Quantification du déclin protéostatique spécifique aux tissus chez Caenorhabditis elegans
Summary
Le déclin protéostatique est une caractéristique du vieillissement, facilitant l’apparition de maladies neurodégénératives. Nous décrivons un protocole pour mesurer quantifiablement la protéostase dans deux tissus différents de Caenorhabditis elegans par l’expression hétérologue de répétitions de polyglutamine fusionnées à un rapporteur fluorescent. Ce modèle permet une analyse génétique in vivo rapide de la protéostasie.
Abstract
La capacité de maintenir le bon fonctionnement et le repliement du protéome (homéostasie des protéines) diminue au cours du vieillissement normal, facilitant l’apparition d’un nombre croissant de maladies associées à l’âge. Par exemple, les protéines avec des expansions de polyglutamine sont sujettes à l’agrégation, comme en témoigne la protéine huntingtine et l’apparition concomitante de la maladie de Huntington. La détérioration du protéome associée à l’âge a été largement étudiée grâce à l’utilisation de Caenorhabditis elegans transgénique exprimant des répétitions polyQ fusionnées à une protéine fluorescente jaune (YFP). Ce modèle animal transgénique polyQ::YFP facilite la quantification directe du déclin du protéome associé à l’âge en imageant la formation progressive de foyers fluorescents (c.-à-d. les agrégats de protéines) et l’apparition subséquente de défauts de locomotion qui se développent à la suite de l’effondrement du protéome. De plus, l’expression du transgène polyQ::YFP peut être entraînée par des promoteurs spécifiques aux tissus, ce qui permet d’évaluer la protéostase à travers les tissus dans le contexte d’un organisme multicellulaire intact. Ce modèle se prête très bien à l’analyse génétique, fournissant ainsi une approche pour quantifier le vieillissement qui est complémentaire aux tests de durée de vie. Nous décrivons comment mesurer avec précision la formation de foyers polyQ::YFP dans les neurones ou les muscles de la paroi corporelle pendant le vieillissement, et l’apparition ultérieure de défauts de comportement. Ensuite, nous soulignons comment ces approches peuvent être adaptées pour un débit plus élevé et des applications futures potentielles en utilisant d’autres stratégies émergentes pour l’analyse génétique de C. elegans.
Introduction
L’homéostasie protéique (protéostasie) est définie comme la capacité cellulaire à maintenir le bon fonctionnement et le repliement du protéome. Le défi inhérent à la protéostasie est de s’assurer que toutes les protéines sont correctement repliées et maintenues dans une conformation native, qui est encore amplifiée par la nature variée de la taille des protéines, de la composition en acides aminés, de la conformation structurelle, de la stabilité, du renouvellement, de l’expression, du compartimentation subcellulaire et des modifications1. La protéostasie est maintenue grâce à l’action coordonnée d’un grand réseau protéostatique, composé d’environ 2000 protéines uniques, qui régulent la synthèse, le repliement, le trafic et la dégradation appropriés dans le protéome2,3. Les composants de travail du réseau protéostatique sont neuf grandes familles de chaperons moléculaires4. Chaque type de tissu et de cellule utilise préférentiellement des sous-ensembles spécifiques de chaperons moléculaires, probablement en alignement avec les différentes exigences de protéomes distincts5.
