tallerken som inneholder HBSS.
- Kombiner epitelet på nytt med mesenkymet ved først å plassere mesenkymet på en petriskål som inneholder HBSS, og legg deretter epitelet på toppen av mesenkymet. Plasser epitelet langs samme fremre-bakre akse som mesenkymet eller vri epitelet 90o fra den fremre-bakre aksen til mesenkymet for å bestemme hvilken komponent som regulerer ulike aspekter av hudens morfogenese.
- Overfør de rekombinerte skinnene til kulturinnsatser i 6-brønns kulturskåler for vekst og fjern overflødig HBSS rundt den rekombinerte huden.
- Plasser 2 ml DMEM-kulturmedium med 10 % FBS i brønnen utenfor innsatsen. Plasser et tynt lag DMEM inne i innsatskammeret for å holde eksplantaten halvvåt for å gi et luft-væske-grensesnitt.
- Inkuber hudrekombinantene ved 37 °C i en blanding av 5 % CO2 og 95 % luft. Bytt medium hver 2. Dokumenter fenotypiske endringer i de første fasene av hudutviklingen ved hjelp av intervallfotografering med et kamera montert på et disseksjonsmikroskop.
MERK: Denne prosedyren er publisert11.
3. Rekonstituering av kyllingskinn (figur 3)
- Inkuber befruktede kyllingegg i en fuktet inkubator ved 38 °C og iscenesett embryoene i henhold til Hamburger og Hamilton14 (pkt. 1.1).
- Disseker stadium 30-33 kyllingembryo ryggskinn i HBSS. Inkuber skinnene i 2x CMF-saltvann med 0,25 % EDTA på is i 15-20 minutter som beskrevet ovenfor (pkt. 2.3).
- Skill epitelet og mesenkymet forsiktig ved hjelp av urmakerens tang. Overfør det separerte epitelet og mesenkymet til HBSS på is.
NOTAT: Vær forsiktig så du ikke skader det basale laget av epitelet når du skiller epitelet fra mesenkymet. - Samle det separerte mesenkymet i et 15 ml sentrifugerør og inkuber med 0,1 % kollagenase/trypsinløsning laget i PBS i et 37 °C vannbad i 10-15 minutter.
- Dissosier hudens mesenkym med en Pasteur-pipett for å lage en encellet suspensjon. Tilsett DMEM med 10% FBS for å stoppe fordøyelsen.
- Peller og sentrifuger cellene ved 233 × g i 5 min. Resuspenderte cellene med kulturmedium i en konsentrasjon på 2 × 107 celler/ml.
MERK: På dette trinnet kan mesenkymale celler også resuspenderes i virusholdig medium i 2-3 timer på is for gentransduksjon. - Legg en cellekulturinnsats i en brønn i en 6-brønns tallerken. Slipp 10 μL av 2 × 107 celler/ml mesenkymale celler på vevskulturinnsatsen. Plasser 2 ml DMEM-kulturmedium med 10 % FBS i brønnen utenfor innsatsen. Inkuber de belagte mesenkymale cellene ved 37 °C ved hjelp av en 5 % CO2 og 95 % luftinkubator i 1 time for å la cellene legge seg på innsatsmembranen.
- Overfør det intakte epitelet på toppen av den belagte mesenkymale dråpen med epitelets basalcellelag vendt mot mesenkymale celler ved hjelp av en 1 ml pipet.
NOTAT: Ved overføring av epitel til den mesenkymale dråpen, bør de mesenkymale cellene ikke forstyrres. - Flat det intakte epitelet over mesenkymet for å få den rekonstituerte huden til å eksplantere. La det være et tynt lag av mediet på innsatsen for å holde den rekonstituerte huden halvvåt for å gi et luft-væske-grensesnitt. Inkuber den rekonstituerte hudeksplanten ved 37 °C i en 5 % CO2 og 95 % luftinkubator. Bytt medium hver 2.
