قياس الانخفاض البروتيني البروتيوستيكي الخاص بالأنسجة في إليجانات Caenorhabditis
Summary
انخفاض بروتيوستاتيكي هو السمة المميزة للشيخوخة، وتسهيل ظهور الأمراض العصبية. نحن الخطوط العريضة لبروتوكول لقياس قياس كميا proteostasis في اثنين من مختلف الأنسجة Elegans Caenorhabditis من خلال التعبير heterologous من polyglutamine يكرر تنصهر لمراسل الفلورسنت. يسمح هذا النموذج بسرعة في التحليل الجيني في الجسم الحي للبروتيوستاسي.
Abstract
القدرة على الحفاظ على وظيفة سليمة وقابلة للطي من البروتيوم (البروتين التوازن) تنخفض خلال الشيخوخة العادية، مما يسهل ظهور عدد متزايد من الأمراض المرتبطة بالعمر. على سبيل المثال، البروتينات مع توسعات البوليغلوتامين عرضة للتراكم، كما يتضح من بروتين هنتنغتين وما يصاحبه من بداية مرض هنتنغتون. وقد درس على نطاق واسع تدهور المرتبطة بالعمر من البروتيوم من خلال استخدام elegans Caenorhabditis المعدلة وراثيا التعبير عن polyQ يكرر تنصهر إلى بروتين الفلورسنت الأصفر (YFP). هذا النموذج الحيواني المعدل وراثيا polyQ::YFP يسهل القياس الكمي المباشر للانخفاض المرتبط بالعمر من البروتيوم من خلال تصوير التكوين التدريجي لل البؤر الفلورية (أي مجاميع البروتين) وظهور عيوب الحركة اللاحقة التي تتطور نتيجة لانهيار البروتيوم. علاوة على ذلك ، يمكن أن يكون التعبير عن المتحول متعدد التخصصات: YFP مدفوعا بجهات مروجة خاصة بالأنسجة ، مما يسمح بتقييم البروتيوستاسي عبر الأنسجة في سياق كائن حي متعدد الخلايا سليم. هذا النموذج قابل للغاية للتحليل الجيني ، وبالتالي توفير نهج لتحديد حجم الشيخوخة التي تكمل اختبارات العمر. نحن نصف كيفية قياس بدقة متعدد الأضلاع::تشكيل بؤر YFP داخل الخلايا العصبية أو عضلة جدار الجسم أثناء الشيخوخة، وظهور العيوب السلوكية اللاحقة. بعد ذلك، نسلط الضوء على كيفية تكييف هذه النهج مع الإنتاجية العالية، والتطبيقات المستقبلية المحتملة باستخدام استراتيجيات ناشئة أخرى للتحليل الجيني C. elegans.
Introduction
البروتين التوازن (بروتيوستسيس) يعرف بأنه القدرة الخلوية للحفاظ على وظيفة مناسبة وقابلة للطي من البروتيوم. التحدي الكامن في البروتيوستاسيس هو ضمان طي جميع البروتينات بشكل صحيح والحفاظ عليها في تشكيل أصلي ، والذي يتم تضخيمه بشكل أكبر من خلال الطبيعة المتنوعة لحجم البروتين ، وتكوين الأحماض الأمينية ، والتكوين الهيكلي ، والاستقرار ، والدوران ، والتعبير ، والتجزيء دون الخلوي ، والتعديلات1. يتم الحفاظ على بروتيوستسيس من خلال العمل المنسق لشبكة بروتيوستاتيكي كبيرة، تتكون من ما يقرب من 2000 البروتينات الفريدة، والتي تنظم التوليف السليم، للطي، والاتجار، وتدهور داخل البروتيوم2،3. مكونات حصان العمل من شبكة بروتيوستاتيكي هي تسع عائلات رئيسية من المرافقين الجزيئية4. كل نوع من الأنسجة والخلايا يستخدم بشكل تفضيلي مجموعات فرعية محددة من المرافقين الجزيئية، ويفترض أن يتماشى مع مطالب مختلفة من البروتيوم متميزة5.
