Summary
במאמר זה אנו מתארים פרוטוקולים לשלושה סוגים של תרביות צמחי עור עובריים של עופות שניתן להשתמש בהם כדי לבחון אינטראקציות בין רקמות, סרט צילום בהילוך מהיר של הדמיה 4D (3D plus time), הפרעה גלובלית או מקומית של תפקוד מולקולרי ואפיון ביולוגיה של מערכות.
Abstract
עור העופות המתפתח במהלך האמבריוגנזה הוא מודל ייחודי שיכול לספק תובנות חשובות על דפוסי רקמות. כאן מתוארות שלוש וריאציות על תרביות צמחי עור כדי לבחון היבטים שונים של התפתחות העור. ראשית, תרביות איברים ומניפולציות אקס ויו מציעות לחוקרים הזדמנויות להתבונן ולחקור את התפתחות ניצני הנוצות ישירות. תרבית צמחי העור יכולה לגדול במשך 7 ימים, מה שמאפשר ניתוח ישיר של התנהגות התא והדמיה 4D במרווחי זמן במהלך תקופת גדילה זו. זה גם מאפשר מניפולציות פיזיות ומולקולריות של תנאי תרבית כדי לדמיין את תגובת הרקמות. לדוגמה, ניתן ליישם חרוזים מצופים בגורם גדילה באופן מקומי כדי לגרום לשינויים בדוגמת הנוצות באזור מוגבל. לחלופין, התמרה ויראלית יכולה להיות מועברת ברחבי העולם במדיה התרבית כדי להעלות או להוריד את ביטוי הגנים. שנית, פרוטוקול רקומבינציית העור מאפשר לחוקרים לחקור אינטראקציות רקמה בין האפידרמיס למזנכימה שמקורן באזורי עור שונים, שלבי חיים שונים או ממינים שונים. זה נותן הזדמנות לבחון את חלון הזמן שבו האפיתל מוכשר להגיב לאותות ואת יכולתו ליצור נספחי עור שונים בתגובה לאותות ממקורות מזנכימליים שונים. שלישית, בנייה מחדש של העור באמצעות תאי עור מנותקים המכוסים באפיתל שלם מאפסת את התפתחות העור ומאפשרת לחקור את התהליכים הראשוניים של דפוסים תקופתיים. גישה זו גם משפרת את יכולתנו לתמרן את ביטוי הגנים בין התאים המנותקים לפני יצירת צמח העור המשוחזר. מאמר זה מספק את שלושת פרוטוקולי התרבות וניסויים לדוגמה כדי להדגים את תועלתם.
Introduction
התפתחות עור עובר העופות היא מודל מצוין לחקר מנגנוני המורפוגנזה בגלל הדפוסים השונים והנגישות למיקרו-כירורגיה ומניפולציה 1,2. עם זאת, הערכת אירועים תאיים ומולקולריים ברקמות שלמות יכולה להיות קשה מכיוון שנוכחות של רקמות חיצוניות יכולה לסבך תצפיות מיקרוסקופיות. יתר על כן, היכולת לתמרן ביטוי גנים כדי לבחון את תפקידם במורפוגנזה של העור אינה תמיד משימה פשוטה. אנו מוצאים שאנו יכולים לבדוק תפקודי גנים באמצעות התמרה רטרו-ויראלית עם שיעור הצלחה גבוה יותר באמצעות מודלים של צמחי עור. כאן אנו דנים ביתרונות של שלושה מודלים explant העור שפותחו.
תרבית עור עופות עוברית היא מערכת רבת עוצמה להערכת התנהגות תאים, בקרת גנים ותפקוד במהלך התפתחות ניצני נוצות העור 3,4,5,6. הוא מאפשר להעריך את המנגנונים המולקולריים של התפתחות ניצני הנוצות באמצעות הוספה גלובלית של גורמי גדילה המוצבים במדיה התרבותית או שחרורם המקומי מחרוזים מצופים גורמי גדילה. ניתן גם לתפעל גנים רגולטוריים התפתחותיים באמצעות התמרה של גנים נגיפיים של צורות שליליות שלמות או דומיננטיות עבור מחקרים פונקציונליים המעריכים את תפקידם באירועים מורפוגנטיים ספציפיים 7,8.