L’une des caractéristiques du vieillissement normal de l’organisme est le déclin progressif et l’effondrement de la protéostasie cellulaire, qui est considérée comme une base sous-jacente pour l’apparition et la progression d’un nombre croissant de maladies associées à l’âge. Par exemple, la maladie d’Alzheimer, la maladie de Parkinson, la maladie de Huntington et la sclérose latérale amyotrophique (SLA) partagent une caractéristique commune: dans chaque cas, la manifestation de la neurodégénérescence est entraînée par des altérations génétiques qui prédisposent une protéine mutante à l’agrégation (amyloïde-β / Tau, α-synucléine, HTT, FUS / TBD-43 / SOD-1, respectivement)6,7,8,9,10 . Au cours du vieillissement, l’intégrité et l’inductibilité du réseau protéostatique diminuent, ce qui entraîne l’accumulation d’agrégats protéotoxiques qui entraînent un dysfonctionnement cellulaire et une neurodégénérescence. Il convient de noter que les maladies conformationnelles protéiques ne sont pas uniques aux neurones et se produisent dans plusieurs tissus, comme en témoignent le diabète de type II, le myélome multiple et la fibrose kystique11,12,13,14. Par conséquent, l’élucidation des mécanismes capables de préserver la protéostasie facilitera le développement d’interventions ciblées pour le traitement de la maladie et pour favoriser un vieillissement en bonne santé.
Le petit nématode du sol Caenorhabditis elegans (C. elegans) a joué un rôle déterminant dans la découverte de gènes et l’élucidation des voies qui modifient la protéostase. De nombreux composants du réseau protéostatique et les voies de transduction du signal qui régulent la protéostasie sont conservés de manière évolutionaire. En outre, C. elegans a réduit la complexité et la redondance par rapport aux systèmes vertébrés, ce qui le rend plus propice à l’analyse génétique et à la découverte de gènes. Parmi les autres avantages de C. elegans qui lui ont permis d’être largement utilisé comme système modèle pour étudier la protéostase, citons : une génomique génétique et fonctionnelle puissante, un cycle de vie court (3 jours) et une durée de vie (3 semaines), un génome compact et bien annoté, la disponibilité d’un large assortiment de mutants génétiques et la facilité de visualiser les changements spécifiques aux tissus en biologie cellulaire à l’aide de rapporteurs fluorescents.
La désintégration progressive de la protéostase au cours du vieillissement peut être facilement quantifiée chez C. elegans. Le laboratoire Morimoto a d’abord démontré qu’une expansion de polyglutamine fusionnée à une protéine fluorescente jaune (polyQ::YFP) pouvait être utilisée pour quantifier le déclin protéostatique de C. elegans au cours du vieillissement15,16,17,18. Les fusions YFP à 35 répétitions de glutamine ou plus entraînent une formation associée à l’âge de foyers fluorescents ainsi que des signes de pathologie cellulaire. Il convient de noter que cette plage d’expansion de la glutamine reflète la longueur du tractus polyglutaminique de la protéine huntingtine à laquelle la pathologie de la maladie de Huntington commence à être observée chez l’homme (généralement >35 CAG se répète)19. Des souches avec expression de polyQ::YFP dans les cellules musculaires, intestinales ou neuronales ont été utilisées pour confirmer que le déclin de la protéostase associé à l’âge se produit dans différents types de cellules et de tissus. L’expression polyQ::YFP spécifique aux muscles (c.-à-d. unc-54p::Q35::YFP) a été le rapporteur spécifique aux tissus le plus largement utilisé, car les foyers fluorescents accumulés sont faciles à quantifier au cours des premiers jours de l’âge adulte à l’aide d’un simple microscope à dissection fluorescente(Figure 1A-1B). De plus, les animaux deviennent paralysés au milieu de leur vie, car le protéome dans le muscle s’effondre en raison de l’effet protéotoxique du rapporteur(Figure 1C). De même, le déclin associé à l’âge de la protéostase neuronale peut être suivi (rgef-1p::Q40::YFP) en quantifiant directement la formation de foyers / agrégats et les déclins associés à l’âge dans les courbures corporelles coordonnées après avoir placé les animaux dans un liquide (Figure 2).
