Summary
Этот протокол описывает генерацию эксплантата кожи-фасции, называемого «SCar like tissue in A Dish» или SCAD. Эта модель позволяет беспрецедентно визуализировать одиночные фибробласты при образовании рубцов.
Abstract
Глобальная реакция млекопитающих на герметизацию глубоких тканевых ран заключается в образовании рубцов и сокращении тканей, опосредованных специализированными фибробластами фасций. Несмотря на клиническое значение образования рубцов и нарушения заживления ран, наше понимание динамики фибробластов фасций в заживлении ран является поверхностным из-за отсутствия соответствующих анализов, которые позволяют непосредственно визуализировать хореографию и динамику фибробластов в сложных средах, таких как в кожных ранах. В этой статье представлен протокол для создания шрамов на коже ex-situ с использованием SCAD или «SCar-подобной ткани в чашке», которые имитируют сложную среду кожных ран. В этом анализе кожа полной толщиной 2 мм иссекается и культивируется вверх ногами в средах в течение 5 дней, в течение которых рубцы и контрактуры кожи развиваются равномерно. Эта методология в сочетании с трансгенными моделями мышей, специфичными для линии фибробластов, позволяет визуализировать отдельные линии фибробластов на протяжении всего процесса заживления ран. В целом, этот протокол помогает исследователям понять фундаментальные процессы и механизмы заживления ран, непосредственно изучая влияние модуляторов на результаты заживления ран.
Introduction
Заживление ран – это процесс восстановления нарушенных ран. Повреждения тканей у беспозвоночных приводят к частичной или полной регенерации. Напротив, млекопитающие реагируют на глубокие повреждения рубцеванием, процессом, предназначенным для быстрого уплотнения ран плотными пробками матричных волокон, которые минимизируют нарушенную область и в то же время постоянно деформируют поврежденный участок 1,2,3. Большие ожоги кожи или глубокие открытые раны у млекопитающих приводят к патологическим фенотипам, таким как гипертрофические или келоидные рубцы 4,5. Эти обильные шрамы создают огромную нагрузку на клинические и глобальные системы здравоохранения. Только в США управление шрамами стоит около 10 миллиардов долларов в год 6,7. Поэтому разработка соответствующих методологий необходима для лучшего понимания основополагающих процессов и механизмов, связанных с образованием рубцов.
В последние годы широкий спектр исследований на мышах выявил гетерогенные популяции фибробластов с различными функциональными потенциями, основанными на их происхождении в определенных местах кожи 8,9,10. В коже спины Rinkevich et al., 2015, определили, что специфическая популяция фибробластов с ранней эмбриональной экспрессией Engrailed-1 (En1), называемая EPF (Engrailed positive fibroblast), способствует кожному рубцеванию при ранении. И наоборот, другая линия фибробластов без истории энгральсированной экспрессии, энгралированный отрицательный фибробласт (ENF), не способствует образованию рубцов8. Картирование судьбы этих линий En1 с использованием cre-управляемых трансгенных линий мыши, скрещенных с флуоресцентными репортерными линиями мыши, такими как R26mTmG (En1Cre x R26mTmG), позволяет визуализировать популяции EPF и ENF.
