JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

Kwantificering van weefselspecifieke proteostatische achteruitgang van Caenorhabditis elegans

Published: September 07, 2021
doi:
10.3791/61100
, ,
1Department of Biomedical Genetics,University of Rochester Medical Center

Summary

Proteostatische achteruitgang is een kenmerk van veroudering en vergemakkelijkt het begin van neurodegeneratieve ziekten. We schetsen een protocol om proteostase kwantificeerbaar te meten in twee verschillende Caenorhabditis elegans-weefsels door heterologe expressie van polyglutamine-herhalingen gefuseerd met een fluorescerende verslaggever. Dit model maakt een snelle in vivo genetische analyse van proteostase mogelijk.

Abstract

Het vermogen om een goede functie en vouwing van het proteoom (eiwithomeostase) te behouden, neemt af tijdens normale veroudering, waardoor het begin van een groeiend aantal leeftijdsgebonden ziekten wordt vergemakkelijkt. Eiwitten met polyglutamine-uitbreidingen zijn bijvoorbeeld gevoelig voor aggregatie, zoals geïllustreerd met het huntingtine-eiwit en het gelijktijdige begin van de ZvH. De leeftijdsgebonden verslechtering van het proteoom is op grote schaal bestudeerd door het gebruik van transgene Caenorhabditis elegans die polyQ-herhalingen tot expressie brengen die zijn gefuseerd met een geel fluorescerend eiwit (YFP). Dit polyQ::YFP transgene diermodel vergemakkelijkt de directe kwantificering van de leeftijdsgebonden achteruitgang van het proteoom door de progressieve vorming van fluorescerende foci (d.w.z. eiwitaggregaten) en het daaropvolgende begin van voortbewegingsdefecten die zich ontwikkelen als gevolg van de ineenstorting van het proteoom in beeld te brengen. Verder kan de expressie van het polyQ::YFP-transgen worden aangedreven door weefselspecifieke promotors, waardoor proteostase over weefsels kan worden beoordeeld in de context van een intact meercellig organisme. Dit model is zeer vatbaar voor genetische analyse en biedt dus een benadering om veroudering te kwantificeren die complementair is aan levensduurtests. We beschrijven hoe we de vorming van polyQ::YFP-foci in neuronen of lichaamswandspier tijdens het ouder worden nauwkeurig kunnen meten, en het daaropvolgende begin van gedragsdefecten. Vervolgens benadrukken we hoe deze benaderingen kunnen worden aangepast voor een hogere doorvoer en mogelijke toekomstige toepassingen met behulp van andere opkomende strategieën voor C. elegans genetische analyse.

Introduction

Eiwithomeostase (proteostase) wordt gedefinieerd als het cellulaire vermogen om de juiste functie en vouwing van het proteoom te behouden. De inherente uitdaging voor proteostase is ervoor te zorgen dat alle eiwitten goed worden gevouwen en onderhouden in een inheemse conformatie, die verder wordt versterkt door de gevarieerde aard van eiwitgrootte, aminozuursamenstelling, structurele conformatie, stabiliteit, omzet, expressie, subcellulaire compartimentering en modificaties1. Proteostase wordt gehandhaafd door de gecoördineerde werking van een groot proteostatisch netwerk, bestaande uit ongeveer 2000 unieke eiwitten, die de juiste synthese, vouwing, handel en afbraak binnen het proteoomreguleren 2,3. De werkpaardcomponenten van het proteostatische netwerk zijn negen belangrijke families van moleculaire chaperones4. Elk weefsel- en celtype maakt bij voorkeur gebruik van specifieke subsets van moleculaire chaperones, vermoedelijk in overeenstemming met de verschillende eisen van verschillende proteomen5.