Ici, nous présentons un protocole détaillé sur la façon de mesurer la progression dépendante de l’âge de l’accumulation d’agrégats de protéines et la protéotoxicité associée induite par l’expression de répétitions de polyglutamine dans le tissu neuronal et musculaire chez C. elegans. Nous fournissons des exemples de résultats typiques générés à l’aide de ces souches et méthodes. De plus, nous montrons comment nous avons utilisé ces méthodes pour étudier la régulation transcriptionnelle du réseau protéostatique. Nous discutons d’autres façons dont ces rapporteurs peuvent être facilement intégrés à d’autres réactifs existants ou adaptés pour des écrans plus grands.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le vieillissement se caractérise par un déclin progressif de la protéostasie. La protéostasie est maintenue par un système complexe, le réseau protéostatique, pour le contrôle coordonné, dynamique et sensible au stress du repliement, de la dégradation et de la traduction des protéines. La raison pour laquelle la protéostase échoue au cours du vieillissement est mal comprise, mais un épigénome en décomposition, une diminution de l’inductibilité des réponses au stress et une perte de diaphonie compensat…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier les anciens et actuels membres du laboratoire Samuelson pour leur aide dans le raffinement de cette méthode et / ou de la discussion qui a aidé au développement de ce manuscrit. La recherche rapportée dans cette publication a été soutenue par le National Institute on Aging des National Institutes of Health sous les numéros d’attribution RF1AG062593 et R21AG064519. Le contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les points de vue officiels des National Institutes of Health. Les bailleurs de fonds n’ont joué aucun rôle dans la conception de l’étude, la collecte et l’analyse des données, la décision de publier ou la préparation du manuscrit.
Materials
| 24 Well Culture Plates | Greiner Bio-One | #662102 | |
| 2 mL 96-well plates | Greiner Bio-One | #780286 | |
| 600 µL 96-well plates | Greiner Bio-One | #786261 | |
| 96-pin plate replicator | Nunc | 250520 | |
| Air-permeable plate seal | VWR | 60941-086 | |
| bacteriological agar | Affymetrix/USB | 10906 | |
| bacto-peptone | VWR | 90000-368 | |
| C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Ahringer | Source Bioscience | C. elegans RNAi Collection (Ahringer) | See also Kamath et. al, Nature 2003. |
| C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Vidal | Source Bioscience | C. elegans ORF-RNAi Resource (Vidal) | See also Rual et. al, Genome Research 2004. This library is also available from Dharmacon. |
| FuDR (5-Fluoro-2'-deoxyuridine) | Alfa Aesar | L16497 | |
| Glass microscope cover slips | VWR | 48404-455 | |
| Glass microscope slides | VWR | 160004-422 | |
| IPTG (isopropyl beta-D-1-thigalactopyranoside) | Gold Bio | 12481C100 | |
| Retangular non-treated single-well plate, 128x86mm | Thermo-Fisher | 242811 | |
| Sodium Azide, CAS #26628-22-8 | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Zeiss Axio Imager M2m microscope with AxioVision v4.8.2.0 software | Zeiss | unknown | |
| Zeiss StemiSV11 M2 Bio Quad microscope | Zeiss | unknown |
References
- Wolff, S., Weissman, J. S., Dillin, A. Differential scales of protein quality control. Cell. 157 (1), 52-64 (2014).
- Labbadia, J., Morimoto, R. I. The biology of proteostasis in aging and disease. Annual Review of Biochemistry. 84, 435-464 (2015).
- Powers, E. T., Morimoto, R. I., Dillin, A., Kelly, J. W., Balch, W. E. Biological and chemical approaches to diseases of proteostasis deficiency. Annual Review of Biochemistry. 78, 959-991 (2009).
- Brehme, M., et al. A chaperome subnetwork safeguards proteostasis in aging and neurodegenerative disease. Cell Reports. 9 (3), 1135-1150 (2014).
- Sala, A. J., Bott, L. C., Morimoto, R. I. Shaping proteostasis at the cellular, tissue, and organismal level. Journal of Cell Biology. 216 (5), 1231-1241 (2017).
- Braak, H., Braak, E., Strothjohann, M. Abnormally phosphorylated tau protein related to the formation of neurofibrillary tangles and neuropil threads in the cerebral cortex of sheep and goat. Neuroscience Letters. 171 (1-2), 1-4 (1994).