Изучение миграции фибробластов in vivo в течение нескольких дней ограничено этическими и техническими ограничениями. Кроме того, комбинированные, вирусные и нейтрализующие экраны библиотеки антител для модуляции путей, участвующих в рубцевании, являются технически сложными. Ранее использовавшиеся модели in vitro или ex vivo не обладают способностью визуализировать миграцию фибробластов и образование рубцов в подлинных микросредах кожи, однородность в развитии рубцов, а также сложность тканей, которая имитирует in vivo кожные среды11,12. Чтобы преодолеть вышеуказанные ограничения, мы разработали анализ рубцевания ex vivo, называемый SCAD (SCar-подобная ткань в A Dish)13,14. Этот простой анализ может быть выполнен путем иссечения кожи полной толщины 2 мм, содержащей эпидермис, дерму и подкожные участки фасций, и культивирования их в сывороточных средах ДМСО на срок до 5 дней. Шрамы, полученные из SCAD, надежно реплицируют транскриптомные и протеомные признаки рубцов in vivo. Кроме того, SCAD, генерируемые соответствующими трансгенными линиями мышей (например, мышей En1), скрещенных с флуоресцентными репортерными линиями мыши, позволяют визуализировать динамику миграции фибробластов и развитие рубцов с беспрецедентным разрешением. Кроме того, эта модель может быть легко адаптирована для любых приложений с высокой пропускной способностью (например, библиотека соединений, библиотека антител или вирусный скрининг)13,14. В этой статье мы опишем оптимизированный протокол для генерации SCAD и последующих приложений последующей обработки для изучения клеточной и матричной динамики при развитии рубцов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Модель, представленная ниже, предоставляет подробное пошаговое описание генерации анализа SCAD, как кратко описано в Jiang et al., 202013. Пробоподготовка SCAD проводилась после жертвоприношения животных в соответствии с международными руководящими принципами и руководящими принципами правительства Верхней Баварии. Животные были размещены в центре для животных Центра Гельмгольца в Мюнхене. Помещения поддерживались с оптимальной влажностью и постоянной температурой с 12-часовым световым циклом. Животные снабжались пищей и водой ad libitum.
1. Подготовка тканей SCAD
- Жертвоприношение новорожденных щенков на постнатальный день 0 или день 1 (P0 или P1).
- Осторожно иссечь не менее 1,5 см х 1,5 см полной толщины спинной кожи до слоя скелетных мышц с помощью стерильного хирургического скальпеля.
- Очистите кожу с помощью стерильных изогнутых щипцов, гарантируя, что поверхностная фасция неповреждена с нижележащей мышцей panniculus carnosus.
- Промыть иссеченную ткань 50-100 мл холодной среды DMEM/F-12 для удаления загрязняющей крови.
- Вымойте один раз сбалансированным солевым раствором Хэнкса (HBSS) для поддержания жизнеспособности тканей и клеток.
- Поместите кожу вверх ногами (поверхностная фасция сверху) в 10 см чашку Петри, содержащую среду DMEM/F12.
- Используя одноразовый 2-миллиметровый биопсийный перфоратор, иссекайте круглые кусочки кожи полной толщины, гарантируя, что поверхностная фасция нетронута с подлежащей мышцей panniculus carnosus до эпидермиса для генерации тканей SCAD.
- Подготовьте и заполните 200 мкл DMEM/F12 (без фенольного красного) полной среды DMEM/F12 с добавлением 10% FBS, 1x GlutaMAX, 1x MEM заменимых аминокислот и 1x пенициллина/стрептомицина в отдельные лунки 96-луночной пластины.
- Используя стерильные щипцы, аккуратно перенесите и полностью погружайте отдельные ткани SCAD вверх ногами (фасции, обращенные вверх) в колодцы 96-луночной плиты.
- Переложите пластину в инкубатор клеточной культуры, поддерживаемый в стандартных условиях (37 °C, 21% (v/v) кислорода, 5% (v/v) C02 и влажность 95%).
2. SCAD - Культура тканей
- Культивирование SCAD в инкубаторе на срок до 5 дней.
- На 2-й и 4-й день посева замените среду 200 мкл свежей предварительно подогретой полной среды DMEM/F12 для обеспечения непрерывной жизнеспособности клеток и тканей. Заменяйте лечебные соединения во время каждой смены среды.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что в колодце остается 10 мкл среды, чтобы избежать прилипания тканей к лункам. - Подготовьте SCAD для следующих экспериментов: Живая визуализация (раздел 3) и Сбор тканей и окрашивание иммунофлуоресценции 2D / 3D (раздел 4).
3. Визуализация SCAD в реальном времени
- Приготовьте не менее 30 мл 2%-3% (мас./об.) низкоплавкого раствора агарозы в ПБС в стеклянной бутылке, нагревая его в микроволновой печи до кипения.
- Немедленно переложите флакон и охладите жидкий раствор агарозы на водяной бане с температурой 40 °C.
- Перенесите ткань SCAD с фасцией/шрамом вверх на центр 35-миллиметровой тарелки.
