Cuantificación de la disminución proteostática específica del tejido en Caenorhabditis elegans
Summary
El deterioro proteostático es un sello distintivo del envejecimiento, que facilita la aparición de enfermedades neurodegenerativas. Esbozamos un protocolo para medir cuantificablemente la proteostasis en dos tejidos diferentes de Caenorhabditis elegans a través de la expresión heteróloga de repeticiones de poliglutamina fusionadas a un reportero fluorescente. Este modelo permite un rápido análisis genético in vivo de la proteostasis.
Abstract
La capacidad de mantener la función adecuada y el plegamiento del proteoma (homeostasis de proteínas) disminuye durante el envejecimiento normal, lo que facilita la aparición de un número creciente de enfermedades asociadas a la edad. Por ejemplo, las proteínas con expansiones de poliglutamina son propensas a la agregación, como se ejemplifica con la proteína huntingtina y la aparición concomitante de la enfermedad de Huntington. El deterioro del proteoma asociado a la edad ha sido ampliamente estudiado mediante el uso de Caenorhabditis elegans transgénicos que expresan repeticiones poliQ fusionadas a una proteína fluorescente amarilla (YFP). Este modelo animal transgénico polyQ::YFP facilita la cuantificación directa de la disminución asociada a la edad del proteoma a través de imágenes de la formación progresiva de focos fluorescentes (es decir, agregados de proteínas) y la posterior aparición de defectos de locomoción que se desarrollan como resultado del colapso del proteoma. Además, la expresión del transgén polyQ::YFP puede ser impulsada por promotores específicos del tejido, lo que permite la evaluación de la proteostasis a través de los tejidos en el contexto de un organismo multicelular intacto. Este modelo es altamente susceptible de análisis genético, proporcionando así un enfoque para cuantificar el envejecimiento que es complementario a los ensayos de vida útil. Describimos cómo medir con precisión la formación de focos poliQ::YFP dentro de las neuronas o el músculo de la pared corporal durante el envejecimiento, y la posterior aparición de defectos de comportamiento. A continuación, destacamos cómo estos enfoques se pueden adaptar para un mayor rendimiento y posibles aplicaciones futuras utilizando otras estrategias emergentes para el análisis genético de C. elegans.
Introduction
La homeostasis proteica (proteostasis) se define como la capacidad celular para mantener la función adecuada y el plegamiento del proteoma. El desafío inherente a la proteostasis es garantizar que todas las proteínas se plieguen y mantengan adecuadamente en una conformación nativa, que se amplifica aún más por la naturaleza variada del tamaño de la proteína, la composición de aminoácidos, la conformación estructural, la estabilidad, la renovación, la expresión, la compartimentación subcelular y las modificaciones1. La proteostasis se mantiene a través de la acción coordinada de una gran red proteostática, que consta de aproximadamente 2000 proteínas únicas, que regulan la síntesis adecuada, el plegamiento, el tráfico y la degradación dentro del proteoma2,3. Los componentes del caballo de batalla de la red proteostática son nueve familias principales de chaperonas moleculares4. Cada tejido y tipo de célula utiliza preferentemente subconjuntos específicos de chaperonas moleculares, presumiblemente en alineación con las diferentes demandas de distintos proteomas5.
Un sello distintivo del envejecimiento normal del organismo es la disminución progresiva y el colapso de la proteostasis celular, que se cree que es una base subyacente para la aparición y progresión de un número creciente de enfermedades asociadas a la edad. Por ejemplo, la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Huntington y la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) comparten una característica común: en cada caso, la manifestación de la neurodegeneración es impulsada por alteraciones genéticas que predisponen a una proteína mutante a la agregación (amiloide-β / Tau, α-sinucleína, HTT, FUS / TBD-43 / SOD-1, respectivamente)6,7,8,9,10 . Durante el envejecimiento, la integridad y la inducibilidad de la red proteostática disminuyen, lo que resulta en la acumulación de agregados proteotóxicos que resultan en disfunción celular y neurodegeneración. Cabe destacar que las enfermedades conformacionales de proteínas no son exclusivas de las neuronas y ocurren en múltiples tejidos, como lo destacan la diabetes tipo II, el mieloma múltiple y la fibrosis quística11,12,13,14. Por lo tanto, dilucidar mecanismos capaces de preservar la proteostasis facilitará el desarrollo de intervenciones específicas para el tratamiento de la enfermedad y para promover un envejecimiento saludable.