תרבית רקומבינציה אפיתל-מזנכימלית של עופות מאפשרת לחוקרים לקבוע את תרומתו של כל מרכיב עור בשלבים המוקדמים של מורפוגנזה של העור. השימוש של רולס בגישה זו גילה כי יחסי הגומלין בין המזנכימה והאפיתל חיוניים ליצירת נספחי עור9. המזנכימה יכולה ליצור עיבויים והאפיתל נחוץ כדי לגרום ולתחזק תצורות עיבוי מזנכימליות2. מאוחר יותר, גישה זו שימשה כדי להעריך מדוע תרנגולות חסרות קשקשים אינן מצליחות ליצור נוצות. הפגם התגלה במזנכימה10. Dhouailly ביצע מחקרי רקומת רקמה אפיתל-מזנכימלית בעוברים ממינים שונים. מחקרים אלה סיפקו תובנות התפתחותיות ואבולוציוניות על תקשורת אפיתל-מזנכימלית המקדמת מורפוגנזה של העור3.
מחקר זה שימש להבנה טובה יותר של גורמים השולטים בצמיחת נוצות. השיטה גם משפרת את ההדמיה של אירועים תאיים ומולקולריים המעורבים בעיצוב העור המתרחשים במהלך ייזום נוצות, התפתחות והתארכות לאורך הציר הקדמי-אחורי. כאשר האפיתל מופרד מהמזנכימה ושני המרכיבים משולבים מחדש, אינטראקציות חדשות מבססות מחדש את דפוסי העור. גישה זו מאפשרת לנו להעריך אותות מעוררי מזנכימליה ומולקולות כשירות אפיתל המאפשרות לאפידרמיס להגיב לאותות המזנכימליים11. ניתן לבחון גם את הביטוי המולקולרי העוקב במורד הזרם הדרוש להתפתחות ניצני נוצות וליצירת תבניות. מחקרים אלה קבעו כי מיקום הניצנים נשלט על ידי המזנכימה. סיבוב של אפיתל 90o לפני recombination עם mesenchyme מדגים כי כיוון התארכות ניצן נוצה נשלט על ידי אפיתל. שיטה זו הייתה חיונית עבורנו כדי לחקור את המנגנון המולקולרי המווסת את כיוון ניצני הנוצות12.
תרבית בנייה מחדש של עור העופות, שבה מזנכימה של העור מנותקת לתאים בודדים לפני ציפוי בצפיפות תאים גבוהה ומכוסה באפיתל שלם, מאפסת את תאי העור למצב קדמוני. לאחר מכן האקספלנט מתארגן בעצמו כדי ליצור תבנית מחזורית חדשה שאינה תלויה ברמזים הקודמים13. מודל זה של בנייה מחדש של העור יכול לשמש לחקר התהליכים הראשוניים של דפוס תקופתי נוצות. השתמשנו בגישה זו כדי לחקור כיצד אפנון היחס בין תאים מזנכימליים לחתיכה אחת של אפיתל יכול להשפיע על גודל או מספר ניצני נוצות. נמצא כי מספר הניצנים גדל, אך לא גודל הניצנים, ככל שהיחס בין התאים המזנכימליים גדל. יתרון נוסף לגישה זו הוא שהתמרה נגיפית של תאים מזנכימליים מראה יעילות גבוהה יותר מאשר בשני תנאי התרבית האחרים ויכולה לייצר פנוטיפים ברורים יותר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. תרבית צמחילת עור עוף (איור 1)
- לדגור על ביצי תרנגולות מופרות באינקובטור לח בטמפרטורה של 38 מעלות צלזיוס ולשלב אותן על פי המבורגר והמילטון14.
- בשלב 28 (~E5.5), הספרה השנייה והבוהן השלישית של הגפה ארוכות יותר מהאחרות; שלוש ספרות וארבע בהונות מובחנות.
- בשלב 29 (~E6), הכנף כפופה במרפק; הספרה השנייה ארוכה באופן מובהק מהאחרות.
- בשלב 30 (~E6.5), שתי שורות ניצני נוצה גביים משני צדי חוט השדרה נראות ברמה הברכיאלית ושלוש שורות נראות בגובה הרגליים.
- בשלב 31 (~E7), יש ~ 7 שורות של נוצות ברמות הג'מבו-סקרל.
- בשלב 32, אחת עשרה שורות או יותר של ניצני נוצות נמצאים בגובה הרגליים.
- הניחו עובר עוף שלב 28-32 בצלחת פטרי בקוטר 60 מ"מ המכילה תמיסת מלח חוצצת של הנקס (HBSS) או מלח חוצץ פוספט (PBS).