إحدى السمات المميزة للشيخوخة الطبيعية للكائنات الحية هي الانخفاض التدريجي وانهيار داء البروتيستاسيس الخلوي ، والذي يعتقد أنه أساس أساسي لظهور وتطور عدد متزايد من الأمراض المرتبطة بالعمر. على سبيل المثال، مرض الزهايمر، مرض باركنسون، مرض هنتنغتون، والتصلب الجانبي الضموري (ALS) تشترك في سمة مشتركة: في كل حالة من مظاهر التجدد العصبي مدفوعة التعديلات الوراثية التي تهيئ بروتين متحولة لتجميع (اميلويد-β/تاو، α-سينوكلين، HTT، FUS/TBD-43/SOD-1، على التوالي)6و7و8و9و10 . أثناء الشيخوخة ، تنخفض سلامة الشبكة البروتيوستيكية وعدم قابليتها للانحلال ، مما يؤدي إلى تراكم المجاميع البروتيوتوكسية التي تؤدي إلى خلل وظيفي في الخلايا وتجدد الأعصاب. من الجدير بالذكر أن أمراض تشكيل البروتين ليست فريدة من نوعها للخلايا العصبية ، وتحدث عبر أنسجة متعددة ، كما أبرزها مرض السكري من النوع الثاني ، والمايلوما المتعددة ، والتليف الكيسي11،12،13،14. ولذلك، فإن توضيح الآليات القادرة على الحفاظ على البروتيوستاسي سيسهل تطوير التدخلات المستهدفة لعلاج المرض وتعزيز الشيخوخة الصحية.
التربة الصغيرة nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) كان له دور فعال في اكتشاف الجينات وتوضيح المسارات التي تغير البروتيوستاسي. يتم الحفاظ على العديد من مكونات الشبكة البروتيوستاتيكية ومسارات نقل الإشارات التي تنظم البروتيوستازي تطوريا. وعلاوة على ذلك، قللت سي إليغانز من التعقيد والتكرار مقارنة بالنظم الفقارية، مما جعلها أكثر قابلية للتحليل الجيني واكتشاف الجينات. وتشمل المزايا الإضافية ل C. elegans التي أدت إلى استخدامه على نطاق واسع كنظام نموذجي لدراسة داء البروتيوستاسي: الجينوم الوراثي والوظيفي القوي ، ودورة حياة قصيرة (3 أيام) والعمر (3 أسابيع) ، والجينوم المدمج والشروح جيدا ، وتوافر مجموعة واسعة من المسوخ الوراثية ، وسهولة تصور التغيرات الخاصة بالأنسجة في بيولوجيا الخلايا باستخدام المراسلين الفلوريين.
يمكن قياس الاضمحلال التدريجي للبروتيوستاسي أثناء الشيخوخة بسهولة في C. elegans. أظهر مختبر موريموتو لأول مرة أن توسع البوليglutamine تنصهر إلى البروتين الفلوري الأصفر(polyQ::YFP)يمكن استخدامها لقياس الانخفاض البروتيوستاتيكي في C. elegans خلال الشيخوخة15،16،17،18. YFP الانصهار إلى 35 يكرر الجلوتامين أو أكثر نتيجة في تشكيل المرتبطة بالعمر من بؤر الفلورسنت جنبا إلى جنب مع علامات علم الأمراض الخلوية. وتجدر الإشارة إلى أن هذه المجموعة من توسع الجلوتامين تعكس طول المسالك البوليغلوتامين من بروتين هنتنغتين الذي يبدأ فيه رصد أمراض مرض هنتنغتون في البشر (عادة >35 CAG يكرر)19. وقد استخدمت سلالات مع التعبير عن polyQ::YFP داخل العضلات, الأمعاء, أو الخلايا العصبية للتأكد من أن الانخفاض المرتبط بالعمر من البروتيوستاسي يحدث عبر أنواع مختلفة من الخلايا والأنسجة. العضلات محددة polyQ::YFP التعبير (أي unc-54p::Q35::YFP)كان المراسل الأكثر استخداما على نطاق واسع الأنسجة محددة, كما تراكم بؤر الفلورسنت من السهل تحديد كميا خلال الأيام القليلة الأولى من مرحلة البلوغ باستخدام المجهر تشريح الفلورسنت بسيطة (الشكل 1A-1B). بالإضافة إلى ذلك ، تصبح الحيوانات مشلولة خلال منتصف العمر ، حيث ينهار البروتيوم داخل العضلات بسبب التأثير البروتيوتوكسي للمراسل(الشكل 1C). وبالمثل، يمكن أن يتبع الانخفاض المرتبط بالعمر في البروتيوستاسيس العصبي(rgef-1p::Q40::YFP)عن طريق التحديد الكمي المباشر لل البؤر / التكوين الكلي والانخفاضات المرتبطة بالعمر في الانحناءات المنسقة للجسم بعد وضع الحيوانات في السائل(الشكل 2).