- Встраивайте SCAD при комнатной температуре (RT), медленно перенося жидкую агарозу 40 °C на 35-миллиметровую посуду с помощью пипетки Пастера. Агароза полимеризуется в течение 2 мин.
- Добавьте 2 мл предварительно нагретой полной среды DMEM/F12 (без индикатора фенольного красного цвета).
- Получайте покадровые снимки 0 суток ДО 48 ч с помощью конфокального или многофотонного микроскопа, оснащенного подходящей инкубационной системой, установленной на 37 °C, 21% (v/v) кислорода, 5% (v/v) C02 и влажность 95%.
4. Сбор тканей и 2D/3D иммунофлуоресцентное окрашивание
- Промывайте ткани в соответствующие моменты времени, заменяя среду стерильным PBS.
- Используя стерильные щипцы, осторожно перенесите отдельные SCAD в микроцентрифужные трубки объемом 1,5 мл, содержащие 500 мкл 2% параформальдегида, чтобы зафиксировать ткани на ночь при 4 °C.
- Трижды вымойте ткани PBS и приступайте к 2D/3D иммунофлуоресцентному окрашиванию.
- 3D иммунофлуоресцентное окрашивание
- Пермеабилизируют ткани путем инкубации в микроцентрифужной трубке объемом 1,5 мл, содержащей 500 мкл PBS, дополненной 0,2% желатина, 0,5% Triton-X100 и 0,01% тимеросала (PBSGT) при RT в течение 24 ч.
- Приготовьте достаточное количество первичных антител в соответствии с инструкциями производителя и инкубируйте ткани SCAD в 150 мкл раствора PBSGT в течение 24 ч при RT.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если оптимальная концентрация антител для иммунной флуоресценции не указана производителем, предварительное титрование антител должно быть выполнено на контрольных тканях с использованием различных концентраций (например, 1:50, 1:200, 1:500, 1:1000). - Осторожно промыть SCAD три раза PBS, чтобы удалить несвязанное первичное антитело.
- Инкубировать ткань с 1:1000 соответствующими вторичными антителами Alexa Fluor в PBS в течение ночи в RT.
- Аккуратно промыть ткань в течение 30 мин в PBS три раза, чтобы удалить излишки несвязанных вторичных антител.
- Перенесите ткань на стеклянную тарелку толщиной 35 мм для конфокальной или многофотонной визуализации.
ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании объективов погружения в воду встраивайте SCAD в агарозу с низкой температурой плавления 2%, чтобы обездвижить ткань для предотвращения дрейфа во время получения изображения
- 2D иммунофлуоресцентное окрашивание
- Перенесите ткань в криоформу и аккуратно заполните соединение оптимальной температуры резания (OCT), чтобы полностью погрузить ткань.
- Аккуратно отрегулируйте ориентацию ткани, обеспечив отсутствие пузырьков воздуха для получения поперечного сечения или вертикального сечения.
- Поместите форму на сухой лед на 20-30 мин и высиживайте блок при -80 °C в течение ночи.
- Установите температуру лезвия на -25 °C и температуру блока образца на -17 °C. Подготовьте 6-мкм криосекцию с помощью криостата, перенесите секции на адгезионный слайд и храните слайды в морозильной камере при температуре -20 °C.
- Промойте слайды три раза в PBS и инкубируйте слайды в 5% бычьем сывороточном альбумине (BSA) с / в PBST (PBS, дополненный 0,05% Tween) в течение 1 ч.
- Добавьте соответствующее количество первичного антитела к 150 мкл PGST и инкубируйте в течение ночи при 4 °C
ПРИМЕЧАНИЕ: Если оптимальная концентрация антител для иммунной флуоресценции не указана производителем, предварительное титрование антител должно быть выполнено на контрольных участках с использованием различных концентраций (например, 1:50, 1:200, 1:500, 1:1000). - Аккуратно промыть участки три раза PBS, чтобы удалить несвязанное первичное антитело.
- Инкубировать ткань с 1:1000 соответствующими вторичными антителами Alexa Fluor в PBS на ночь при RT в течение 2 ч.
- Осторожно промыть ткань в течение 5 мин в PBS три раза, чтобы удалить излишки несвязанных вторичных антител.