- נתחו את העור הגבי העוברי בין הצוואר התחתון לאזור הזנב. השתמש מספריים כדי להסיר את הראש מהצוואר. משכו בעדינות את ניצני הגפיים כדי למקם את הצד הגחוני של הגוף כלפי מטה כאשר התוספתן מתפשט כלפי חוץ.
- בצע חתך קדמי עד אחורי בעור לאורך שני הצדדים של גוף העובר באמצעות מלקחיים של שען או מספריים קפיציים חדים. הקפד לייצב את הגוף עם זוג מלקחיים על ידי צביטת ניצני הגפיים לאורך. מקלפים בעדינות את העור מהצוואר לאזור הזנב או מהזנב לצוואר באמצעות מלקחיים של שען.
- מסירים בעדינות את הרקמות התת עוריות שנותרו מחוברות לעור המקולף ומחליקים את קצוות העור בעזרת מספריים קפיציים חדים.
- הוסף 2 מ"ל / באר של מדיום הנשר המעובד של דולבקו (DMEM) בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי (FBS) ותמיסת פניצילין/סטרפטומיצין (מדולל 1:100) לבאר בצלחת של 6 בארות. לאחר הוספת המדיום והאנטיביוטיקה, מניחים בתוך הבאר תוספת תרבית רקמה סטרילית, כך שהמדיה נמצאת בצד החיצוני של תוספת התרבית.
- מעבירים את העור עם מרית לתרבית עם האפידרמיס עם הפנים כלפי מעלה והמזנכימה עם הפנים כלפי מטה על קרום ההחדרה. כדי להבטיח שהעור יהיה שטוח ללא קמטים, משכו את העור אל המרית ב-HBSS. להחליק את העור מן המרית עם הנוזל כדי להקל על העברת העור ללא קיפול.
- הסר עודפי HBSS מהתרבית עם פיפטה של 200 μL. השאירו שכבה דקה של HBSS בתוך תוספת התרבית כדי לשמור על הצמח רטוב למחצה כדי לספק ממשק אוויר-נוזל.
- יש לדגור על תרביות צמחי העור בטמפרטורה של 37°C תוך שימוש ב-5%CO2 ו-95% אוויר. שנה את המדיום כל יומיים.
הערה: הליך זה פורסם4. מערכת תרבית זו יכולה לשמש גם עם העור של ציפורים אחרות כגון שליו או פרוש עור פרוש תרביות.
2. רקומבינציה אפיתל-מזנכימלית של עור עוף (איור 2)
- לדגור על ביצי תרנגולות מופרות באינקובטור לח ב 38 מעלות צלזיוס ולשלב את העוברים על פי המבורגר והמילטון14 (סעיף 1.1).
- הכינו 2 סוגי מלח ללא סידן מגנזיום (CMF) עם מאגר של 0.25% חומצה אתילאנדיאמין-טטראצטית (EDTA).
- יצירת חיץ CMF 10x (NaCl (1.37 מטר) 80 גרם, KCl (0.04 מטר) 3 גרם, NaH2PO4 (0.004 מטר) 0.5 גרם, KH2PO4 (2 מטר) 0.25 גרם, NaHCO3 (0.12 מטר) 10 גרם, גלוקוז (0.1 מטר) 20 גרם ב-1,000 מ"ל מים מזוקקים. התאם את ה- pH ל- 7.3. כדי לייצר 100 מ"ל של 2x CMF עם חיץ EDTA 0.25%, יש להמיס תחילה את ה- EDTA ב- 80 מ"ל מים מזוקקים, ולאחר מכן להוסיף 20 מ"ל של חיץ CMF 10x כדי ליצור 2x CMF עם פתרון עבודה של 0.25% EDTA.
- יש לנתח קליפות גביות של עוברי תרנגולות בשלב 30-32 ב-HBSS כמתואר לעיל (סעיף 1.2) ולדגור עליהן במי מלח CMF 2x עם 0.25% EDTA על קרח למשך 15-20 דקות.
- הפרידו בזהירות את האפיתל והמזנכימה באמצעות מלקחיים של שען. מעבירים את האפיתל והמזנכימה המופרדים לצלחת נקייה המכילה HBSS.
- שלבו מחדש את האפיתל עם המזנכימה על ידי הנחת המזנכימה תחילה על צלחת פטרי המכילה HBSS, ולאחר מכן הניחו את האפיתל על גבי המזנכימה. מקם את האפיתל לאורך אותו ציר קדמי-אחורי כמו המזנכימה או סובב את האפיתל 90o מהציר הקדמי-אחורי של המזנכימה כדי לקבוע איזה מרכיב מווסת היבטים שונים של מורפוגנזה של העור.