MERK: Denne prosedyren er publisert13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hudeksplantasjonskulturer
Fjærknopputvikling fra ex vivo hudorgankulturer kan observeres direkte under mikroskopet. Ved å bruke hudeksplanteringskulturmodellen av kyllingstadium 30 rygghud, er plakodene synlige langs midtlinjen. Den morfogenetiske fronten forplanter seg deretter gradvis sideveis mot hudperiferien med dannelsen av nye fjærprimordia. Disse fjærprimordiene vil utvikle seg til korte fjærknopper etter 2 dager i kultur og lange fjærknopper etter 4 dager i kultur (figur 1).
Hudrekombinasjonskulturer
For hudrekombinasjon, når epitel og mesenkym kombineres på nytt, forsvinner de originale plakodene. Nye plakoder vil dukke opp kort tid etter rekombinasjon og utvikle seg til å danne korte fjærknopper og lange fjærknopper etter henholdsvis 2 og 4 dager i kultur. Hvis epitelet roteres 90° i forhold til mesenkymet, vil orienteringen til de langstrakte knoppene bestemmes av epitelet (figur 2).
Kulturer for rekonstituering av huden
For hudrekonstituering virker ex vivo-organkulturene først homogene, og deretter dannes dermale kondensasjoner med jevn avstand samtidig etter 1 dag i kultur. Det skal bemerkes at antall fjærknopper er avhengig av antall mesenkymale celler. Lavere mesenkymalt antall induserte færre knopper av lignende størrelse til å danne11. Korte fjærknopper vil dannes etter 2-3 dager i kultur og lange fjærknopper vil dannes etter 4-5 dager i kultur (figur 3).
Figur 4 viser sammendragsdiagrammer over ex vivo hudorgankultur, hudrekombinasjonsorgankultur og hudrekonstitueringsorgankultur.
Figur 1: Ex vivo hudorgankultur. Trinn 32 kyllingembryoskinn dissekeres i HBSS og dyrkes i 6-brønns kulturinnsatser (T0, ved tid 0) i 2 og 4 dager. Fjærprimordiene utvikler seg til korte fjærknopper etter 2 dager i kultur og lange fjærknopper etter 4 dager i kultur. Dermale plakoder er indikert med den hvite pilen. Merk at knoppene i midtlinjen er mer modne enn de på begge sider. Denne metoden er modifisert fra Jiang og Chuong4. Skalastang = 500 μm. Forkortelse: HBSS = Hanks bufrede saltløsning. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Ex vivo hudrekombinasjonsorgankultur. Stadium 32 kyllingembryohud dissekeres i HBSS, og epitel og mesenkymal skilles i 2x CMF-buffer. Hudepitel og mesenkym rekombineres med eller uten rotasjon og dyrkes i 2 dager og 4 dager. De nye plakodene utvikler seg til korte og lange fjærknopper etter 2 og 4 dager i kultur. Hvis epitelet roteres 90° i forhold til mesenkymet, bestemmes orienteringen til de nye knoppene av epitelet12. Denne metoden er modifisert fra Chuong et al.11. Skalastang = 500 μm. Forkortelse: CMF = kalsium-magnesium-fri. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Ex vivo organkultur for rekonstituering av huden. Stadium 32 kyllingembryohud dissekeres, og epitel og mesenkym skilles i 2x CMF-buffer. Mesenkymet dissosieres til enkeltceller med 0,1 % kollagenase og trypsin og pelleteres ved høy celletetthet på en kulturinnsats. Hudcellepelleten rekonstitueres med et intakt epitel (T0, ved tid 0) og dyrkes i 6 timer, 2 dager og 5 dager. Eksplantene virker homogene først (6 timer) og deretter dermal kondensering med jevn avstand dannes samtidig etter 1 dag i kultur. Korte fjærknopper vil dannes etter 2-3 dager i kultur og lange fjærknopper dannes etter 4-5 dager i kultur. Denne metoden er modifisert fra Jiang et al.13. Skalastang = 500 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Diagrammer over ex vivo modeller for hudorgankultur. Huden starter ved E6.5 som et enkelt lag av epitel som ligger over mesenkymale celler. Dette er avbildet øverst av de tre eksplanteringsmetodene. (A) Ex vivo hudorgankultur. Huden er belagt intakt på toppen av en kulturinnsats ved luften: mediegrensesnitt ved 37 °C i en 5 % CO2 og 95 % luftinkubator. (B) Ex vivo hudrekombinasjonsorgankultur. Hudepitel skilles fra mesenkymet og rekombineres deretter før det legges på cellekulturinnsatsen ved luft: mediegrensesnitt ved 37 °C i en 5 % CO2 og 95 % luftinkubator. (C) Ex vivo organkultur til rekonstituering av huden. Hudepitel skilles fra mesenkymet. Mesenkymet dissosieres deretter til en encellet suspensjon og de mesenkymale cellene pelleteres i en sentrifuge. De mesenkymale cellene blir deretter resuspendert i en konsentrasjon på 2 × 107 celler/ml og 10 μL av suspensjonen plassert på kulturinnsatsen og deretter lagt over med et intakt stykke epidermis. Kulturen inkuberes ved luft: mediegrensesnitt ved 37 °C i en 5 % CO2 og 95 % luftinkubator. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsfigur S1: Transduksjon av mesenkymceller med GFP-uttrykkende virus. Dissosierte mesenkymale celler (2 × 107 celler/ml) ble inkubert i 3 timer på is med >107 infeksiøse enheter/ml replikasjonskompetent fuglesarkomvirus som uttrykker grønt fluorescerende protein (GFP). De mesenkymale cellene ble deretter brukt til å danne rekonstituerte hudorgankulturer som beskrevet i protokoll avsnitt 3 ovenfor og fotografert 24 timer senere. Dataene viser at ~40 % av mesenkymale celler ble merket med GFP. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vevsrekombinasjon gir en analyse for å utforske de unike bidragene til epitelet og mesenkymet. Hos kyllinger begynner fjær å utvikle seg på embryonal dag 7 (E7) mens skjell begynner ved E9. Når E9-skalamesenkym rekombineres med E7-fjærepitel, danner det rekombinerte vevet skjell, og når E7-fjærmesenkym rekombineres med E9-skalaepitelfjærdannes 11. Disse studiene har vist at mesenkymet kontrollerer mønsterdannelsen, avstanden og organidentiteten. Epitelet må selvfølgelig være kompetent for å kunne motta og tolke de mesenkymale signalene på riktig måte. Kompetanse eksisterer bare i epitelet i et kort tidsintervall. I motsetning til resultatene ovenfor, overraskende nok når kyllingens munnslimhinne og aboral E5-epitel kombineres med E8-stammemesenkym, danner aboral epitel fjær; Imidlertid danner munnslimhinnen flere tannlignende vedheng15. Dette viser at mens hudstammemesenkymet leder det aborale epitelet til å lage fjær, har ikke det orale epitelet evnen til å lage fjær og kan bare lage tenner. Oralt epitel i denne studien kan allerede ha blitt forpliktet til å danne tenner ved E5. In situ hybridisering, RNA-skop og immunfarging kan brukes til å bekrefte molekylær ekspresjon i de rekombinerte eksplantene for å verifisere identiteten til vev som dannes. Ved å bruke denne analysen kan forstyrrelser rettes spesifikt mot epitelet eller mesenkymet.
Vevsrekonstituering tilbakestiller celler i mesenkymet til en ikke-forpliktet tilstand. E7-E8 fjærhud har begynt å danne mesenkymale kondensasjoner i ryggkanalen før huden dissosieres og mesenkymet dissosieres til enkeltceller. Ved å merke epitel- eller mesenkymale celler i urknoppene eller interknoppene, kan hudcellene finnes i eller utenfor knoppene uten hensyn til deres tidligere plassering. Ved lav mesenkymal celletetthet danner de rekonstituerte hudeksplantasjonene få fjærknopper i normal størrelse. Når den mesenkymale celletettheten øker, øker antall knopper til en maksimal pakningstetthet er oppnådd13. Disse dataene indikerer at cellene omprogrammeres gjennom tap av kontakt med sine første naboer og gjennomgår en ny runde med mønsterdannelse. Disse kulturene utvikler også kondensasjoner og fjærprimordia. Interessant nok dannes knopper samtidig over huden i motsetning til den progressive forplantningen av knoppdannelse som sees i hudeksplantater og rekombinerte hudeksplantater. Denne metoden gir observasjon og manipulering av tidlige hudcellulære og molekylære interaksjoner. Molekylært uttrykk kan vurderes i kultur ved bruk av promotor-reporter-analyser. Rekonstituering mellom transgene eller knockout-linjer kan bidra til å analysere molekylenes roller i hudmønsterprosessen ytterligere. Viral transduksjon forsterkes i de dissosierte mesenkymale cellene og kan ofte gi økt forstyrrelse.