- Установите слайды с помощью монтажного носителя, содержащего DAPI, и высушите слайды в темноте в RT.
- Изобразите участки с помощью флуоресцентного микроскопа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Генерация SCAD может быть разделена на три основных этапа: сбор обратной кожи у мышей P0-P1, генерация биопсийных пуншей полной толщины и последующая культивирование отдельных скадов до 5 дней в 96-луночных пластинах. В качестве считывания этот анализ может быть дополнительно применен для анализа пространственных и временных аспектов рубцевания. Пространственный анализ использует 2D и 3D иммунную маркировку тканей для изучения пространственной локализации клеточных и матричных компонентов в развивающейся рубцовой ткани. Пространственно-временные исследования позволяют визуализировать эти рубцы ex-situ с использованием тканевых внутренних или внешних флуоресцентных белков, которые могут быть визуализированы с использованием соответствующих методов 3D-покадровой визуализации.
Ключевыми шагами в этом анализе являются постановка эксперимента путем тщательного создания биопсийных пуншей полной толщины, обеспечения присутствия фасциального слоя «желе» и культивирования ткани, полностью погруженной вверх ногами (эпидермис, обращенный к нижней части 96-луночных пластин). Это позволяет развивать однородные рубцы, сопоставимую динамику миграции соответствующих популяций фибробластов и сокращение кожи через SCAD (рисунок 1A). Универсальность анализа SCAD позволяет собирать ткани по всему спектру развития рубцов. Например, если целью эксперимента является изучение ранней динамики рубцевания, пространственный и пространственно-временный анализ может быть ограничен D1 или D2 культуры SCAD (рисунок 1B).
Репрезентативные изображения яркого поля SCAD в день 0 и день 5 показаны на рисунке 2A и рисунке 2A', соответственно. Для 2D-анализа важно встроить SCAD в OCT в перпендикулярной ориентации, лишенной пузырьков воздуха, чтобы обеспечить неповрежденность ткани после разрезания. Эти участки тканей могут быть дополнительно подвергнуты гистологическому анализу (например, трихромное окрашивание Массона - рисунок 2B,2B') или иммунофлуоресцентному окрашиванию (фиг.2C,2C') на криосекциях из дорсальной дермы мыши En1 Cre,R26mTmG; EPF зеленого цвета и ENF красного цвета от ранней (рисунок 2D) и поздней стадии рубца (рисунок 2D').
3D и 3D покадровая визуализация рубцов требует обнаружения флуоресцентных сигналов глубоко внутри ткани (400-800 мкм). Возбуждение в ближнем инфракрасном диапазоне с использованием двухфотонного возбуждения позволяет проводить такие измерения без необходимости очистки тканей, методологии, обычно используемой в 3D-визуализации, чтобы сделать ткань прозрачной путем минимизации рассеяния и поглощения света 15,16,17. Мы использовали вертикальный многофотонный микроскоп, оснащенный 25-кратным водоопускающим объективом в сочетании с перестраиваемым лазером. Ткани подвергали 3D-иммунному окрашиванию с использованием соответствующих зондов. Для 3D-визуализации ткань была встроена в 2% раствор агарозы с низким плавлением для иммобилизации или предотвращения дрейфа в ткани (рисунок 3A), увенчанный PBSGT, чтобы соответствовать показателю преломления, необходимому для цели погружения в воду. Репрезентативное изображение на рисунках 3B и 3B' показывает эксклюзивную локализацию белка N-Cadherin (розовый/пурпурный-Alexa fluor 647) в месте рубца 5 SCAD из кожи спины En1 Cre,R26mTmG; EPF зеленым цветом и ENF красным. Для 3D-покадровой визуализации была внесена небольшая модификация в вышеуказанную установку путем встраивания ткани в 2% раствор агарозы с низким содержанием плавления, покрытый средой DMEM / F12 без фенольного красного индикатора вместо PBS. Чтобы обеспечить правильные условия для «живой» ткани SCAD во время визуализации, была добавлена подходящая инкубационная камера, чтобы все фенотипы правильно регистрировались во время визуализации (рисунок 3C). Репрезентативные снимки ранних роев фибробластов показаны на рисунках 3D, 3D' и 3D'' на первых 12 ч/ранних стадиях развития рубца.