- מעבירים את הקליפות המשולבות מחדש לתוספות תרבית בצלחות תרבית של 6 בארות לגדילה ומסירים עודפי HBSS סביב העור המחודש.
- מניחים 2 מ"ל של מדיום תרבית DMEM עם 10% FBS בבאר מחוץ לתוספת. הניחו שכבה דקה של DMEM בתוך תא ההחדרה כדי לשמור על העציץ רטוב למחצה כדי לספק ממשק אוויר-נוזל.
- יש לדגור על רקומביננטים בעור בטמפרטורה של 37°C בתערובת של 5%CO2 ו-95% אוויר. שנה את המדיום כל יומיים. תעדו שינויים פנוטיפיים בשלבי העור הראשוניים של התפתחות העור באמצעות צילום בהילוך מהיר עם מצלמה המותקנת על מיקרוסקופ מנתח.
הערה: הליך זה פורסם11.
3. בנייה מחדש של עור עוף (איור 3)
- לדגור על ביצי תרנגולות מופרות באינקובטור לח ב 38 מעלות צלזיוס ולשלב את העוברים על פי המבורגר והמילטון14 (סעיף 1.1).
- לנתח שלב 30-33 עורות עוברי תרנגולת ב- HBSS. יש לדגור על הקליפות במי מלח 2x CMF עם 0.25% EDTA על קרח למשך 15-20 דקות כמתואר לעיל (סעיף 2.3).
- הפרידו בזהירות את האפיתל והמזנכימה באמצעות מלקחיים של שען. מעבירים את האפיתל והמזנכימה המופרדים ל-HBSS על קרח.
הערה: היזהר שלא לפגוע בשכבת הבסיס של האפיתל בעת הפרדת האפיתל מהמזנכימה. - יש לאסוף את המזנכימה המופרדת בצינור צנטריפוגה בנפח 15 מ"ל ולדגור על תמיסת קולגן/טריפסין 0.1% המיוצרת ב-PBS באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 10-15 דקות.
- לנתק את mesenchyme העור עם פיפט פסטר כדי להפוך את ההשעיה תא יחיד. הוסף DMEM עם 10% FBS כדי לעצור את העיכול.
- גלולה וצנטריפוגה את התאים ב 233 × גרם במשך 5 דקות. השהה מחדש את התאים עם מדיום תרבית בריכוז של 2 × 107 תאים / מ"ל.
הערה: בשלב זה, ניתן גם להשעות מחדש את התאים המזנכימליים בתווך המכיל וירוס למשך 2-3 שעות על קרח לצורך העברת גנים. - מניחים תרבית תאים בבאר אחת של צלחת 6 בארות. טיפה 10 μL של 2 × 107 תאים / mL תאים מזנכימליים על תרבית הרקמה להוסיף. מניחים 2 מ"ל של מדיום תרבית DMEM עם 10% FBS בבאר מחוץ לתוספת. יש לדגור על התאים המזנכימליים המצופים בטמפרטורה של 37°C באמצעות אינקובטור אוויר של 5%CO2 ו-95% למשך שעה אחת כדי לאפשר לתאים להתיישב על קרום ההחדרה.
- מעבירים את האפיתל השלם על גבי הטיפה המזנכימלית המצופה כאשר שכבת תאי הבסיס של האפיתל פונה לתאים המזנכימליים באמצעות פיפט 1 מ"ל.
הערה: בעת העברת אפיתל לטיפה המזנכימלית, אין להפריע לתאים המזנכימליים. - משטחים את האפיתל השלם מעל המזנכימה כדי לגרום לעור המשוחזר לצמח. השאירו שכבה דקה של המדיום על האינסרט כדי לשמור על העור המשוחזר חצי-רטוב כדי לספק ממשק אוויר-נוזל. יש לדגור על העור המשוחזר בטמפרטורה של 37°C באינקובטור אוויר של 5%CO2 ו-95%. שנה את המדיום כל יומיים.
הערה: הליך זה פורסם13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תרביות צמחי עור
התפתחות ניצני נוצות מתרביות איברי עור ex vivo ניתן לצפות ישירות תחת המיקרוסקופ. באמצעות מודל תרבית צמחי העור של עור הגב בשלב 30 של עוף, הפלקודים נראים לאורך קו האמצע. לאחר מכן החזית המורפוגנטית מתפשטת בהדרגה לרוחב לכיוון פריפריית העור עם היווצרות פרימורדיה חדשה של נוצות. קדמוניות הנוצות האלה יתפתחו לניצני נוצות קצרים לאחר יומיים בתרבית ולניצני נוצות ארוכים לאחר 4 ימים בתרבית (איור 1).