Een kenmerk van normale organismale veroudering is de progressieve afname en ineenstorting van cellulaire proteostase, waarvan wordt gedacht dat het een onderliggende basis is voor het begin en de progressie van een groeiend aantal leeftijdsgebonden ziekten. De ziekte van Alzheimer, de ziekte van Parkinson, de ziekte van Huntington en Amyotrofische Laterale Sclerose (ALS) hebben bijvoorbeeld een gemeenschappelijk kenmerk: in elk geval wordt manifestatie van neurodegeneratie aangedreven door genetische veranderingen die een gemuteerd eiwit vatbaar maken voor aggregatie (respectievelijk amyloïde-β / Tau, α-synucleïne, HTT, FUS / TBD-43 / SOD-1)6,7,8,9,10 . Tijdens veroudering neemt de integriteit en induceerbaarheid van het proteostatische netwerk af, wat resulteert in de accumulatie van proteotoxische aggregaten die resulteren in cellulaire disfunctie en neurodegeneratie. Van belang is dat eiwit conformatieziekten niet uniek zijn voor neuronen en voorkomen in meerdere weefsels, zoals benadrukt door type II diabetes, multipel myeloom en cystische fibrose11,12,13,14. Daarom zal het ophelderen van mechanismen die in staat zijn om proteostase te behouden, de ontwikkeling van gerichte interventies voor de behandeling van ziekten en om gezond ouder worden te bevorderen, vergemakkelijken.

De kleine bodemnematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) heeft een belangrijke rol gespeeld bij het ontdekken van genen en het ophelderen van routes die de proteostase veranderen. Veel componenten van het proteostatische netwerk en de signaaltransductieroutes die de proteostase reguleren, zijn evolutionair geconserveerd. Bovendien heeft C. elegans de complexiteit en redundantie ten opzichte van gewervelde systemen verminderd, waardoor het meer vatbaar is voor genetische analyse en genontdekking. Bijkomende voordelen van C. elegans die ertoe hebben geleid dat het op grote schaal wordt gebruikt als een modelsysteem om proteostase te bestuderen, zijn onder meer: krachtige genetische en functionele genomica, een korte levenscyclus (3 dagen) en levensduur (3 weken), een compact en goed geannoteerd genoom, de beschikbaarheid van een breed assortiment genetische mutanten en het gemak van het visualiseren van weefselspecifieke veranderingen in de celbiologie met behulp van fluorescerende reporters.

Het progressieve verval van proteostase tijdens veroudering kan gemakkelijk worden gekwantificeerd in C. elegans. Het Morimoto-laboratorium toonde voor het eerst aan dat een polyglutamine-expansie gefuseerd tot geel fluorescerend eiwit (polyQ: : YFP) kon worden gebruikt om proteostatische afname van C. elegans tijdens veroudering15,16,17,18te kwantificeren. YFP-fusies tot 35 glutamine-herhalingen of meer resulteren in een leeftijdsgebonden vorming van fluorescerende foci samen met tekenen van cellulaire pathologie. Van belang is dat dit bereik van glutamine-expansie de lengte weerspiegelt van het polyglutaminekanaal van het huntingtine-eiwit waarbij de pathologie van de ziekte van Huntington bij mensen begint te worden waargenomen (meestal >35 CAG-herhalingen)19. Stammen met expressie van polyQ::YFP in spier-, darm- of neuronale cellen zijn gebruikt om te bevestigen dat de leeftijdsgebonden achteruitgang van proteostase optreedt in verschillende cel- en weefseltypen. Spierspecifieke polyQ::YFP-expressie (d.w.z. unc-54p::Q35::YFP) is de meest gebruikte weefselspecifieke verslaggever, omdat accumulerende fluorescerende foci gemakkelijk te kwantificeren zijn gedurende de eerste paar dagen van de volwassenheid met behulp van een eenvoudige fluorescerende ontleedmicroscoop (Figuur 1A-1B). Bovendien raken dieren verlamd tijdens het midden van het leven, omdat het proteoom in de spier instort als gevolg van het proteotoxische effect van de verslaggever (figuur 1C). Evenzo kan de leeftijdsgebonden afname van neuronale proteostase worden gevolgd (rgef-1p::Q40::YFP) door het direct kwantificeren van foci/aggregaatvorming en leeftijdsgebonden afnames in gecoördineerde lichaamsbuigingen na het plaatsen van dieren in vloeistof(Figuur 2).

Hier presenteren we een gedetailleerd protocol over het meten van de leeftijdsafhankelijke progressie van eiwitaggregatieaccumulatie en de bijbehorende proteotoxiciteit geïnduceerd door de expressie van polyglutamineherhalingen in neuronaal en spierweefsel in C. elegans. We geven voorbeelden van typische resultaten die worden gegenereerd met behulp van deze stammen en methoden. Verder laten we zien hoe we deze methoden hebben gebruikt om transcriptionele regulatie van het proteostatische netwerk te bestuderen. We bespreken aanvullende manieren waarop deze reporters eenvoudig kunnen worden geïntegreerd met andere bestaande reagentia of kunnen worden aangepast voor grotere schermen.

