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Biology

Caenorhabditis 예인단에서 조직 특정 전립선 성 감소를 정량화

Published: September 07, 2021
doi:
10.3791/61100
, ,
1Department of Biomedical Genetics,University of Rochester Medical Center

Summary

전립선성 감소는 노화의 특징입니다, 신경 퇴행성 질환의 발병을 촉진. 우리는 형광 기자에게 융합 된 폴리 글루타민 반복의 이종 발현을 통해 두 가지 다른 Caenorhabditis elegans 조직에서 프로테오스타시스를 정량적으로 측정하는 프로토콜을 설명합니다. 이 모델은 프로테오스타증의 생체 내 유전 적 분석을 빠르게 허용합니다.

Abstract

프로테오메(단백질 항상성)의 적절한 기능과 접이식 기능을 유지하는 능력은 정상적인 노화 시 감소하여 점점 증가하는 연령 관련 질병의 발병을 용이하게 합니다. 예를 들어, 폴리글루타민 팽창을 가진 단백질은 헌팅턴 병의 헌팅틴 단백질과 수반되는 발병으로 예시되는 것처럼 응집되기 쉽습니다. 프로테오메의 노화와 관련된 악화는 황색 형광 단백질(YFP)에 융합된 폴리Q 반복을 발현하는 트랜스제닉 Caenorhabditis elegans의 사용을 통해 널리 연구되고 있다. 이러한 폴리Q:YFP 형질형 동물 모델은 형광 포시의 점진적 형성(즉, 단백질 골재)의 점진적 형성과 프로테오메의 붕괴로 인해 발생하는 운동 결함의 후속 개시를 이미징을 통해 프로테오메의 노화와 관련된 쇠퇴의 직접적인 정량화를 용이하게 한다. 또한, polyQ:YFP 트랜스진의 발현은 조직별 프로모터에 의해 구동될 수 있으며, 손상되지 않은 다세포 유기체의 맥락에서 조직 전반에 걸친 프로테오스타시스의 평가를 허용한다. 이 모델은 유전 분석에 매우 적합하므로 수명 분석에 보완되는 노화를 정량화하는 접근 법을 제공합니다. 우리는 정확하게 polyQ를 측정하는 방법을 설명합니다: YFP foci 형성 중 뉴런 또는 노화 중 신체 벽 근육, 그리고 행동 결함의 후속 개시. 다음으로, 우리는 이 접근이 더 높은 처리량, 및 C. elegans 유전 분석을 위한 그밖 신흥 전략을 사용하여 잠재적인 미래 응용을 위해 어떻게 적응될 수 있는지 강조합니다.

Introduction

단백질 항상성 (proteostasis)은 프로테오메의 적절한 기능과 접기를 유지하는 세포 능력으로 정의됩니다. 프로테오스타증에 대한 내재된 과제는 모든 단백질이 단백질 크기, 아미노산 조성, 구조적 형태, 안정성, 회전율, 발현, 서브 셀룰러 구획화 및 변형1의다양한 특성에 의해 더욱 증폭되는 토착 형태에서 제대로 접혀 유지되도록 하는 것이다. 프로테오스타증은 프로테오메2,3내에서 적절한 합성, 접기, 인신 매매 및 분해를 조절하는 약 2,000개의 고유 단백질로 구성된 대형 프로테온성 네트워크의 조정된 작용을 통해 유지된다. 프로테오톤 네트워크의 주력 성분은 분자 샤페론4의9개 주요 패밀리입니다. 모든 조직 및 세포 유형은 분자 보호자의 특정 하위 집합을 우선적으로 활용하며, 아마도 뚜렷한프로테옴(5)의 다른 요구와 일치한다.

