カエノハブディティス・エレガンスにおける組織特異的プロテオスタティック低下の定量化
Summary
プロテオスタティック低下は老化の特徴であり、神経変性疾患の発症を促進する。我々は、蛍光レポーターに融合したポリグルタミン反復の異種発現を通じて、2つの異なる カエノールハブディティス・エレガン ス組織におけるプロテオスタシスを定量的に測定するプロトコルを概説する。このモデルは、プロテオスタシスの迅速なインビボ遺伝子解析を可能にする。
Abstract
正常な老化の間に、プロテオームの適切な機能と折りたたみ(タンパク質ホメオスタシス)を維持する能力が低下し、加齢に伴う疾患の増加の発症を促進する。例えば、ポリグルタミンの膨張を有するタンパク質は、ハンチントン病のハンチンチンタンパク質および併発発症を例示するように、凝集しやすい。プロテオームの年齢に伴う劣化は、黄色の蛍光タンパク質(YFP)に融合したポリQ反復を発現するトランスジェニック ・カエノールハブディティス・エレガンス の使用を通じて広く研究されている。この ポリQ::YFP トランスジェニック動物モデルは、蛍光病巣(すなわち、タンパク質凝集体)の進行性形成とその後の運動異常の発症を、プロテオームの崩壊の結果として発症することをイメージ化することによって、プロテオームの年齢関連の衰退の直接的な定量化を促進する。さらに、 ポリQ::YFP トランスジーンの発現は、組織特異的プロモーターによって駆動することができ、無傷の多細胞生物の文脈における組織全体のプロテオスタシスの評価を可能にする。このモデルは遺伝子解析に非常に適しているため、寿命アッセイを補完する老化を定量化するアプローチを提供します。老化時のニューロンまたは体壁筋内の YFP 病巣形成と、その後の行動異常の発症を正確に測定する方法を説明する。次に、これらのアプローチがより高いスループットと 、C.elegans 遺伝子解析のための他の新しい戦略を使用して将来の潜在的なアプリケーションにどのように適応できるかを強調します。
Introduction
タンパク質ホメオスタシス(プロテオスタシス)は、プロテオームの適切な機能およびフォールディングを維持する細胞能力として定義される。プロテオスタシスに対する本質的な課題は、すべてのタンパク質が適切に折り畳まれ、天然の立体構造で維持されることを保証するものであり、タンパク質サイズ、アミノ酸組成、構造立体構造、安定性、ターンオーバー、発現、細胞区画化、および修飾の多様な性質によってさらに増幅される。プロテオスタシスは、プロテオーム2,3内で適切な合成、フォールディング、人身売買、分解を調節する約2000個のユニークなタンパク質からなる、大規模なプロテオスタティックネットワークの協調作用によって維持される。プロテオスタティックネットワークの働く馬の構成要素は、分子シャペロン4の9つの主要なファミリーである。すべての組織および細胞型は、分子シャペロンの特定のサブセットを優先的に利用し、おそらく異なるプロテオーム5の異なる要求と一致する。
正常な生物老化の特徴の1つは、細胞プロテオスタシスの進行性の衰退と崩壊であり、これは増加する年齢関連疾患の発症および進行の基礎であると考えられている。例えば、アルツハイマー病、 パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症(ALS)は、それぞれ共通の特徴を共有する:神経変性の各症例において、変異タンパク質の凝集を起こす遺伝子変化(アミロイドβ/タウ、α-シヌクレイン、HTT、FUS/TBD-43/SOD-1、それぞれ).老化の間、タンパク質静電ネットワークの完全性と可分化性が低下し、細胞機能障害および神経変性をもたらすタンパク質毒性凝集体の蓄積をもたらす。なお、タンパク質立体構造疾患は、II型糖尿病、多発性骨髄腫、および嚢胞性線維症11、12、13、14によって強調されるように、ニューロンに特有のものではなく、複数の組織にわたって起こる。したがって、プロテオスタシスを保存することができるメカニズムを解明することは、疾患の治療のための標的介入の開発を促進し、健康な老化を促進する。
小さな土壌線虫カエノハブディティス・エレガンス(C.エレガンス)は、遺伝子の発見とプロテオスタシスを変える経路の解明に役立っています。プロテオスタシスを調節するタンパク質増殖ネットワークやシグナル伝達経路の多くの構成要素は進化的に保存されています。さらに、C.エレガンスは脊椎動物システムに比べて複雑さと冗長性を低下させ、遺伝子解析や遺伝子発見をより容易にしています。プロテオスタシスを研究するモデルシステムとして広く使用されているC.エレガンスの追加の利点は、強力な遺伝的および機能的ゲノミクス、短いライフサイクル(3日間)と寿命(3週間)、コンパクトでよくアノテられたゲノム、遺伝子変異体の幅広い品揃えの入手可能性、および蛍光レポーターを使用した細胞における組織特異的変化の視覚化の容易さである。
老化時のプロテオスタシスの進行性の崩壊は、C.エレガンスで容易に定量することができる。森本研究室は、黄色蛍光タンパク質(polyQ::YFP)に融合したポリグルタミン拡張が、加齢15、16、17、18の間にC.エレガンスのタンパク質帯電性低下を定量化するために使用できることを最初に実証した。YFP融合は35グルタミンに繰り返し、または細胞病理の徴候と共に蛍光病巣の年齢関連形成をもたらす。注意すべきは、グルタミン拡張のこの範囲は、ハンチントン病理がヒトで観察され始めるハンチンチンタンパク質のポリグルタミン管の長さを鏡像化する(典型的には>35 CAG反復)19。筋肉、腸、または神経細胞の中での筋肉、腸、または神経細胞の中でのYFP株は、異なる細胞および組織の種類にわたってプロテオースタシスの年齢関連の低下が起こることを確認するために利用されてきた。筋肉特異的ポリQ::YFP発現(すなわち、unc-54p::Q35::YFP)は、蛍光病巣の蓄積が単純な蛍光解剖顕微鏡を使用して成人期の最初の数日間にわたって定量化しやすいため、組織特異的なレポーターとして最も広く使用されています(図1A-1B)。さらに、動物は中年期に麻痺し、レポーターのタンパク質毒性効果により筋肉内のプロテオームが崩壊する(図1C)。同様に、神経細胞質分解の年齢関連の低下は、動物を液体に入れた後の協調体曲げにおける病巣/凝集体形成および加齢に伴う減少を直接定量することによって(rgef-1p::Q40::YFP)に従うことができる(図2)。