תרביות רקומבינציה של העור
עבור רקומבינציה של העור, כאשר אפיתליה ומזנכימה משולבים מחדש, הפלקודים המקוריים נעלמים. פלקודים חדשים יופיעו זמן קצר לאחר רקומבינציה ויפתחו ליצירת ניצני נוצות קצרים וניצני נוצות ארוכים לאחר יומיים וארבעה ימים בתרבית, בהתאמה. אם מסובבים את האפיתל ב-90° ביחס למזנכימה, כיוון הניצנים המתארכים ייקבע על-ידי האפיתל (איור 2).
תרבויות לבנייה מחדש של העור
עבור בנייה מחדש של העור, תרביות האיברים ex vivo נראות הומוגניות בהתחלה, ולאחר מכן עיבויים עוריים עם מרווח שווה טופס בו זמנית לאחר יום אחד בתרבית. יש לציין כי מספר ניצני הנוצות תלוי במספר התאים המזנכימליים. מספרים מזנכימליים נמוכים יותר גרמו לפחות ניצנים בגודל דומה להיווצרות11. ניצני נוצות קצרים ייווצרו לאחר 2-3 ימים בתרבית, וניצני נוצות ארוכים ייווצרו לאחר 4-5 ימים בתרבית (איור 3).
איור 4 מציג דיאגרמות סיכום של תרבית איברי עור ex vivo , תרבית איברי רקומבינציה של העור ותרבית איברים של בנייה מחדש של העור.
איור 1: תרבית איברי עור Ex vivo . עור עובר עוף שלב 32 מנותח בHBSS ומתורבת בתוספות תרבית 6 בארות (T0, בזמן 0) במשך 2 ו -4 ימים. פרימורדיה הנוצה מתפתחת לניצני נוצות קצרים לאחר יומיים בתרבית ולניצני נוצות ארוכים לאחר 4 ימים בתרבית. Placodes עורי מסומנים על ידי החץ הלבן. שימו לב שהניצנים בקו האמצע בוגרים יותר מאלה שבשני הצדדים הרוחביים. שיטה זו שונתה מג'יאנג וצ'ואונג4. סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר. קיצור: HBSS = תמיסת מלח חוצצת של האנק. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: תרבית איברים רקומבינציה של עור Ex vivo . עור עובר עוף שלב 32 מנותח ב- HBSS, ואפיתל ומזנכימל מופרדים בחיץ CMF 2x. אפיתל העור ו mesenchyme משולבים מחדש עם או בלי סיבוב בתרבית במשך 2 ימים ו 4 ימים. הפלקודים החדשים מתפתחים לניצני נוצות קצרים וארוכים לאחר יומיים וארבעה בתרבית. אם האפיתל מסובב 90° ביחס למזנכימה, כיוון הניצנים החדשים נקבע על ידי אפיתל12. שיטה זו שונתה מ Chuong et al.11. סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר. קיצור: CMF = ללא סידן-מגנזיום. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: תרבית איברים לבנייה מחדש של העור Ex vivo . עור עובר עוף שלב 32 מנותח, ואפיתל ומזנכימה מופרדים בחיץ CMF 2x. המזנכימה מופרקת לתאים בודדים על ידי 0.1% קולגנאז וטריפסין וגלולה בצפיפות תאים גבוהה על תוספת תרבית. גלולת תאי העור משוחזרת עם אפיתל שלם (T0, בזמן 0) ומתורבית במשך 6 שעות, יומיים ו -5 ימים. הצמחים נראים הומוגניים בהתחלה (6 שעות) ולאחר מכן עיבוי עורי עם מרווח שווה טופס בו זמנית לאחר יום אחד בתרבית. ניצני נוצות קצרים ייווצרו לאחר 2-3 ימים בתרבית וניצני נוצות ארוכים ייווצרו לאחר 4-5 ימים בתרבית. שיטה זו שונתה מ-Jiang et al.13. סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: דיאגרמות של מודלים של תרביות איברי עור ex vivo. העור מתחיל ב-E6.5 כשכבה אחת של אפיתל המכסה תאים מזנכימליים. זה מתואר בראש שלוש שיטות explant. (A) תרבית איברי עור Ex vivo. העור מצופה בשלמותו על גבי תוספת תרבית באוויר: ממשק מדיה ב-37°C באינקובטור אוויר של 5%CO2 ו-95%. (B) תרבית איברים רקומבינציה של עור Ex vivo. אפיתל העור מופרד מהמזנכימה ולאחר מכן משולב מחדש לפני הציפוי על תרבית התא הכנס באוויר: ממשק מדיה ב 37 ° C באינקובטור אוויר 5% CO2 ו 95% אוויר. (C) תרבית איברים לבנייה מחדש של העור Ex vivo. אפיתל העור מופרד מהמזנכימה. לאחר