Рисунок 1: Схематический рабочий процесс анализа SCAD. (A) Кожа спины с постнатального дня 0 / день 1 щенки иссекаются, обеспечивая целостность ткани, содержащей следующие кожные слои: эпидермис (E), сосочковую и ретикулярную дерму (PD и RD) и слой фасции (F), за которым следуют 2 мм биопсийные удары для получения SCAD дня 0. (B) Затем SCAD могут быть впоследствии культивированы в течение 5 дней с необязательным прерывистым этапом сбора урожая / фиксации ткани на основе характера отдельных экспериментов (пунктирные стрелки) с шагом изменения культуральной среды на 2-й и 4-й день. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: 2D иммунофлуоресцентное окрашивание. Репрезентативные 2D-показания для изучения рубцов на ранних и поздних стадиях с использованием (A и A') изображения поля Bright с цельным креплением в день 0 (A) и день 5 (A'). (B и B') Трихромное окрашивание Массоном вертикальных участков ткани для выявления сигнатур сокращения тканевых рубцов и накопления ECM в ядре рубца (желтый заполненный треугольник) в день 0 (B) и день 5 (B'). (C и C') Иммунофлуоресцентный анализ SCAD дня 0 (C) и дня 5 (C'), полученный из En1Cre, R26mTmG кожи спины. EPF показаны зеленым цветом, ENF красным, а DAPI синим цветом от шрама ранней (D) и поздней стадии (D'). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Схематическая установка и репрезентативные показания SCAD для 3D-пространственного и пространственно-временного анализа. (A) Схематическое изображение встраивания SCAD в 2% агарозный гель с низкой температурой плавления под вертикальным флуоресцентным микроскопом и (B) репрезентативное изображение 3D-иммунофлуоресцентного окрашивания дня 5 SCAD, полученное из En1Cre, R26mTmG дерма мышей и иммунно окрашены N-кадгериновым антителом (Magenta). EPF показаны зеленым цветом, а ENF - красным. (C) Схематическое изображение 3D-визуализации SCAD, оснащенное инкубационной камерой: 37 °C, 21% (v/v) кислорода, 5% (v/v) C02 и 95% влажности. (D) Репрезентативные результаты живой визуализации, показывающие ранние события прогрессирования роев фибробластов (белый пунктирный круг) в первые 12 ч 0-го дня и 1-го дня стадии SCAD. (E) Графическое представление одноклеточных отслеживаемых клеточных траекторий отдельных фибробластов в D, D' и D''. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Несколько моделей уже были разработаны, чтобы понять образование рубцов после травмы. Хотя в этом отношении было достигнуто много успехов, но фактические механизмы все еще не ясны. В отличие от предыдущей методики, модель SCAD включает в себя все типы клеток и кожные слои, тем самым сохраняя сложность нативной кожи18,19. Эта методология способна генерировать фундаментальные наборы данных, которые важны для понимания молекулярных механизмов, которые управляют образованием рубцов. Анализ разработан таким образом, чтобы быть простым, минималистичным, но способным производить фундаментальные и функциональные показания, которые имеют решающее значение для понимания миграции фибробластов, осаждения ECM, сокращения эпидермиса / мышц13,14. Он относительно менее сложен, чем установки in vivo, и отклонения по отношению к образцу могут быть сведены к минимуму. Кроме того, этот анализ может быть легко объединен с конвейерами анализа с высокой пропускной способностью. При этом весь спектр или библиотеки ингибиторов или активаторов, таких как химические соединения, нейтрализующие антитела, siRNA или вирусные методологии, которые уменьшают или способствуют рубцеванию, могут быть применены с относительной легкостью к минимальным количествам иссеченных тканей. Что касается ограничения этой модели рубцов ex vivo, этот анализ не может быть применен для изучения фенотипических или динамических аспектов а) нерезидентных иммунных роев в развитии рубца б) васкуляризации в) созревания рубца, поскольку ткань не жизнеспособна после 5 дней после травмы.