ここでは 、C.エレガンスにおける神経および筋肉組織内のポリグルタミン反復の発現によって誘発されるタンパク質凝集体蓄積および関連するタンパク質毒性の年齢依存性進行を測定する方法に関する詳細なプロトコルを提示する。これらの菌株や方法を用いて生成される代表的な結果の例を提供します。また、これらの手法を活用して、プロテオスタティックネットワークの転写制御を研究する方法を紹介します。我々は、これらのレポーターが他の既存の試薬と容易に統合されるか、またはより大きいスクリーンのために適応することができる付加的な方法を議論する。
Protocol
Representative Results
Discussion
老化は、プロテオスタシスの緩やかな減少を特徴とする。プロテオスタシスは、タンパク質フォールディング、分解、および翻訳の協調、動的、ストレス応答性制御のための複雑なシステム、プロテオスタティックネットワークによって維持されます。なぜ老化の過程でプロテオスタシスが失敗するのかは十分に理解されていませんが、エピゲノムの崩壊、ストレス応答の不全化、代償性ク?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
サミュエルソン研究所の過去および現在のメンバーが、この原稿の開発に役立ったこの方法や議論の洗練に協力してくれたことに感謝します。この出版物で報告された研究は、賞番号RF1AG062593とR21AG064519の下で国立衛生研究所の高齢化研究所によってサポートされました。コンテンツは著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。資金提供者は、研究デザイン、データ収集と分析、出版の決定、原稿の作成に何の役割も持っていませんでした。
Materials
| 24 Well Culture Plates | Greiner Bio-One | #662102 | |
| 2 mL 96-well plates | Greiner Bio-One | #780286 | |
| 600 µL 96-well plates | Greiner Bio-One | #786261 | |
| 96-pin plate replicator | Nunc | 250520 | |
| Air-permeable plate seal | VWR | 60941-086 | |
| bacteriological agar | Affymetrix/USB | 10906 | |
| bacto-peptone | VWR | 90000-368 | |
| C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Ahringer | Source Bioscience | C. elegans RNAi Collection (Ahringer) | See also Kamath et. al, Nature 2003. |
| C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Vidal | Source Bioscience | C. elegans ORF-RNAi Resource (Vidal) | See also Rual et. al, Genome Research 2004. This library is also available from Dharmacon. |
| FuDR (5-Fluoro-2'-deoxyuridine) | Alfa Aesar | L16497 | |
| Glass microscope cover slips | VWR | 48404-455 | |
| Glass microscope slides | VWR | 160004-422 | |
| IPTG (isopropyl beta-D-1-thigalactopyranoside) | Gold Bio | 12481C100 | |
| Retangular non-treated single-well plate, 128x86mm | Thermo-Fisher | 242811 | |
| Sodium Azide, CAS #26628-22-8 | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Zeiss Axio Imager M2m microscope with AxioVision v4.8.2.0 software | Zeiss | unknown | |
| Zeiss StemiSV11 M2 Bio Quad microscope | Zeiss | unknown |
References
- Wolff, S., Weissman, J. S., Dillin, A. Differential scales of protein quality control. Cell. 157 (1), 52-64 (2014).