מכן מפרקים את המזנכימה לתרחיף חד-תאי והתאים המזנכימליים מוכנסים לצנטריפוגה. התאים המזנכימליים מושהים מחדש בריכוז של 2 × 10,7 תאים/מ"ל ו-10 מיקרוליטר של התרחיף המונחים על עלון התרבית ולאחר מכן מכוסים בחתיכה שלמה של אפידרמיס. התרבית מודגרת באוויר: ממשק מדיה ב 37 ° C בחממה 5% CO2 ו 95% אוויר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור משלים S1: התמרה של תאי מזנכימה עם וירוס המבטא GFP. תאים מזנכימליים מנותקים (2 × 10,7 תאים/מ"ל) הודגרו במשך 3 שעות על קרח עם >107 יחידות זיהומיות / מ"ל נגיף סרקומה של עופות בעל יכולת שכפול המבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP). התאים המזנכימליים שימשו ליצירת תרביות איברי עור משוחזרות כמתואר בסעיף 3 לעיל וצולמו 24 שעות מאוחר יותר. הנתונים מראים כי ~ 40% מהתאים המזנכימליים היו מסומנים עם GFP. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
רקומבינציה רקמות מספק בדיקה כדי לחקור את התרומות הייחודיות של אפיתל ו mesenchyme. בתרנגולות, הנוצות מתחילות להתפתח ביום העוברי 7 (E7) ואילו הקשקשים מתחילים ב-E9. כאשר מזנכימה בקנה מידה E9 משולבת מחדש עם אפיתל נוצות E7, הרקמה המשולבת מחדש יוצרת קשקשים, וכאשר מזנכימה נוצה E7 משולבת מחדש עם נוצות אפיתל בקנה מידה E9 נוצרות11. מחקרים אלה הוכיחו כי המזנכימה שולטת בריווח היווצרות הדפוסים ובזהות האיברים. כמובן, אפיתל חייב להיות מוכשר כדי להיות מסוגל לקבל ולפרש את האותות mesenchymal כראוי. היכולת קיימת רק באפיתל למרווח זמן קצר. בניגוד לתוצאות לעיל, באופן מפתיע כאשר רירית הפה עוף ואפיתל E5 aboral משולבים מחדש עם mesenchyme גזע E8, אפיתל aboral יוצר נוצות; עם זאת, רירית הפה יוצרת נספחים דמויי שיניים מרובים15. זה מראה כי בעוד שמזנכימת גזע העור מכוונת את אפיתל הבטן לייצר נוצות, לאפיתל הפה אין את היכולת לייצר נוצות והוא יכול רק לייצר שיניים. אפיתל אוראלי במחקר זה עשוי כבר להיות מחויב ליצירת שיניים ב E5. הכלאה באתר, RNAscope, ו immunostaining ניתן להשתמש כדי לאשר ביטוי מולקולרי ב explants recombined כדי לאמת את הזהות של רקמות שנוצרות. באמצעות בדיקה זו, הפרעות ניתן לכוון באופן ספציפי אפיתל או mesenchyme.
מבנה מחדש של רקמות מאפס תאים בתוך המזנכימה למצב לא מחויב. עור נוצות E7-E8 החל ליצור עיבויים מזנכימליים במערכת העיכול הגבית לפני ניתוק העור והמזנכימה מנותקת לתאים בודדים. על ידי תיוג תאי אפיתל או מזנכימליים באזורי הניצן הקדמוני או הבין-ניצני, תאי העור יכולים להימצא בתוך ניצנים או מחוצה להם ללא קשר למיקומם הקודם. בצפיפות תאים מזנכימלית נמוכה, צמחי העור המשוחזרים יוצרים מעט ניצני נוצות בגודל רגיל. ככל שצפיפות התאים המזנכימליים גדלה, מספר הניצנים גדל עד להשגת צפיפות אריזה מקסימלית13. נתונים אלה מצביעים על כך שהתאים מתוכנתים מחדש באמצעות אובדן קשר עם שכניהם הראשוניים ועוברים סבב חדש של היווצרות דפוסים. תרבויות אלה מפתחות גם עיבויים וקדמוניות נוצות. באופן מעניין, ניצנים נוצרים בו זמנית על פני העור, בניגוד להתפשטות ההדרגתית של היווצרות ניצנים הנראית בצמחי עור ובצמחי עור משולבים מחדש. שיטה זו מאפשרת תצפית ומניפולציה של אינטראקציות תאי ומולקולריות של העור בשלב מוקדם. ביטוי מולקולרי ניתן להעריך בתרבות באמצעות מבחני מקדם-כתב. בנייה מחדש בין קווים טרנסגניים או נוקאאוט יכולה לעזור לנתח עוד יותר את תפקידי המולקולות בתהליך עיצוב העור. התמרה ויראלית משופרת בתאים מזנכימליים מנותקים ולעתים קרובות יכולה לייצר הפרעה מוגברת.