Protocol

1. Bereiding van reagentia Selecteer genen die van belang zijn om te worden geïnactiveerd via op voeding gebaseerde RNAi. Koop voorraden HT115 E. coli met daarin de RNAi-kloon van belang20. Als alternatief subclone het cDNA van het gen van belang in de multicloning site van de L4440 plasmide.OPMERKING: Om afbraak van dsRNA in de bacteriën te voorkomen, gebruikt u de HT115-stam. Dit is een RNase III-deficiënte E. coli-stam met IPTG-induceerbare T7-polymerase-activ…

Representative Results

In C. elegansis het polyglutamine-herhalingsmodel instrumenteel geweest voor de identificatie van genen die het proteostatische netwerk reguleren. We hebben bijvoorbeeld eerder aangetoond dat het homeodomain-interagerende eiwitkinase (hpk-1), een transcriptionele cofactor, de proteostase tijdens veroudering beïnvloedt door de expressie van autofagie en moleculaire chaperones te reguleren31. We ontdekten dat verlies van hpk-1, hetzij door RNAi-uitschakeling of in hpk…

Discussion

Veroudering wordt gekenmerkt door een geleidelijke afname van proteostase. Proteostase wordt onderhouden door een complex systeem, het proteostatische netwerk, voor de gecoördineerde, dynamische, stressresponsieve controle van eiwitvouwing, -afbraak en -translatie. Waarom proteostase faalt in de loop van het ouder worden is slecht begrepen, maar een rottend epigenoom, afnemende induceerbaarheid van stressreacties en verlies van compenserende overspraak vallen allemaal samen met deze afbraak. Bij C. elegans neem…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We willen graag voormalige en huidige leden van het Samuelson-laboratorium bedanken voor hun hulp bij de verfijning van deze methode en / of discussie die de ontwikkeling van dit manuscript heeft geholpen. Onderzoek gerapporteerd in deze publicatie werd ondersteund door het National Institute on Aging van de National Institutes of Health onder awardnummers RF1AG062593 en R21AG064519. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van de National Institutes of Health. De financiers hadden geen rol in het ontwerp van de studie, het verzamelen en analyseren van gegevens, de beslissing om te publiceren of de voorbereiding van het manuscript.