El pequeño nematodo del suelo Caenorhabditis elegans (C. elegans) ha sido fundamental en el descubrimiento de genes y vías de elucidación que alteran la proteostasis. Muchos componentes de la red proteostática y las vías de transducción de señales que regulan la proteostasis se conservan evolutivamente. Además, C. elegans ha reducido la complejidad y la redundancia en relación con los sistemas de vertebrados, lo que lo hace más susceptible al análisis genético y al descubrimiento de genes. Las ventajas adicionales de C. elegans que lo han llevado a ser ampliamente utilizado como un sistema modelo para estudiar la proteostasis incluyen: una poderosa genómica genética y funcional, un ciclo de vida corto (3 días) y una vida útil (3 semanas), un genoma compacto y bien anotado, la disponibilidad de una amplia variedad de mutantes genéticos y la facilidad de visualizar cambios específicos de tejidos en la biología celular utilizando reporteros fluorescentes.
La desintegración progresiva de la proteostasis durante el envejecimiento se puede cuantificar fácilmente en C. elegans. El laboratorio Morimoto demostró por primera vez que una expansión de poliglutamina fusionada con la proteína fluorescente amarilla(polyQ::YFP)podría usarse para cuantificar la disminución proteostática en C. elegans durante el envejecimiento15,16,17,18. Las fusiones de YFP a 35 repeticiones de glutamina o más resultan en una formación asociada a la edad de focos fluorescentes junto con signos de patología celular. Cabe destacar que este rango de expansión de glutamina refleja la longitud del tracto de poliglutamina de la proteína Huntingtina en la que la patología de la enfermedad de Huntington comienza a observarse en humanos (típicamente >35 repeticiones CAG)19. Se han utilizado cepas con expresión de polyQ::YFP dentro de las células musculares, intestinales o neuronales para confirmar que la disminución de la proteostasis asociada a la edad ocurre en diferentes tipos de células y tejidos. La expresión de poliQ::YFP específica del músculo (es decir, unc-54p::Q35::YFP)ha sido el reportero específico de tejido más utilizado, ya que los focos fluorescentes acumulados son fáciles de cuantificar durante los primeros días de la edad adulta utilizando un microscopio de disección fluorescente simple(Figura 1A-1B). Además, los animales se paralizan durante la mediana edad, ya que el proteoma dentro del músculo colapsa debido al efecto proteotóxico del reportero(Figura 1C). Del mismo modo, la disminución asociada a la edad en la proteostasis neuronal puede ser seguida (rgef-1p::Q40::YFP) cuantificando directamente la formación de focos/agregados y las disminuciones asociadas a la edad en las curvas coordinadas del cuerpo después de colocar a los animales en líquido(Figura 2).
Aquí, presentamos un protocolo detallado sobre cómo medir la progresión dependiente de la edad de la acumulación de agregados proteicos y la proteotoxicidad asociada inducida por la expresión de repeticiones de poliglutamina dentro del tejido neuronal y muscular en C. elegans. Proporcionamos ejemplos de resultados típicos generados utilizando estas cepas y métodos. Además, mostramos cómo hemos utilizado estos métodos para estudiar la regulación transcripcional de la red proteostática. Discutimos formas adicionales en que estos reporteros pueden integrarse fácilmente con otros reactivos existentes o adaptarse para pantallas más grandes.
Protocol
Representative Results
Discussion
El envejecimiento se caracteriza por una disminución gradual de la proteostasis. La proteostasis es mantenida por un sistema complejo, la red proteostática, para el control coordinado, dinámico y sensible al estrés del plegamiento, la degradación y la traducción de proteínas. Por qué la proteostasis falla en el curso del envejecimiento es poco conocida, pero un epigenoma en descomposición, la disminución de la inducibilidad de las respuestas al estrés y la pérdida de diafonía compensatoria coinciden con esta…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría agradecer a los miembros pasados y presentes del laboratorio Samuelson por su ayuda en el refinamiento de este método y / o discusión que ayudó al desarrollo de este manuscrito. La investigación reportada en esta publicación fue apoyada por el Instituto Nacional sobre el Envejecimiento de los Institutos Nacionales de Salud bajo los números de premio RF1AG062593 y R21AG064519. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales de los Institutos Nacionales de Salud. Los financiadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.
Materials
| 24 Well Culture Plates | Greiner Bio-One | #662102 | |
| 2 mL 96-well plates | Greiner Bio-One | #780286 | |
| 600 µL 96-well plates | Greiner Bio-One | #786261 | |
| 96-pin plate replicator | Nunc | 250520 | |
| Air-permeable plate seal | VWR | 60941-086 | |
| bacteriological agar | Affymetrix/USB | 10906 | |
| bacto-peptone | VWR | 90000-368 | |
| C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Ahringer | Source Bioscience | C. elegans RNAi Collection (Ahringer) | See also Kamath et. al, Nature 2003. |
| C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Vidal | Source Bioscience | C. elegans ORF-RNAi Resource (Vidal) | See also Rual et. al, Genome Research 2004. This library is also available from Dharmacon. |
| FuDR (5-Fluoro-2'-deoxyuridine) | Alfa Aesar | L16497 | |
| Glass microscope cover slips | VWR | 48404-455 | |
| Glass microscope slides | VWR | 160004-422 | |
| IPTG (isopropyl beta-D-1-thigalactopyranoside) | Gold Bio | 12481C100 | |
| Retangular non-treated single-well plate, 128x86mm | Thermo-Fisher | 242811 | |
| Sodium Azide, CAS #26628-22-8 | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Zeiss Axio Imager M2m microscope with AxioVision v4.8.2.0 software | Zeiss | unknown | |
| Zeiss StemiSV11 M2 Bio Quad microscope | Zeiss | unknown |
References
- Wolff, S., Weissman, J. S., Dillin, A. Differential scales of protein quality control. Cell. 157 (1), 52-64 (2014).