בעוד שכל אחת מהגישות הניסיוניות הללו יכולה לסייע לחוקרים לחקור אירועים תאיים ומולקולריים המתרחשים במהלך מורפוגנזה של העור. לעתים קרובות אנו משתמשים בכל אחת מהגישות הללו ורואים איזו מהן מספקת את התובנות הטובות ביותר. לאחר מכן ניתן להמשיך לחקור את הממצאים בתנאי תרבית אחרים או באמצעות עוברים שלמים.
מגבלות גישות אלה
כל אחד משלושת המבחנים הללו מספק תוצאות הניתנות לשחזור ברמה גבוהה. עם זאת, מכיוון שבדיקות אלה עשויות להגיב לאותה הפרעה בדרגות שונות, לעתים קרובות כדאי להפריע לתנאים באמצעות כל שלושת המבחנים אם לא נתקלו בשינויים בתחילה. למרות שתרבית עציץ העור מספקת מודל טוב להיווצרות מוקדמת של תבניות עור והתפתחות תוספתן העור, ניתן לתרבית את החציל רק למשך ~ שבוע. זה מונע את השימוש בהם בהתפתחות תוספתן עור מאוחרת יותר, למשל, תהליך היווצרות פפילה עורית ומורפוגנזה של זקיקים למרות שהנהלים משתפרים לתרבית צמחים אלה זמן רב יותר. נכון להיום, בזמנים מוקדמים לאחר יצירת צמחי עור משוחזרים, התאים מחוברים באופן רופף למצעים שלהם, מה שהופך ניתוחים המשתמשים במספר שטיפות, כגון הכלאה באתר , לקשים. תרבויות אלה קושרות את המצע שלהן חזק יותר על ידי 24 שעות שבהן נוצרו עיבויים ברחבי התרבות.
עור עוברי עופות מספק מודל מצוין לחקר התפתחות נספחי העור. לתרביות צמחי עור יש יתרון בכך שהן מאפשרות מניפולציה של תנאי התרבית שבהם גדלות תרביות איברי העור ex vivo. הוא גם מאפשר הדמיה ארוכת טווח של התפתחות בהילוך מהיר כדי לראות את התפשטות הניצנים מקו האמצע לקצוות הרוחביים לאורך זמן. בנוסף, ניתן להתחיל את התרבית באמצעות שלבים עובריים שונים כדי לחקור אירועים שונים בדפוס נוצות וצמיחה. ליצירת תבניות תקופתיות, ניתן לגדל עור בתרבית החל מ-E6 ולגדל בתרבית במשך 4 ימים. עבור מורפוגנזה של זקיק נוצות, ניתן להתחיל את התרבית ב- E8 ולגדל בתרבית במשך 4 ימים. קשה לנתח עור בשלבים שלפני E6. עם תרביות explant, הפרעות גלובליות יכולות להיעשות על ידי הוספת גורמי גדילה או מעכבי לעור explant תרבית בינוני 8,16,17. הפרעה מקומית לעור יכולה להיות מושגת על ידי הנחת חרוזים מצופים חלבון על העור explant או על ידי התמרה נגיפית תאים כדי לווסת ביטוי גנים 8,16,17. תרביות Explant מאפשרות הדמיה של התנהגות תאים קולקטיבית כגון פעילויות סידן6 ויישום כוחות ביופיזיים כגון מתח רקמות18 או זרמים חשמליים12. שיטות אלה מציעות הזדמנויות נהדרות לספק תובנות חדשות לגבי הגורמים המווסתים דפוסי איברים תקופתיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכת על ידי מענק NIH NIAMS R37 AR 060306, R01 AR 047364 ו-RO1 AR078050. העבודה נתמכת גם על ידי חוזה מחקר משותף בין USC והאוניברסיטה הרפואית של סין בטייוואן. אנו מודים למחלקת USC BISC 480 Developmental Biology 2023 על בדיקה מוצלחת של פרוטוקול תרבית עור עופות זה במהלך מספר מודולי מעבדה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well culture dish | Falcon | REF 353502 | Air-Liquid Interface (ALI) Cultures |
| Cell culture inset | Falcon | REF 353090. | 0.4 µm Transparent PET Membrane |
| Collagenase Type 1 | Worthington Biochemical | LS004196 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Corning | 10-013-CV | 4.5 g/L glucose |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher | 16140-071 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Hanks’s buffered saline solution | Gibco | 14170-112 | No calcium, no magnesium |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15-140-122 | |
| Pogassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5379 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Sodium chloride (Nacl) | EMD | CAS 7647-14-5 | |
| Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) | Sigma-Aldrich | S0751 | |
| Trypsin | Gibco | 27250-042 |
References
- Lucas, A. M., Stettenheim, P. R. Avian anatomy: Integument part I and part II. Agriculture Handbook. 362, Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture, Washington D.C.. (1972).