- Poirier, M. A., Jiang, H., Ross, C. A. A structure-based analysis of huntingtin mutant polyglutamine aggregation and toxicity: evidence for a compact beta-sheet structure. Human Molecular Genetics. 14 (6), 765-774 (2005).
- Vilchez, D., Saez, I., Dillin, A. The role of protein clearance mechanisms in organismal ageing and age-related diseases. Nature Communications. 5, 5659 (2014).
- Eftekharzadeh, B., Hyman, B. T., Wegmann, S. Structural studies on the mechanism of protein aggregation in age related neurodegenerative diseases. Mechanisms of Ageing and Development. 156, 1-13 (2016).
- Pokrishevsky, E., Grad, L. I., Cashman, N. R. TDP-43 or FUS-induced misfolded human wild-type SOD1 can propagate intercellularly in a prion-like fashion. Scientific Reports. 6, 22155 (2016).
- Mukherjee, A., Morales-Scheihing, D., Butler, P. C., Soto, C. Type 2 diabetes as a protein misfolding disease. Trends in Molecular Medicine. 21 (7), 439-449 (2015).
- Sikkink, L. A., Ramirez-Alvarado, M. Biochemical and aggregation analysis of Bence Jones proteins from different light chain diseases. Amyloid. 15 (1), 29-39 (2008).
- Qu, B. H., Strickland, E., Thomas, P. J. Cystic fibrosis: a disease of altered protein folding. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 29 (5), 483-490 (1997).
- Qu, B. H., Strickland, E. H., Thomas, P. J. Localization and suppression of a kinetic defect in cystic fibrosis transmembrane conductance regulator folding. Journal of Biological Chemistry. 272 (25), 15739-15744 (1997).
- Brignull, H. R., Moore, F. E., Tang, S. J., Morimoto, R. I. Polyglutamine proteins at the pathogenic threshold display neuron-specific aggregation in a pan-neuronal Caenorhabditis elegans model. Journal of Neuroscience. 26 (29), 7597-7606 (2006).
- Gidalevitz, T., Ben-Zvi, A., Ho, K. H., Brignull, H. R., Morimoto, R. I. Progressive disruption of cellular protein folding in models of polyglutamine diseases. Science. 311 (5766), 1471-1474 (2006).
- Morimoto, R. I. Stress, aging, and neurodegenerative disease. New England Journal of Medicine. 355 (21), 2254-2255 (2006).
- Morimoto, R. I. Proteotoxic stress and inducible chaperone networks in neurodegenerative disease and aging. Genes & Development. 22 (11), 1427-1438 (2008).
- Walker, F. O. Huntington’s disease. Lancet. 369 (9557), 218-228 (2007).
- Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biology. 2 (1), 0002 (2001).
- Karady, I., et al. Using Caenorhabditis elegans as a model system to study protein homeostasis in a multicellular organism. Journal of Visualized Experiments. (82), e50840 (2013).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
- Cornwell, A. B., Llop, J. R., Salzman, P., Thakar, J., Samuelson, A. V. The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan. Journal of Visualized Experiments. (136), e57819 (2018).
- Angeli, S., et al. A DNA synthesis inhibitor is protective against proteotoxic stressors via modulation of fertility pathways in Caenorhabditis elegans. Aging (Albany NY). 5 (10), 759-769 (2013).
- Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset. PLoS One. 9 (1), 85964 (2014).
- Byerly, L., Cassada, R. C., Russell, R. L. The life cycle of the nematode Caenorhabditis elegans. I. Wild-type growth and reproduction. Developmental Biology. 51 (1), 23-33 (1976).
- Schemper, M. Cox Analysis of Survival Data with Non-Proportional Hazard Functions. Journal of the Royal Statistical Society. Series D (The Statistician). 41 (4), 455-465 (1992).