- Labbadia, J., Morimoto, R. I. The biology of proteostasis in aging and disease. Annual Review of Biochemistry. 84, 435-464 (2015).
- Powers, E. T., Morimoto, R. I., Dillin, A., Kelly, J. W., Balch, W. E. Biological and chemical approaches to diseases of proteostasis deficiency. Annual Review of Biochemistry. 78, 959-991 (2009).
- Brehme, M., et al. A chaperome subnetwork safeguards proteostasis in aging and neurodegenerative disease. Cell Reports. 9 (3), 1135-1150 (2014).
- Sala, A. J., Bott, L. C., Morimoto, R. I. Shaping proteostasis at the cellular, tissue, and organismal level. Journal of Cell Biology. 216 (5), 1231-1241 (2017).
- Braak, H., Braak, E., Strothjohann, M. Abnormally phosphorylated tau protein related to the formation of neurofibrillary tangles and neuropil threads in the cerebral cortex of sheep and goat. Neuroscience Letters. 171 (1-2), 1-4 (1994).
- Poirier, M. A., Jiang, H., Ross, C. A. A structure-based analysis of huntingtin mutant polyglutamine aggregation and toxicity: evidence for a compact beta-sheet structure. Human Molecular Genetics. 14 (6), 765-774 (2005).
- Vilchez, D., Saez, I., Dillin, A. The role of protein clearance mechanisms in organismal ageing and age-related diseases. Nature Communications. 5, 5659 (2014).
- Eftekharzadeh, B., Hyman, B. T., Wegmann, S. Structural studies on the mechanism of protein aggregation in age related neurodegenerative diseases. Mechanisms of Ageing and Development. 156, 1-13 (2016).
- Pokrishevsky, E., Grad, L. I., Cashman, N. R. TDP-43 or FUS-induced misfolded human wild-type SOD1 can propagate intercellularly in a prion-like fashion. Scientific Reports. 6, 22155 (2016).
- Mukherjee, A., Morales-Scheihing, D., Butler, P. C., Soto, C. Type 2 diabetes as a protein misfolding disease. Trends in Molecular Medicine. 21 (7), 439-449 (2015).
- Sikkink, L. A., Ramirez-Alvarado, M. Biochemical and aggregation analysis of Bence Jones proteins from different light chain diseases. Amyloid. 15 (1), 29-39 (2008).
- Qu, B. H., Strickland, E., Thomas, P. J. Cystic fibrosis: a disease of altered protein folding. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 29 (5), 483-490 (1997).
- Qu, B. H., Strickland, E. H., Thomas, P. J. Localization and suppression of a kinetic defect in cystic fibrosis transmembrane conductance regulator folding. Journal of Biological Chemistry. 272 (25), 15739-15744 (1997).
- Brignull, H. R., Moore, F. E., Tang, S. J., Morimoto, R. I. Polyglutamine proteins at the pathogenic threshold display neuron-specific aggregation in a pan-neuronal Caenorhabditis elegans model. Journal of Neuroscience. 26 (29), 7597-7606 (2006).
- Gidalevitz, T., Ben-Zvi, A., Ho, K. H., Brignull, H. R., Morimoto, R. I. Progressive disruption of cellular protein folding in models of polyglutamine diseases. Science. 311 (5766), 1471-1474 (2006).
- Morimoto, R. I. Stress, aging, and neurodegenerative disease. New England Journal of Medicine. 355 (21), 2254-2255 (2006).
- Morimoto, R. I. Proteotoxic stress and inducible chaperone networks in neurodegenerative disease and aging. Genes & Development. 22 (11), 1427-1438 (2008).
- Walker, F. O. Huntington’s disease. Lancet. 369 (9557), 218-228 (2007).
- Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biology. 2 (1), 0002 (2001).
- Karady, I., et al. Using Caenorhabditis elegans as a model system to study protein homeostasis in a multicellular organism. Journal of Visualized Experiments. (82), e50840 (2013).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
- Cornwell, A. B., Llop, J. R., Salzman, P., Thakar, J., Samuelson, A. V. The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan. Journal of Visualized Experiments. (136), e57819 (2018).