- Sengel, P. In Morphogenesis of Skin, l-277. , Cambridge Univ. Press. New York. (1976).
- Dhouailly, D., Wilehm Roux, Formation of cutaneous appendages in dermo-epidermal recombinations between reptiles, birds and mammals. Archives of Developmental Biology. 177 (4), 323-340 (1975).
- Jiang, T. -X., Chuong, C. -M. Mechanism of feather morphogenesis: I. Analyses with antibodies to Adhesion Molecules Tenascin, N-CAM and Integrin. Developmental Biology. 150 (1), 82-98 (1992).
- Li, A., et al. Shaping organs by a Wnt / Notch / non-muscle myosin module which orients feather bud elongation. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 110 (16), E1452-E1461 (2013).
- Li, A., et al. Calcium oscillations coordinate feather mesenchymal cell movement by SHH dependent modulation of gap junction networks. Nature Communications. 9 (1), 5377 (2018).
- Ting-Berreth, S. A., Chuong, C. M. Local delivery of TGF beta2 can restore epithelium dependent organization of mesenchymal condensation during skin appendage morphogenesis. Developmental Biology. 179 (2), 347-359 (1996).
- Widelitz, R. B., Jiang, T. -X., Noveen, A., Chen, C. -W. J., Chuong, C. -M. FGF induces new feather buds from developing avian skin. Journal of Investigation Dermatology. 107 (6), 797-803 (1996).
- Rawles, M. E. Tissue interactions in scale and feather development as studies in dermal-epidermal recombinations. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 11, 765-789 (1963).
- McAleese, S. R., Sawyer, R. H. Correcting the phenotype of the epidermis from chick embryos homozygous for the gene scaleless (sc/sc). Science. 214 (4524), 1033-1034 (1981).
- Chuong, C. M., Widelitz, R. B., Ting-Berreth, S., Jiang, T. X. Early events during avian skin appendage regeneration: dependence on epithelial-mesenchymal interaction and order of molecular reappearance. J Invest Dermatol. 107 (4), 639-646 (1996).
- Jiang, T. X., et al. Global feather orientations changed by electric current. iScience. 24 (6), 102671 (2021).
- Jiang, T. X., Jung, H. S., Widelitz, R. B., Chuong, C. M. Self-organization of periodic patterns by dissociated feather mesenchymal cells and the regulation of size, number and spacing of primordia. Development. 126 (22), 4997-5009 (1999).
- Hamburger, V., Hamilton, H. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 188, 49-92 (1951).
- Chen, Y. P., et al. Conservation of early odontogenic signaling pathway in Aves. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 97 (18), 10044-10049 (2000).
- Chuong, C. -M., Ting, S. A., Widelitz, R. B., Lee, Y. S. Mechanism of Skin Morphogenesis: II. Retinoic acid gradient modulates axis orientation and phenotypes of skin appendages. Development. 115 (3), 839-852 (1992).
- Noveen, A., Jiang, T. -X., Chuong, C. -M. Protein kinase A and protein kinase C modulators have reciprocal effects on mesenchymal condensation during skin appendage morphogenesis. Developmental Biology. 171 (2), 677-693 (1995).
- Wu, X. S., et al. Self-assembly of biological networks via adaptive patterning revealed by avian intradermal muscle network formation. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 116 (22), 10858-10867 (2019).