Mens hver av disse eksperimentelle tilnærmingene kan hjelpe etterforskere til å utforske cellulære og molekylære hendelser som finner sted under hudmorfogenese. Vi bruker ofte hver av disse tilnærmingene og ser hvilken som gir best innsikt. Funn kan deretter utforskes videre under andre kulturforhold eller ved bruk av intakte embryoer.
Begrensninger ved disse tilnærmingene
Hver av disse tre analysene gir svært reproduserbare resultater. Men siden disse analysene kan reagere på den samme forstyrrelsen i ulik grad, er det ofte verdt å forstyrre forholdene ved å bruke alle tre analysene hvis det ikke oppstår noen endringer i utgangspunktet. Selv om hudeksplanteringskulturen gir en god modell for tidlig hudmønsterdannelse og utvikling av hudvedheng, kan eksplanten bare dyrkes i ~1 uke. Dette utelukker deres bruk i senere utvikling av hudvedheng, for eksempel prosessen for dannelse av dermal papilla og follikkelmorfogenese, selv om prosedyrer forbedres for å dyrke disse eksplantene lenger. Til dags dato, på tidlige tidspunkter etter å ha gjort rekonstituerte hudeksplantasjoner, er cellene løst festet til substratene sine, noe som gjør analyser som bruker flere vasker, for eksempel in situ-hybridisering , vanskelige. Disse kulturene binder substratene sine fastere etter 24 timer hvor kondensasjoner har dannet seg i hele kulturen.
Fugleembryonal hud gir en utmerket modell for å studere utviklingen av hudvedheng. Hudeksplantasjonskulturer har fordelen av å muliggjøre manipulering av kulturforholdene der ex vivo hudorgankulturene vokser. Det muliggjør også langsiktig time-lapse-avbildning av utvikling for å se forplantningen av knopper fra midtlinjen til sidekantene over tid. I tillegg kan kulturen startes ved å bruke forskjellige embryonale stadier for å utforske ulike hendelser innen fjærmønster og vekst. For periodisk mønsterdannelse kan huden dyrkes fra E6 og dyrkes i 4 dager. For fjærfollikkelmorfogenese kan kulturen startes på E8 og dyrkes i 4 dager. Det er vanskelig å dissekere huden på stadier før E6. Med eksplantasjonskulturer kan globale forstyrrelser gjøres ved å tilsette vekstfaktorer eller hemmere til hudeksplantasjonskulturmediet 8,16,17. Å forstyrre huden lokalt kan oppnås ved å plassere proteinbelagte perler på hudeksplanten eller ved å viralt transdusere celler for å modulere genuttrykk 8,16,17. Eksplantasjonskulturer letter avbildning av kollektiv celleoppførsel som kalsiumaktiviteter6 og påføring av biofysiske krefter som vevsspenning18 eller elektriske strømmer12. Disse metodene gir store muligheter til å gi ny innsikt i faktorene som regulerer periodiske organmønstre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å erklære.