정상적인 유기체 노화의 한 가지 특징은 세포 프로테오스타증의 점진적 쇠퇴와 붕괴이며, 이는 점점 더 많은 연령 관련 질병의 발병 및 진행을 위한 근본적인 기초로 여겨진다. 예를 들어, 알츠하이머 병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 근위축성 측삭 경화증(ALS)은 공통적인 특성을 공유합니다: 각 경우 신경변성 증상은 돌연변이 단백질을 응집(아밀로이드-β/타우, α-시뉴클레인, HTT,FUS/TBD/1, 10, 10, 10, 10, 73/ SOD, 10, SOD/10) . 노화 하는 동안, 무결성 및 프로 테 오 정성 네트워크의 유도 감소, 세포 기능 장애 및 신경 변성을 초래 하는 proteotoxic 집계의 축적 결과. 참고, 단백질 형성 질환은 뉴런에 만전지지 않으며, 타입 II 당뇨병, 다발성 골수종 및낭포성 섬유증(11,12,13,14)에의해 강조되는 바와 같이 여러 조직에 걸쳐 발생합니다. 따라서, 프로테오스타증을 보존할 수 있는 해명기들은 질병의 치료를 위한 표적 개입의 개발을 용이하게 하고 건강한 노화를 촉진할 것이다.

작은 토양 선충 천골 Caenorhabditis elegans (C. elegans)는유전자를 발견하고 proteostasis를 변경하는 경로를 해명하는 데 중요한 역할을하고있다. 프로테오스타시스를 조절하는 프로테오스테아시스의 많은 구성 요소와 신호 변환 경로는 진화적으로 보존된다. 더욱이, C. elegans는 척추 동물 시스템에 비해 복잡성과 중복성을 감소시켜 유전자 분석 및 유전자 발견에 더 많은 의무를 다합니다. 프로테오스타증을 연구하기 위한 모델 시스템으로 널리 사용되는 C. elegans의 추가 장점은 다음과 같습니다: 강력한 유전 및 기능적 유전체학, 짧은 수명 주기(3일) 및 수명 기간(3주), 작고 잘 기름부음게놈, 유전 돌연변이의 넓은 구색의 가용성, 및 세포 생물학을 이용한 시각적 조직 별 변화의 용이성 등이 있습니다.

노화 중 프로테오스타증의 점진적 붕괴는 C. 엘레간에서 쉽게 정량화될 수 있다. 모리모토 연구소는 먼저 노란 형광 단백질(polyQ::YFP)에융합된 폴리글루타민 팽창이 노화15,16,17,18동안 C. 예르간에서 프로티온성 감소를 정량화하는 데 사용될 수 있음을 입증하였다. 35글루타민반복에 YFP 융합은 세포 병리학의 표시와 더불어 형광 포시의 나이 관련 형성귀착됩니다. 참고, 글루타민 팽창의 이 범위는 헌팅턴병 병리학이 인간에서 관찰되기 시작하는 헌팅틴 단백질의 폴리글루타민 관의 길이를 반영한다(일반적으로 >35 CAG 반복)19. polyQ의 발현을 가진 긴장: 근육 내의 YFP, 장, 또는 신경 세포는 proteostasis의 나이 관련 쇠퇴가 다른 세포 및 조직 모형에 걸쳐 생기는다는 것을 확인하기 위하여 이용되었습니다. 근육별 폴리Q::YFP 발현(즉, unc-54p:Q35::YFP)은형광포를 축적하는 것이 단순 형광 해부 현미경(그림 1A-1B)을사용하여 성인기의 처음 며칠 동안 정량화하기쉽기 때문에 가장 널리 사용되는 조직별 기자입니다. 또한, 동물은 중년 동안 마비되고, 근육 내의 프로테오메가리포터(도 1C)의프로테오독성 효과로 인해 붕괴된다. 유사하게, 뉴런 프로테오스타증의 연령과 관련된 쇠퇴는 동물을 액체로 배치한 후 조정된 신체 굽힘에서 포시/골재 형성 및 연령과 관련된 감소를 직접 정량화함으로써 따를 수있다(그림2).

여기서, 우리는 C. elegans내뉴런 및 근육 조직 내에서 폴리글루타민 반복의 발현에 의해 유도된 단백질 골집 축적 및 관련 프로테오독성의 연령 의존적 진행을 측정하는 방법에 대한 상세한 프로토콜을 제시한다. 이러한 균주와 방법을 사용하여 생성된 일반적인 결과의 예를 제공합니다. 또한, 우리는 우리가 프로테오틱 네트워크의 전사 적 규제를 연구하기 위해 이러한 방법을 활용하는 방법을 보여줍니다. 우리는 이러한 기자가 다른 기존 시약과 쉽게 통합되거나 더 큰 화면에 적응 할 수있는 추가 방법에 대해 논의합니다.