- Labbadia, J., Morimoto, R. I. The biology of proteostasis in aging and disease. Annual Review of Biochemistry. 84, 435-464 (2015).
- Powers, E. T., Morimoto, R. I., Dillin, A., Kelly, J. W., Balch, W. E. Biological and chemical approaches to diseases of proteostasis deficiency. Annual Review of Biochemistry. 78, 959-991 (2009).
- Brehme, M., et al. A chaperome subnetwork safeguards proteostasis in aging and neurodegenerative disease. Cell Reports. 9 (3), 1135-1150 (2014).
- Sala, A. J., Bott, L. C., Morimoto, R. I. Shaping proteostasis at the cellular, tissue, and organismal level. Journal of Cell Biology. 216 (5), 1231-1241 (2017).
- Braak, H., Braak, E., Strothjohann, M. Abnormally phosphorylated tau protein related to the formation of neurofibrillary tangles and neuropil threads in the cerebral cortex of sheep and goat. Neuroscience Letters. 171 (1-2), 1-4 (1994).
- Poirier, M. A., Jiang, H., Ross, C. A. A structure-based analysis of huntingtin mutant polyglutamine aggregation and toxicity: evidence for a compact beta-sheet structure. Human Molecular Genetics. 14 (6), 765-774 (2005).
- Vilchez, D., Saez, I., Dillin, A. The role of protein clearance mechanisms in organismal ageing and age-related diseases. Nature Communications. 5, 5659 (2014).
- Eftekharzadeh, B., Hyman, B. T., Wegmann, S. Structural studies on the mechanism of protein aggregation in age related neurodegenerative diseases. Mechanisms of Ageing and Development. 156, 1-13 (2016).
- Pokrishevsky, E., Grad, L. I., Cashman, N. R. TDP-43 or FUS-induced misfolded human wild-type SOD1 can propagate intercellularly in a prion-like fashion. Scientific Reports. 6, 22155 (2016).
- Mukherjee, A., Morales-Scheihing, D., Butler, P. C., Soto, C. Type 2 diabetes as a protein misfolding disease. Trends in Molecular Medicine. 21 (7), 439-449 (2015).
- Sikkink, L. A., Ramirez-Alvarado, M. Biochemical and aggregation analysis of Bence Jones proteins from different light chain diseases. Amyloid. 15 (1), 29-39 (2008).
- Qu, B. H., Strickland, E., Thomas, P. J. Cystic fibrosis: a disease of altered protein folding. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 29 (5), 483-490 (1997).
- Qu, B. H., Strickland, E. H., Thomas, P. J. Localization and suppression of a kinetic defect in cystic fibrosis transmembrane conductance regulator folding. Journal of Biological Chemistry. 272 (25), 15739-15744 (1997).
- Brignull, H. R., Moore, F. E., Tang, S. J., Morimoto, R. I. Polyglutamine proteins at the pathogenic threshold display neuron-specific aggregation in a pan-neuronal Caenorhabditis elegans model. Journal of Neuroscience. 26 (29), 7597-7606 (2006).
- Gidalevitz, T., Ben-Zvi, A., Ho, K. H., Brignull, H. R., Morimoto, R. I. Progressive disruption of cellular protein folding in models of polyglutamine diseases. Science. 311 (5766), 1471-1474 (2006).
- Morimoto, R. I. Stress, aging, and neurodegenerative disease. New England Journal of Medicine. 355 (21), 2254-2255 (2006).
- Morimoto, R. I. Proteotoxic stress and inducible chaperone networks in neurodegenerative disease and aging. Genes & Development. 22 (11), 1427-1438 (2008).
- Walker, F. O. Huntington’s disease. Lancet. 369 (9557), 218-228 (2007).
- Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biology. 2 (1), 0002 (2001).
- Karady, I., et al. Using Caenorhabditis elegans as a model system to study protein homeostasis in a multicellular organism. Journal of Visualized Experiments. (82), e50840 (2013).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
- Cornwell, A. B., Llop, J. R., Salzman, P., Thakar, J., Samuelson, A. V. The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan. Journal of Visualized Experiments. (136), e57819 (2018).