Materials

24 Well Culture Plates Greiner Bio-One #662102
2 mL 96-well plates Greiner Bio-One #780286
600 µL 96-well plates Greiner Bio-One #786261
96-pin plate replicator Nunc 250520
Air-permeable plate seal VWR 60941-086
bacteriological agar Affymetrix/USB 10906
bacto-peptone VWR 90000-368
C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Ahringer Source Bioscience C. elegans RNAi Collection (Ahringer) See also Kamath et. al, Nature 2003.
C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Vidal Source Bioscience C. elegans ORF-RNAi Resource (Vidal) See also Rual et. al, Genome Research 2004. This library is also available from Dharmacon.
FuDR (5-Fluoro-2'-deoxyuridine) Alfa Aesar L16497
Glass microscope cover slips VWR 48404-455
Glass microscope slides VWR 160004-422
IPTG (isopropyl beta-D-1-thigalactopyranoside) Gold Bio 12481C100
Retangular non-treated single-well plate, 128x86mm Thermo-Fisher 242811
Sodium Azide, CAS #26628-22-8 Sigma-Aldrich S2002
Zeiss Axio Imager M2m microscope with AxioVision v4.8.2.0 software Zeiss unknown
Zeiss StemiSV11 M2 Bio Quad microscope Zeiss unknown
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wolff, S., Weissman, J. S., Dillin, A. Differential scales of protein quality control. Cell. 157 (1), 52-64 (2014).
  2. Labbadia, J., Morimoto, R. I. The biology of proteostasis in aging and disease. Annual Review of Biochemistry. 84, 435-464 (2015).
  3. Powers, E. T., Morimoto, R. I., Dillin, A., Kelly, J. W., Balch, W. E. Biological and chemical approaches to diseases of proteostasis deficiency. Annual Review of Biochemistry. 78, 959-991 (2009).
  4. Brehme, M., et al. A chaperome subnetwork safeguards proteostasis in aging and neurodegenerative disease. Cell Reports. 9 (3), 1135-1150 (2014).
  5. Sala, A. J., Bott, L. C., Morimoto, R. I. Shaping proteostasis at the cellular, tissue, and organismal level. Journal of Cell Biology. 216 (5), 1231-1241 (2017).
  6. Braak, H., Braak, E., Strothjohann, M. Abnormally phosphorylated tau protein related to the formation of neurofibrillary tangles and neuropil threads in the cerebral cortex of sheep and goat. Neuroscience Letters. 171 (1-2), 1-4 (1994).
  7. Poirier, M. A., Jiang, H., Ross, C. A. A structure-based analysis of huntingtin mutant polyglutamine aggregation and toxicity: evidence for a compact beta-sheet structure. Human Molecular Genetics. 14 (6), 765-774 (2005).
  8. Vilchez, D., Saez, I., Dillin, A. The role of protein clearance mechanisms in organismal ageing and age-related diseases. Nature Communications. 5, 5659 (2014).
  9. Eftekharzadeh, B., Hyman, B. T., Wegmann, S. Structural studies on the mechanism of protein aggregation in age related neurodegenerative diseases. Mechanisms of Ageing and Development. 156, 1-13 (2016).
  10. Pokrishevsky, E., Grad, L. I., Cashman, N. R. TDP-43 or FUS-induced misfolded human wild-type SOD1 can propagate intercellularly in a prion-like fashion. Scientific Reports. 6, 22155 (2016).
  11. Mukherjee, A., Morales-Scheihing, D., Butler, P. C., Soto, C. Type 2 diabetes as a protein misfolding disease. Trends in Molecular Medicine. 21 (7), 439-449 (2015).
  12. Sikkink, L. A., Ramirez-Alvarado, M. Biochemical and aggregation analysis of Bence Jones proteins from different light chain diseases. Amyloid. 15 (1), 29-39 (2008).
  13. Qu, B. H., Strickland, E., Thomas, P. J. Cystic fibrosis: a disease of altered protein folding. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 29 (5), 483-490 (1997).
  14. Qu, B. H., Strickland, E. H., Thomas, P. J. Localization and suppression of a kinetic defect in cystic fibrosis transmembrane conductance regulator folding. Journal of Biological Chemistry. 272 (25), 15739-15744 (1997).
  15. Brignull, H. R., Moore, F. E., Tang, S. J., Morimoto, R. I. Polyglutamine proteins at the pathogenic threshold display neuron-specific aggregation in a pan-neuronal Caenorhabditis elegans model. Journal of Neuroscience. 26 (29), 7597-7606 (2006).
  16. Gidalevitz, T., Ben-Zvi, A., Ho, K. H., Brignull, H. R., Morimoto, R. I. Progressive disruption of cellular protein folding in models of polyglutamine diseases. Science. 311 (5766), 1471-1474 (2006).
  17. Morimoto, R. I. Stress, aging, and neurodegenerative disease. New England Journal of Medicine. 355 (21), 2254-2255 (2006).
  18. Morimoto, R. I. Proteotoxic stress and inducible chaperone networks in neurodegenerative disease and aging. Genes & Development. 22 (11), 1427-1438 (2008).
  19. Walker, F. O. Huntington’s disease. Lancet. 369 (9557), 218-228 (2007).
  20. Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biology. 2 (1), 0002 (2001).
  21. Karady, I., et al. Using Caenorhabditis elegans as a model system to study protein homeostasis in a multicellular organism. Journal of Visualized Experiments. (82), e50840 (2013).
  22. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