هنا، نقدم بروتوكول مفصل حول كيفية قياس التقدم المعتمد على العمر من تراكم البروتين الكلي والسمية البروتوتوكسية المرتبطة الناجمة عن التعبير عن البوليغلوتامين يكرر داخل الأنسجة العصبية والعضلات في C. elegans. نحن نقدم أمثلة على النتائج النموذجية التي تم إنشاؤها باستخدام هذه السلالات والأساليب. علاوة على ذلك ، نظهر كيف استخدمنا هذه الأساليب لدراسة التنظيم النسخي للشبكة البروتيوستاتيكية. نناقش طرقا إضافية يمكن من خلالها دمج هؤلاء المراسلين بسهولة مع الكواشف الموجودة الأخرى أو تكييفها لشاشات أكبر.
Protocol
Representative Results
Discussion
وتتميز الشيخوخة من قبل انخفاض تدريجي في البروتيوستاسيس. يتم الحفاظ على البروتيوستازي من خلال نظام معقد، شبكة بروتيوستاتيكي، للتحكم المنسق والديناميكي والمستجيب للإجهاد في طي البروتين وتدهوره وترجمته. لماذا يفشل البروتيوستاسي في سياق الشيخوخة غير مفهومة بشكل جيد ، ولكن epigenome المتحللة ، …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر الأعضاء السابقين والحاليين في مختبر سامويلسون على مساعدتهم في صقل هذه الطريقة و/ أو المناقشة التي ساعدت على تطوير هذه المخطوطة. تم دعم الأبحاث التي تم الإبلاغ عنها في هذا المنشور من قبل المعهد الوطني للشيخوخة للمعاهد الوطنية للصحة تحت أرقام الجوائز RF1AG062593 وR21AG064519. المحتوى هو فقط مسؤولية المؤلفين ولا يمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة. لم يكن للممولين أي دور في تصميم الدراسة أو جمع البيانات وتحليلها أو قرار نشر المخطوطة أو إعدادها.
Materials
| 24 Well Culture Plates | Greiner Bio-One | #662102 | |
| 2 mL 96-well plates | Greiner Bio-One | #780286 | |
| 600 µL 96-well plates | Greiner Bio-One | #786261 | |
| 96-pin plate replicator | Nunc | 250520 | |
| Air-permeable plate seal | VWR | 60941-086 | |
| bacteriological agar | Affymetrix/USB | 10906 | |
| bacto-peptone | VWR | 90000-368 | |
| C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Ahringer | Source Bioscience | C. elegans RNAi Collection (Ahringer) | See also Kamath et. al, Nature 2003. |
| C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Vidal | Source Bioscience | C. elegans ORF-RNAi Resource (Vidal) | See also Rual et. al, Genome Research 2004. This library is also available from Dharmacon. |
| FuDR (5-Fluoro-2'-deoxyuridine) | Alfa Aesar | L16497 | |
| Glass microscope cover slips | VWR | 48404-455 | |
| Glass microscope slides | VWR | 160004-422 | |
| IPTG (isopropyl beta-D-1-thigalactopyranoside) | Gold Bio | 12481C100 | |
| Retangular non-treated single-well plate, 128x86mm | Thermo-Fisher | 242811 | |
| Sodium Azide, CAS #26628-22-8 | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Zeiss Axio Imager M2m microscope with AxioVision v4.8.2.0 software | Zeiss | unknown | |
| Zeiss StemiSV11 M2 Bio Quad microscope | Zeiss | unknown |
References
- Wolff, S., Weissman, J. S., Dillin, A. Differential scales of protein quality control. Cell. 157 (1), 52-64 (2014).
- Labbadia, J., Morimoto, R. I. The biology of proteostasis in aging and disease. Annual Review of Biochemistry. 84, 435-464 (2015).