Protocol

1. 시약 준비 먹이 기반 RNAi를 통해 비활성화 될 관심의 유전자를 선택합니다. HT115 E. 대장균의 주식 을 인수하여 RNAi 클론을 함유하고있다 20. 대안적으로, L4440 플라스미드의 다중 클론 부위로 관심 있는 유전자의 cDNA를 아복제한다.참고: 박테리아 내의 dsRNA의 분해를 방지하려면 HT115 균주를 사용하십시오. 이는 IPTG 유도 T7 폴리머라제 활성을 가진 RNase III-결핍 …

Representative Results

C. elegans에서,폴리 글루타민 반복 모델은 전립선 네트워크를 조절하는 유전자의 식별에 중요한 역할을하고있다. 예를 들어, 이전에는 동종 도메인상호작용 단백질 키나아제(hpk-1),전사 적 공동인이 노화 중 프로테오스타증에 영향을 미치는 것으로나타났다. 우리는 HPK-1의손실, RNAi 침묵 또는 hpk-1 (pk1393) null 돌연변이 동물의 손실, 노화 하는 동안 축적 <em…

Discussion

노화는 프로테오스타증의 점진적인 감소를 특징으로 합니다. 프로테오스타증은 단백질 접기, 분해 및 번역의 조정되고 역동적이며 스트레스 반응성이 뛰어난 제어를 위해 복잡한 시스템, 프로테오틱 네트워크로 유지됩니다. 왜 proteostasis 노화의 과정에서 실패 제대로 이해, 하지만 부패 후성 게놈, 스트레스 응답의 감소 유도성 감소, 그리고 보상 크로스 토크의 손실 모두이 고장과 일치. C. eleg…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

우리는 이 원고의 개발을 도운 이 방법의 정교함 및/또는 토론에 도움을 준 새뮤얼슨 연구소의 과거와 현재 회원들에게 감사드립니다. 이 간행물에 보고된 연구는 상 번호 RF1AG062593 및 R21AG064519의 밑에 건강의 국가 학회에 의하여 지원되었습니다. 이 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 보건원의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다. 기금은 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 출판 결정 또는 원고 준비에 아무런 역할이 없었습니다.

Materials

24 Well Culture Plates Greiner Bio-One #662102
2 mL 96-well plates Greiner Bio-One #780286
600 µL 96-well plates Greiner Bio-One #786261
96-pin plate replicator Nunc 250520
Air-permeable plate seal VWR 60941-086
bacteriological agar Affymetrix/USB 10906
bacto-peptone VWR 90000-368
C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Ahringer Source Bioscience C. elegans RNAi Collection (Ahringer) See also Kamath et. al, Nature 2003.
C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Vidal Source Bioscience C. elegans ORF-RNAi Resource (Vidal) See also Rual et. al, Genome Research 2004. This library is also available from Dharmacon.
FuDR (5-Fluoro-2'-deoxyuridine) Alfa Aesar L16497
Glass microscope cover slips VWR 48404-455
Glass microscope slides VWR 160004-422
IPTG (isopropyl beta-D-1-thigalactopyranoside) Gold Bio 12481C100
Retangular non-treated single-well plate, 128x86mm Thermo-Fisher 242811
Sodium Azide, CAS #26628-22-8 Sigma-Aldrich S2002
Zeiss Axio Imager M2m microscope with AxioVision v4.8.2.0 software Zeiss unknown
Zeiss StemiSV11 M2 Bio Quad microscope Zeiss unknown
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References

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Keywords: ProteostasisCaenorhabditis ElegansPolyglutamine Fluorescent ReporterAgingProtein Misfolding DiseasesAlzheimer’sParkinson’sHuntington’s DiseaseAmyotrophic Lateral SclerosisRNAiOP50 E.coliHypochlorite TreatmentL1 Animals
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Lazaro-Pena, M. I., Cornwell, A. B., Samuelson, A. V. Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (175), e61100, doi:10.3791/61100 (2021).
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