- Royston, P., Parmar, M. K. The use of restricted mean survival time to estimate the treatment effect in randomized clinical trials when the proportional hazards assumption is in doubt. Statistics in Medicine. 30 (19), 2409-2421 (2011).
- Campbell, I. Chi-squared and Fisher-Irwin tests of two-by-two tables with small sample recommendations. Statistics in Medicine. 26 (19), 3661-3675 (2007).
- Busing, F. M., Weaver, B., Dubois, S. 2 x 2 Tables: a note on Campbell’s recommendation. Statistics in Medicine. 35 (8), 1354-1358 (2016).
- Das, R., et al. The homeodomain-interacting protein kinase HPK-1 preserves protein homeostasis and longevity through master regulatory control of the HSF-1 chaperone network and TORC1-restricted autophagy in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 13 (10), 1007038 (2017).
- Garcia, S. M., Casanueva, M. O., Silva, M. C., Amaral, M. D., Morimoto, R. I. Neuronal signaling modulates protein homeostasis in Caenorhabditis elegans post-synaptic muscle cells. Genes & Development. 21 (22), 3006-3016 (2007).
- Morley, J. F., Brignull, H. R., Weyers, J. J., Morimoto, R. I. The threshold for polyglutamine-expansion protein aggregation and cellular toxicity is dynamic and influenced by aging in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (16), 10417-10422 (2002).
- Labbadia, J., Morimoto, R. I. Repression of the Heat Shock Response Is a Programmed Event at the Onset of Reproduction. Molecular Cell. 59 (4), 639-650 (2015).
- Shemesh, N., Shai, N., Ben-Zvi, A. Germline stem cell arrest inhibits the collapse of somatic proteostasis early in Caenorhabditis elegans adulthood. Aging Cell. 12 (5), 814-822 (2013).
- Ben-Zvi, A., Miller, E. A., Morimoto, R. I. Collapse of proteostasis represents an early molecular event in Caenorhabditis elegans aging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (35), 14914-14919 (2009).
- Walther, D. M., et al. Widespread Proteome Remodeling and Aggregation in Aging C. elegans. Cell. 161 (4), 919-932 (2015).
- Cohen, E., Bieschke, J., Perciavalle, R. M., Kelly, J. W., Dillin, A. Opposing activities protect against age-onset proteotoxicity. Science. 313 (5793), 1604-1610 (2006).
- Silva, M. C., et al. A genetic screening strategy identifies novel regulators of the proteostasis network. PLoS Genetics. 7 (12), 1002438 (2011).
- Zhang, L., Ward, J. D., Cheng, Z., Dernburg, A. F. The auxin-inducible degradation (AID) system enables versatile conditional protein depletion in C. elegans. Development. 142 (24), 4374-4384 (2015).
- Hansen, M., Hsu, A. L., Dillin, A., Kenyon, C. New genes tied to endocrine, metabolic, and dietary regulation of lifespan from a Caenorhabditis elegans genomic RNAi screen. PLoS Genetics. 1 (1), 119-128 (2005).
- Nollen, E. A., et al. Genome-wide RNA interference screen identifies previously undescribed regulators of polyglutamine aggregation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (17), 6403-6408 (2004).
- Samuelson, A. V., Carr, C. E., Ruvkun, G. Gene activities that mediate increased life span of C. elegans insulin-like signaling mutants. Genes & Development. 21 (22), 2976-2994 (2007).
- Johnson, D. W., et al. The Caenorhabditis elegans Myc-Mondo/Mad complexes integrate diverse longevity signals. PLoS Genetics. 10 (4), 1004278 (2014).
- Wang, Z., Sherwood, D. R. Dissection of genetic pathways in C. elegans. Methods in Cell Biology. 106, 113-157 (2011).
- Jorgensen, E. M., Mango, S. E. The art and design of genetic screens: caenorhabditis elegans. Nature Reviews Genetics. 3 (5), 356-369 (2002).