- Powers, E. T., Morimoto, R. I., Dillin, A., Kelly, J. W., Balch, W. E. Biological and chemical approaches to diseases of proteostasis deficiency. Annual Review of Biochemistry. 78, 959-991 (2009).
- Brehme, M., et al. A chaperome subnetwork safeguards proteostasis in aging and neurodegenerative disease. Cell Reports. 9 (3), 1135-1150 (2014).
- Sala, A. J., Bott, L. C., Morimoto, R. I. Shaping proteostasis at the cellular, tissue, and organismal level. Journal of Cell Biology. 216 (5), 1231-1241 (2017).
- Braak, H., Braak, E., Strothjohann, M. Abnormally phosphorylated tau protein related to the formation of neurofibrillary tangles and neuropil threads in the cerebral cortex of sheep and goat. Neuroscience Letters. 171 (1-2), 1-4 (1994).
- Poirier, M. A., Jiang, H., Ross, C. A. A structure-based analysis of huntingtin mutant polyglutamine aggregation and toxicity: evidence for a compact beta-sheet structure. Human Molecular Genetics. 14 (6), 765-774 (2005).
- Vilchez, D., Saez, I., Dillin, A. The role of protein clearance mechanisms in organismal ageing and age-related diseases. Nature Communications. 5, 5659 (2014).
- Eftekharzadeh, B., Hyman, B. T., Wegmann, S. Structural studies on the mechanism of protein aggregation in age related neurodegenerative diseases. Mechanisms of Ageing and Development. 156, 1-13 (2016).
- Pokrishevsky, E., Grad, L. I., Cashman, N. R. TDP-43 or FUS-induced misfolded human wild-type SOD1 can propagate intercellularly in a prion-like fashion. Scientific Reports. 6, 22155 (2016).
- Mukherjee, A., Morales-Scheihing, D., Butler, P. C., Soto, C. Type 2 diabetes as a protein misfolding disease. Trends in Molecular Medicine. 21 (7), 439-449 (2015).
- Sikkink, L. A., Ramirez-Alvarado, M. Biochemical and aggregation analysis of Bence Jones proteins from different light chain diseases. Amyloid. 15 (1), 29-39 (2008).
- Qu, B. H., Strickland, E., Thomas, P. J. Cystic fibrosis: a disease of altered protein folding. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 29 (5), 483-490 (1997).
- Qu, B. H., Strickland, E. H., Thomas, P. J. Localization and suppression of a kinetic defect in cystic fibrosis transmembrane conductance regulator folding. Journal of Biological Chemistry. 272 (25), 15739-15744 (1997).
- Brignull, H. R., Moore, F. E., Tang, S. J., Morimoto, R. I. Polyglutamine proteins at the pathogenic threshold display neuron-specific aggregation in a pan-neuronal Caenorhabditis elegans model. Journal of Neuroscience. 26 (29), 7597-7606 (2006).
- Gidalevitz, T., Ben-Zvi, A., Ho, K. H., Brignull, H. R., Morimoto, R. I. Progressive disruption of cellular protein folding in models of polyglutamine diseases. Science. 311 (5766), 1471-1474 (2006).
- Morimoto, R. I. Stress, aging, and neurodegenerative disease. New England Journal of Medicine. 355 (21), 2254-2255 (2006).
- Morimoto, R. I. Proteotoxic stress and inducible chaperone networks in neurodegenerative disease and aging. Genes & Development. 22 (11), 1427-1438 (2008).
- Walker, F. O. Huntington’s disease. Lancet. 369 (9557), 218-228 (2007).
- Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biology. 2 (1), 0002 (2001).
- Karady, I., et al. Using Caenorhabditis elegans as a model system to study protein homeostasis in a multicellular organism. Journal of Visualized Experiments. (82), e50840 (2013).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
- Cornwell, A. B., Llop, J. R., Salzman, P., Thakar, J., Samuelson, A. V. The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan. Journal of Visualized Experiments. (136), e57819 (2018).
- Angeli, S., et al. A DNA synthesis inhibitor is protective against proteotoxic stressors via modulation of fertility pathways in Caenorhabditis elegans. Aging (Albany NY). 5 (10), 759-769 (2013).
- Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset. PLoS One. 9 (1), 85964 (2014).