- Angeli, S., et al. A DNA synthesis inhibitor is protective against proteotoxic stressors via modulation of fertility pathways in Caenorhabditis elegans. Aging (Albany NY). 5 (10), 759-769 (2013).
- Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset. PLoS One. 9 (1), 85964 (2014).
- Byerly, L., Cassada, R. C., Russell, R. L. The life cycle of the nematode Caenorhabditis elegans. I. Wild-type growth and reproduction. Developmental Biology. 51 (1), 23-33 (1976).
- Schemper, M. Cox Analysis of Survival Data with Non-Proportional Hazard Functions. Journal of the Royal Statistical Society. Series D (The Statistician). 41 (4), 455-465 (1992).
- Royston, P., Parmar, M. K. The use of restricted mean survival time to estimate the treatment effect in randomized clinical trials when the proportional hazards assumption is in doubt. Statistics in Medicine. 30 (19), 2409-2421 (2011).
- Campbell, I. Chi-squared and Fisher-Irwin tests of two-by-two tables with small sample recommendations. Statistics in Medicine. 26 (19), 3661-3675 (2007).
- Busing, F. M., Weaver, B., Dubois, S. 2 x 2 Tables: a note on Campbell’s recommendation. Statistics in Medicine. 35 (8), 1354-1358 (2016).
- Das, R., et al. The homeodomain-interacting protein kinase HPK-1 preserves protein homeostasis and longevity through master regulatory control of the HSF-1 chaperone network and TORC1-restricted autophagy in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 13 (10), 1007038 (2017).
- Garcia, S. M., Casanueva, M. O., Silva, M. C., Amaral, M. D., Morimoto, R. I. Neuronal signaling modulates protein homeostasis in Caenorhabditis elegans post-synaptic muscle cells. Genes & Development. 21 (22), 3006-3016 (2007).
- Morley, J. F., Brignull, H. R., Weyers, J. J., Morimoto, R. I. The threshold for polyglutamine-expansion protein aggregation and cellular toxicity is dynamic and influenced by aging in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (16), 10417-10422 (2002).
- Labbadia, J., Morimoto, R. I. Repression of the Heat Shock Response Is a Programmed Event at the Onset of Reproduction. Molecular Cell. 59 (4), 639-650 (2015).
- Shemesh, N., Shai, N., Ben-Zvi, A. Germline stem cell arrest inhibits the collapse of somatic proteostasis early in Caenorhabditis elegans adulthood. Aging Cell. 12 (5), 814-822 (2013).
- Ben-Zvi, A., Miller, E. A., Morimoto, R. I. Collapse of proteostasis represents an early molecular event in Caenorhabditis elegans aging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (35), 14914-14919 (2009).
- Walther, D. M., et al. Widespread Proteome Remodeling and Aggregation in Aging C. elegans. Cell. 161 (4), 919-932 (2015).
- Cohen, E., Bieschke, J., Perciavalle, R. M., Kelly, J. W., Dillin, A. Opposing activities protect against age-onset proteotoxicity. Science. 313 (5793), 1604-1610 (2006).
- Silva, M. C., et al. A genetic screening strategy identifies novel regulators of the proteostasis network. PLoS Genetics. 7 (12), 1002438 (2011).
- Zhang, L., Ward, J. D., Cheng, Z., Dernburg, A. F. The auxin-inducible degradation (AID) system enables versatile conditional protein depletion in C. elegans. Development. 142 (24), 4374-4384 (2015).
- Hansen, M., Hsu, A. L., Dillin, A., Kenyon, C. New genes tied to endocrine, metabolic, and dietary regulation of lifespan from a Caenorhabditis elegans genomic RNAi screen. PLoS Genetics. 1 (1), 119-128 (2005).
- Nollen, E. A., et al. Genome-wide RNA interference screen identifies previously undescribed regulators of polyglutamine aggregation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (17), 6403-6408 (2004).
- Samuelson, A. V., Carr, C. E., Ruvkun, G. Gene activities that mediate increased life span of C. elegans insulin-like signaling mutants. Genes & Development. 21 (22), 2976-2994 (2007).
- Johnson, D. W., et al. The Caenorhabditis elegans Myc-Mondo/Mad complexes integrate diverse longevity signals. PLoS Genetics. 10 (4), 1004278 (2014).
- Wang, Z., Sherwood, D. R. Dissection of genetic pathways in C. elegans. Methods in Cell Biology. 106, 113-157 (2011).
- Jorgensen, E. M., Mango, S. E. The art and design of genetic screens: caenorhabditis elegans. Nature Reviews Genetics. 3 (5), 356-369 (2002).