Acknowledgments
Dette arbeidet støttes av NIH NIAMS-tilskudd R37 AR 060306, R01 AR 047364 og RO1 AR078050. Arbeidet støttes også av en samarbeidskontrakt mellom USC og China Medical University i Taiwan. Vi takker USC BISC 480 Developmental Biology 2023-klassen for vellykket testing av denne fuglehudkulturprotokollen under flere laboratoriemoduler.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well culture dish | Falcon | REF 353502 | Air-Liquid Interface (ALI) Cultures |
| Cell culture inset | Falcon | REF 353090. | 0.4 µm Transparent PET Membrane |
| Collagenase Type 1 | Worthington Biochemical | LS004196 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Corning | 10-013-CV | 4.5 g/L glucose |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher | 16140-071 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Hanks’s buffered saline solution | Gibco | 14170-112 | No calcium, no magnesium |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15-140-122 | |
| Pogassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5379 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Sodium chloride (Nacl) | EMD | CAS 7647-14-5 | |
| Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) | Sigma-Aldrich | S0751 | |
| Trypsin | Gibco | 27250-042 |
References
- Lucas, A. M., Stettenheim, P. R. Avian anatomy: Integument part I and part II. Agriculture Handbook. 362, Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture, Washington D.C.. (1972).
- Sengel, P. In Morphogenesis of Skin, l-277. , Cambridge Univ. Press. New York. (1976).
- Dhouailly, D., Wilehm Roux, Formation of cutaneous appendages in dermo-epidermal recombinations between reptiles, birds and mammals. Archives of Developmental Biology. 177 (4), 323-340 (1975).
- Jiang, T. -X., Chuong, C. -M. Mechanism of feather morphogenesis: I. Analyses with antibodies to Adhesion Molecules Tenascin, N-CAM and Integrin. Developmental Biology. 150 (1), 82-98 (1992).
- Li, A., et al. Shaping organs by a Wnt / Notch / non-muscle myosin module which orients feather bud elongation. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 110 (16), E1452-E1461 (2013).
- Li, A., et al. Calcium oscillations coordinate feather mesenchymal cell movement by SHH dependent modulation of gap junction networks. Nature Communications. 9 (1), 5377 (2018).
- Ting-Berreth, S. A., Chuong, C. M. Local delivery of TGF beta2 can restore epithelium dependent organization of mesenchymal condensation during skin appendage morphogenesis. Developmental Biology. 179 (2), 347-359 (1996).
- Widelitz, R. B., Jiang, T. -X., Noveen, A., Chen, C. -W. J., Chuong, C. -M. FGF induces new feather buds from developing avian skin. Journal of Investigation Dermatology. 107 (6), 797-803 (1996).
- Rawles, M. E. Tissue interactions in scale and feather development as studies in dermal-epidermal recombinations. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 11, 765-789 (1963).
- McAleese, S. R., Sawyer, R. H. Correcting the phenotype of the epidermis from chick embryos homozygous for the gene scaleless (sc/sc). Science. 214 (4524), 1033-1034 (1981).
- Chuong, C. M., Widelitz, R. B., Ting-Berreth, S., Jiang, T. X. Early events during avian skin appendage regeneration: dependence on epithelial-mesenchymal interaction and order of molecular reappearance. J Invest Dermatol. 107 (4), 639-646 (1996).
- Jiang, T. X., et al. Global feather orientations changed by electric current. iScience. 24 (6), 102671 (2021).
- Jiang, T. X., Jung, H. S., Widelitz, R. B., Chuong, C. M. Self-organization of periodic patterns by dissociated feather mesenchymal cells and the regulation of size, number and spacing of primordia. Development. 126 (22), 4997-5009 (1999).
- Hamburger, V., Hamilton, H. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 188, 49-92 (1951).
- Chen, Y. P., et al. Conservation of early odontogenic signaling pathway in Aves. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 97 (18), 10044-10049 (2000).
- Chuong, C. -M., Ting, S. A., Widelitz, R. B., Lee, Y. S. Mechanism of Skin Morphogenesis: II. Retinoic acid gradient modulates axis orientation and phenotypes of skin appendages. Development. 115 (3), 839-852 (1992).
- Noveen, A., Jiang, T. -X., Chuong, C. -M. Protein kinase A and protein kinase C modulators have reciprocal effects on mesenchymal condensation during skin appendage morphogenesis. Developmental Biology. 171 (2), 677-693 (1995).
- Wu, X. S., et al. Self-assembly of biological networks via adaptive patterning revealed by avian intradermal muscle network formation. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 116 (22), 10858-10867 (2019).