- Angeli, S., et al. A DNA synthesis inhibitor is protective against proteotoxic stressors via modulation of fertility pathways in Caenorhabditis elegans. Aging (Albany NY). 5 (10), 759-769 (2013).
- Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset. PLoS One. 9 (1), 85964 (2014).
- Byerly, L., Cassada, R. C., Russell, R. L. The life cycle of the nematode Caenorhabditis elegans. I. Wild-type growth and reproduction. Developmental Biology. 51 (1), 23-33 (1976).
- Schemper, M. Cox Analysis of Survival Data with Non-Proportional Hazard Functions. Journal of the Royal Statistical Society. Series D (The Statistician). 41 (4), 455-465 (1992).
- Royston, P., Parmar, M. K. The use of restricted mean survival time to estimate the treatment effect in randomized clinical trials when the proportional hazards assumption is in doubt. Statistics in Medicine. 30 (19), 2409-2421 (2011).
- Campbell, I. Chi-squared and Fisher-Irwin tests of two-by-two tables with small sample recommendations. Statistics in Medicine. 26 (19), 3661-3675 (2007).
- Busing, F. M., Weaver, B., Dubois, S. 2 x 2 Tables: a note on Campbell’s recommendation. Statistics in Medicine. 35 (8), 1354-1358 (2016).
- Das, R., et al. The homeodomain-interacting protein kinase HPK-1 preserves protein homeostasis and longevity through master regulatory control of the HSF-1 chaperone network and TORC1-restricted autophagy in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 13 (10), 1007038 (2017).
- Garcia, S. M., Casanueva, M. O., Silva, M. C., Amaral, M. D., Morimoto, R. I. Neuronal signaling modulates protein homeostasis in Caenorhabditis elegans post-synaptic muscle cells. Genes & Development. 21 (22), 3006-3016 (2007).
- Morley, J. F., Brignull, H. R., Weyers, J. J., Morimoto, R. I. The threshold for polyglutamine-expansion protein aggregation and cellular toxicity is dynamic and influenced by aging in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (16), 10417-10422 (2002).
- Labbadia, J., Morimoto, R. I. Repression of the Heat Shock Response Is a Programmed Event at the Onset of Reproduction. Molecular Cell. 59 (4), 639-650 (2015).
- Shemesh, N., Shai, N., Ben-Zvi, A. Germline stem cell arrest inhibits the collapse of somatic proteostasis early in Caenorhabditis elegans adulthood. Aging Cell. 12 (5), 814-822 (2013).
- Ben-Zvi, A., Miller, E. A., Morimoto, R. I. Collapse of proteostasis represents an early molecular event in Caenorhabditis elegans aging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (35), 14914-14919 (2009).
- Walther, D. M., et al. Widespread Proteome Remodeling and Aggregation in Aging C. elegans. Cell. 161 (4), 919-932 (2015).
- Cohen, E., Bieschke, J., Perciavalle, R. M., Kelly, J. W., Dillin, A. Opposing activities protect against age-onset proteotoxicity. Science. 313 (5793), 1604-1610 (2006).
- Silva, M. C., et al. A genetic screening strategy identifies novel regulators of the proteostasis network. PLoS Genetics. 7 (12), 1002438 (2011).
- Zhang, L., Ward, J. D., Cheng, Z., Dernburg, A. F. The auxin-inducible degradation (AID) system enables versatile conditional protein depletion in C. elegans. Development. 142 (24), 4374-4384 (2015).
- Hansen, M., Hsu, A. L., Dillin, A., Kenyon, C. New genes tied to endocrine, metabolic, and dietary regulation of lifespan from a Caenorhabditis elegans genomic RNAi screen. PLoS Genetics. 1 (1), 119-128 (2005).
- Nollen, E. A., et al. Genome-wide RNA interference screen identifies previously undescribed regulators of polyglutamine aggregation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (17), 6403-6408 (2004).
- Samuelson, A. V., Carr, C. E., Ruvkun, G. Gene activities that mediate increased life span of C. elegans insulin-like signaling mutants. Genes & Development. 21 (22), 2976-2994 (2007).
- Johnson, D. W., et al. The Caenorhabditis elegans Myc-Mondo/Mad complexes integrate diverse longevity signals. PLoS Genetics. 10 (4), 1004278 (2014).
- Wang, Z., Sherwood, D. R. Dissection of genetic pathways in C. elegans. Methods in Cell Biology. 106, 113-157 (2011).
- Jorgensen, E. M., Mango, S. E. The art and design of genetic screens: caenorhabditis elegans. Nature Reviews Genetics. 3 (5), 356-369 (2002).