Прежде чем биопсия приведет к иссечению, важно, чтобы в ткани не оставалось остаточной крови, так как это может помешать ходу эксперимента. Мы рекомендуем промывать ткань более одного раза HBSS, если это необходимо, чтобы убедиться, что любая остаточная кровь из ткани устранена. Также смена среды в чередование дней должна выполняться с особой осторожностью, так как, кожный и эпидермальный слои могут разделяться из-за небольших размеров ткани. Поэтому крайне важно практиковать процедуру должным образом заранее, прежде чем начинать реальные эксперименты. Чтобы избежать повторного разделения слоев ткани, мы предполагаем, что во время изменения среды 10 мкл остаточной среды могут быть сохранены перед заменой свежей средой, чтобы стабилизировать ткань и свести к минимуму изменение поверхностного натяжения на ткани, вызванное средой, добавленной в лунку.
Для трубопроводов 2D-анализа мы рекомендуем уравновешивать ткань жидким соединением оптимальной температуры резки при комнатной температуре в течение нескольких минут перед установкой ткани в блок. Это предотвращает отделение тканей из-за образования кристаллов льда во время сечения. 3D/3D-конвейеры покадровой визуализации должны быть адекватно модифицированы в зависимости от имеющейся модальности микроскопа. Для вертикального микроскопа (с целью погружения в воду или без него) встраивание ткани в агарозу или использование суперклея предотвращает физическое смещение ткани во время визуализации. Цели погружения в воду позволяют получать 3D/3D-покадровую съемку с использованием PBS или бесцветных носителей (без фенол-красного цвета). Для инвертированного микроскопа ткань может быть помещена на стеклянное дно / пластину визуализации и иммобилизована с использованием капли агарозы низкой температуры плавления и покрыта подходящей средой для обеспечения жизнеспособности во время живой визуализации. В обоих условиях совместимая инкубационная система может использоваться для обеспечения правильной температуры, влажности и подачи газа во время визуализации.
В заключение, модель SCAD позволяет идентифицировать и характеризовать новые молекулярные сигналы и механистические пути, участвующие в заживлении ран млекопитающих13,14. Протокол предоставляет подробное описание генерации SCAD и потенциальных последующих приложений, а также анализ, чтобы дать представление о развитии рубцов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Все авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.
Acknowledgments
Мы благодарим всех соавторов Jiang et al. 2020 за вклад в разработку методологии SCAD13. Мы благодарим д-ра Штеффена Дитцеля и ядро Bioimaging в Университете Людвига-Максимиланса за доступ к многофотонной системе. Y.R. был поддержан Фондом Эльзе-Крёнер-Фрезениус-Stiftung (2016_A21), Грантом консолидатора Европейского исследовательского совета (ERC-CoG 819933) и Фондом LEO (LF-OC-21-000835).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Tween 20, Nonionic Detergent | Biorad Laboratories | 1610781 | |
| Bovine serum albumin, Cold ethanol fract | Sigma | A4503-50G | |
| DMEM/F-12, HEPES, no phenol red-500 mL | LIFE Technologies | 11039021 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190169 | |
| Epredia Cryostar NX70 Cryostat | Thermo Scientific | ||
| Epredia SuperFrost Plus Adhesion slides | Fisher scientific | J1800AMNZ | Adhesion slides |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin-500 mL | LIFE Technologies | 10500064 | |
| Fluoromount-G with DAPI | Life Technologies | 00 4959 52 | Mounting medium with DAPI |
| Forceps curved with fine points with guidepinstainless steel(tweezers)125 mm length | Fisher Scientific | 12381369 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma | G2500-100G | |
| GlutaMAX Supplement-100 mL | LIFE Technologies | 35050038 | |
| HBSS, calcium, magnesium, no phenol red-500 mL | LIFE Technologies | 14025092 | |
| Ibidi Gas incubation system for CO2 and O2 | Ibidi | 11922 | |
| Ibidi Heating system | Ibidi | 10915 | |
| Leica SP8 upright microscope - Multiphoton excitation 680–1300 nm | Leica | Equipped with a 25x water-dipping objective (HC IRAPO L 25x/1.00 W) in combination with a tunable laser (Spectra-Physics, InSight DS + Single) | |
| Non Essential Amino Acids | LIFE Technologies | 11140035 | |
| NuSieve GTG Agarose ,25 g | Biozym /Lonza | 859081 | |
| OCT Embedding Matrix | Carlroth | 6478.1 | |
| Paraformaldehyde, 16% W/V AQ. 10 x10 mL | VWR International | 43368.9M | |
| Pen-Strep | Gibco | 15140122 | |
| Stiefel Biopsy-Punch 2 mm | Stiefel | 270130 | |
| Straight Sharp/Sharp Dissecting Scissors 11.4 cm | Fisher Scientific | 15654444 | |
| Thimerosal Bioxtra, 97%–101% | Sigma-Aldrich | T8784-1G | |
| Zeiss Axioimager M2 upright microscope | Zeiss |
References
- Longaker, M. T., et al. Adult skin wounds in the fetal environment heal with scar formation. Annals of Surgery. 219 (1), 65-72 (1994).