  23. Cornwell, A. B., Llop, J. R., Salzman, P., Thakar, J., Samuelson, A. V. The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan. Journal of Visualized Experiments. (136), e57819 (2018).
  24. Angeli, S., et al. A DNA synthesis inhibitor is protective against proteotoxic stressors via modulation of fertility pathways in Caenorhabditis elegans. Aging (Albany NY). 5 (10), 759-769 (2013).
  25. Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset. PLoS One. 9 (1), 85964 (2014).
  26. Byerly, L., Cassada, R. C., Russell, R. L. The life cycle of the nematode Caenorhabditis elegans. I. Wild-type growth and reproduction. Developmental Biology. 51 (1), 23-33 (1976).
  27. Schemper, M. Cox Analysis of Survival Data with Non-Proportional Hazard Functions. Journal of the Royal Statistical Society. Series D (The Statistician). 41 (4), 455-465 (1992).
  28. Royston, P., Parmar, M. K. The use of restricted mean survival time to estimate the treatment effect in randomized clinical trials when the proportional hazards assumption is in doubt. Statistics in Medicine. 30 (19), 2409-2421 (2011).
  29. Campbell, I. Chi-squared and Fisher-Irwin tests of two-by-two tables with small sample recommendations. Statistics in Medicine. 26 (19), 3661-3675 (2007).
  30. Busing, F. M., Weaver, B., Dubois, S. 2 x 2 Tables: a note on Campbell’s recommendation. Statistics in Medicine. 35 (8), 1354-1358 (2016).
  31. Das, R., et al. The homeodomain-interacting protein kinase HPK-1 preserves protein homeostasis and longevity through master regulatory control of the HSF-1 chaperone network and TORC1-restricted autophagy in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 13 (10), 1007038 (2017).
  32. Garcia, S. M., Casanueva, M. O., Silva, M. C., Amaral, M. D., Morimoto, R. I. Neuronal signaling modulates protein homeostasis in Caenorhabditis elegans post-synaptic muscle cells. Genes & Development. 21 (22), 3006-3016 (2007).
  33. Morley, J. F., Brignull, H. R., Weyers, J. J., Morimoto, R. I. The threshold for polyglutamine-expansion protein aggregation and cellular toxicity is dynamic and influenced by aging in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (16), 10417-10422 (2002).
  34. Labbadia, J., Morimoto, R. I. Repression of the Heat Shock Response Is a Programmed Event at the Onset of Reproduction. Molecular Cell. 59 (4), 639-650 (2015).
  35. Shemesh, N., Shai, N., Ben-Zvi, A. Germline stem cell arrest inhibits the collapse of somatic proteostasis early in Caenorhabditis elegans adulthood. Aging Cell. 12 (5), 814-822 (2013).
  36. Ben-Zvi, A., Miller, E. A., Morimoto, R. I. Collapse of proteostasis represents an early molecular event in Caenorhabditis elegans aging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (35), 14914-14919 (2009).
  37. Walther, D. M., et al. Widespread Proteome Remodeling and Aggregation in Aging C. elegans. Cell. 161 (4), 919-932 (2015).
  38. Cohen, E., Bieschke, J., Perciavalle, R. M., Kelly, J. W., Dillin, A. Opposing activities protect against age-onset proteotoxicity. Science. 313 (5793), 1604-1610 (2006).
  39. Silva, M. C., et al. A genetic screening strategy identifies novel regulators of the proteostasis network. PLoS Genetics. 7 (12), 1002438 (2011).
  40. Zhang, L., Ward, J. D., Cheng, Z., Dernburg, A. F. The auxin-inducible degradation (AID) system enables versatile conditional protein depletion in C. elegans. Development. 142 (24), 4374-4384 (2015).
  41. Hansen, M., Hsu, A. L., Dillin, A., Kenyon, C. New genes tied to endocrine, metabolic, and dietary regulation of lifespan from a Caenorhabditis elegans genomic RNAi screen. PLoS Genetics. 1 (1), 119-128 (2005).
  42. Nollen, E. A., et al. Genome-wide RNA interference screen identifies previously undescribed regulators of polyglutamine aggregation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (17), 6403-6408 (2004).
  43. Samuelson, A. V., Carr, C. E., Ruvkun, G. Gene activities that mediate increased life span of C. elegans insulin-like signaling mutants. Genes & Development. 21 (22), 2976-2994 (2007).
  44. Johnson, D. W., et al. The Caenorhabditis elegans Myc-Mondo/Mad complexes integrate diverse longevity signals. PLoS Genetics. 10 (4), 1004278 (2014).
  45. Wang, Z., Sherwood, D. R. Dissection of genetic pathways in C. elegans. Methods in Cell Biology. 106, 113-157 (2011).
  46. Jorgensen, E. M., Mango, S. E. The art and design of genetic screens: caenorhabditis elegans. Nature Reviews Genetics. 3 (5), 356-369 (2002).

Tags

Keywords: ProteostasisCaenorhabditis ElegansPolyglutamine Fluorescent ReporterAgingProtein Misfolding DiseasesAlzheimer’sParkinson’sHuntington’s DiseaseAmyotrophic Lateral SclerosisRNAiOP50 E.coliHypochlorite TreatmentL1 Animals
check_url/61100?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Lazaro-Pena, M. I., Cornwell, A. B., Samuelson, A. V. Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (175), e61100, doi:10.3791/61100 (2021).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image