- Byerly, L., Cassada, R. C., Russell, R. L. The life cycle of the nematode Caenorhabditis elegans. I. Wild-type growth and reproduction. Developmental Biology. 51 (1), 23-33 (1976).
- Schemper, M. Cox Analysis of Survival Data with Non-Proportional Hazard Functions. Journal of the Royal Statistical Society. Series D (The Statistician). 41 (4), 455-465 (1992).
- Royston, P., Parmar, M. K. The use of restricted mean survival time to estimate the treatment effect in randomized clinical trials when the proportional hazards assumption is in doubt. Statistics in Medicine. 30 (19), 2409-2421 (2011).
- Campbell, I. Chi-squared and Fisher-Irwin tests of two-by-two tables with small sample recommendations. Statistics in Medicine. 26 (19), 3661-3675 (2007).
- Busing, F. M., Weaver, B., Dubois, S. 2 x 2 Tables: a note on Campbell’s recommendation. Statistics in Medicine. 35 (8), 1354-1358 (2016).
- Das, R., et al. The homeodomain-interacting protein kinase HPK-1 preserves protein homeostasis and longevity through master regulatory control of the HSF-1 chaperone network and TORC1-restricted autophagy in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 13 (10), 1007038 (2017).
- Garcia, S. M., Casanueva, M. O., Silva, M. C., Amaral, M. D., Morimoto, R. I. Neuronal signaling modulates protein homeostasis in Caenorhabditis elegans post-synaptic muscle cells. Genes & Development. 21 (22), 3006-3016 (2007).
- Morley, J. F., Brignull, H. R., Weyers, J. J., Morimoto, R. I. The threshold for polyglutamine-expansion protein aggregation and cellular toxicity is dynamic and influenced by aging in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (16), 10417-10422 (2002).
- Labbadia, J., Morimoto, R. I. Repression of the Heat Shock Response Is a Programmed Event at the Onset of Reproduction. Molecular Cell. 59 (4), 639-650 (2015).
- Shemesh, N., Shai, N., Ben-Zvi, A. Germline stem cell arrest inhibits the collapse of somatic proteostasis early in Caenorhabditis elegans adulthood. Aging Cell. 12 (5), 814-822 (2013).
- Ben-Zvi, A., Miller, E. A., Morimoto, R. I. Collapse of proteostasis represents an early molecular event in Caenorhabditis elegans aging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (35), 14914-14919 (2009).
- Walther, D. M., et al. Widespread Proteome Remodeling and Aggregation in Aging C. elegans. Cell. 161 (4), 919-932 (2015).
- Cohen, E., Bieschke, J., Perciavalle, R. M., Kelly, J. W., Dillin, A. Opposing activities protect against age-onset proteotoxicity. Science. 313 (5793), 1604-1610 (2006).
- Silva, M. C., et al. A genetic screening strategy identifies novel regulators of the proteostasis network. PLoS Genetics. 7 (12), 1002438 (2011).
- Zhang, L., Ward, J. D., Cheng, Z., Dernburg, A. F. The auxin-inducible degradation (AID) system enables versatile conditional protein depletion in C. elegans. Development. 142 (24), 4374-4384 (2015).
- Hansen, M., Hsu, A. L., Dillin, A., Kenyon, C. New genes tied to endocrine, metabolic, and dietary regulation of lifespan from a Caenorhabditis elegans genomic RNAi screen. PLoS Genetics. 1 (1), 119-128 (2005).
- Nollen, E. A., et al. Genome-wide RNA interference screen identifies previously undescribed regulators of polyglutamine aggregation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (17), 6403-6408 (2004).
- Samuelson, A. V., Carr, C. E., Ruvkun, G. Gene activities that mediate increased life span of C. elegans insulin-like signaling mutants. Genes & Development. 21 (22), 2976-2994 (2007).
- Johnson, D. W., et al. The Caenorhabditis elegans Myc-Mondo/Mad complexes integrate diverse longevity signals. PLoS Genetics. 10 (4), 1004278 (2014).
- Wang, Z., Sherwood, D. R. Dissection of genetic pathways in C. elegans. Methods in Cell Biology. 106, 113-157 (2011).
- Jorgensen, E. M., Mango, S. E. The art and design of genetic screens: caenorhabditis elegans. Nature Reviews Genetics. 3 (5), 356-369 (2002).