- desJardins-Park, H. E., Foster, D. S., Longaker, M. T. Fibroblasts and wound healing: an update. Regenerative Medicine. 13 (5), 491-495 (2018).
- Jiang, X., Iseki, S., Maxson, R. E., Sucov, H. M., Morriss-Kay, G. M. Tissue origins and interactions in the mammalian skull vault. Developmental Biology. 241 (1), 106-116 (2002).
- Tripathi, S., et al. Hypertrophic scars and keloids: a review and current treatment modalities. Biomedical Dermatology. 4, 11 (2020).
- Martin, P. Wound healing--Aiming for perfect skin regeneration. Science. 276 (5309), 75-81 (1997).
- Correa-Gallegos, D., et al. Patch repair of deep wounds by mobilized fascia. Nature. 576 (7786), 287-292 (2019).
- Sen, C. K. Human wounds and its burden: An updated compendium of estimates. Advances in Wound Care. 8 (2), 39-48 (2019).
- Rinkevich, Y., et al. Identification and isolation of a dermal lineage with intrinsic fibrogenic potential. Science. 348 (6232), 2151 (2015).
- Leavitt, T., et al. Prrx1 fibroblasts represent a pro-fibrotic lineage in the mouse ventral dermis. Cell Reports. 33 (6), 108356 (2020).
- Driskell, R. R., et al. Distinct fibroblast lineages determine dermal architecture in skin development and repair. Nature. 504 (7479), 277-281 (2013).
- Walmsley, G. G., et al. Live fibroblast harvest reveals surface marker shift in vitro. Tissue Engineering. Part C, Methods. 21 (3), 314-321 (2015).
- Hakkinen, K. M., Harunaga, J. S., Doyle, A. D., Yamada, K. M. Direct comparisons of the morphology, migration, cell adhesions, and actin cytoskeleton of fibroblasts in four different three-dimensional extracellular matrices. Tissue Engineering. Part A. 17 (5-6), 713-724 (2011).
- Jiang, D., et al. Injury triggers fascia fibroblast collective cell migration to drive scar formation through N-cadherin. Nature Communications. 11 (1), 5653 (2020).
- Wan, L., et al. Connexin43 gap junction drives fascia mobilization and repair of deep skin wounds. Matrix Biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 97, 58-71 (2021).
- Molbay, M., Kolabas, Z. I., Todorov, M. I., Ohn, T. -L., Ertürk, A. A guidebook for DISCO tissue clearing. Molecular Systems Biology. 17 (3), 9807 (2021).
- Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).
- Ertürk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
- Wilhelm, K. -P., Wilhelm, D., Bielfeldt, S. Models of wound healing: an emphasis on clinical studies. Skin Research and Technology: Official Journal of International Society for Bioengineering and the Skin (ISBS) [and] International Society for Digital Imaging of Skin (ISDIS) [and] International Society for Skin Imaging (ISSI). 23 (1), 3-12 (2017).
- Grada, A., Mervis, J., Falanga, V. Research techniques made simple: Animal models of wound healing). The Journal of Investigative Dermatology. 138 (10), 2095-2105 (2018).
