כימות ירידה פרוטאוסטטית ספציפית לרקמות ב elegans Caenorhabditis
Summary
ירידה פרוטאוסטלית היא סימן היכר של הזדקנות, להקל על תחילת מחלות ניווניות. אנו מתארים פרוטוקול כדי למדוד באופן כנותב פרוטאוסטזיס בשתי רקמות אלגנים שונים Caenorhabditis באמצעות ביטוי הטרולוגי של פוליגלוטמין חוזר התמזג לכתב פלואורסצנטי. מודל זה מאפשר ניתוח גנטי מהיר של פרוטאוסטזיס.
Abstract
היכולת לשמור על תפקוד תקין וקיפול הפרוטאום (הומיאוסטזיס חלבון) יורדת במהלך ההזדקנות הרגילה, מה שמקל על תחילתן של מספר גדל והולך של מחלות הקשורות לגיל. לדוגמה, חלבונים עם הרחבות פוליגלוטמין נוטים לצבירה, כפי שמדגים את חלבון הנטטין ואת התפרצות במקביל של מחלת הנטינגטון. ההידרדרות הקשורה לגיל של הפרוטאום נחקרה בהרחבה באמצעות אלגנים מהונדסים של Caenorhabditis המבטאים חזרות polyQ הותכו לחלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP). מודל זה של בעלי חיים מהונדסים מסייע לכימות ישיר של הירידה הקשורה לגיל של הפרוטאום באמצעות הדמיית היווצרות מתקדמת של מוקדי פלורסנט (כלומר, אגרגטים של חלבונים) והתפרצות מאוחרת יותר של פגמים בקטר המתפתחים כתוצאה מקריסת הפרוטאום. יתר על כן, הביטוי של polyQ::YFP transgene יכול להיות מונע על ידי מקדמים ספציפיים לרקמות, המאפשר הערכה של פרוטאוסטזיס על פני רקמות בהקשר של אורגניזם רב תאי שלם. מודל זה נוח מאוד לניתוח גנטי, ובכך מספק גישה לכימות ההזדקנות המשלימה לבדיקות תוחלת חיים. אנו מתארים כיצד למדוד במדויק polyQ::YFP היווצרות מוקדים בתוך נוירונים או שריר דופן הגוף במהלך ההזדקנות, ואת תחילתו של פגמים התנהגותיים הבאים. לאחר מכן, אנו מדגישים כיצד ניתן להתאים גישות אלה לתפוקה גבוהה יותר, ויישומים עתידיים פוטנציאליים באמצעות אסטרטגיות מתפתחות אחרות לניתוח גנטי C. elegans.
Introduction
הומאוסטזיס חלבון (פרוטאוסטזיס) מוגדר כיכולת התאית לשמור על תפקוד תקין וקיפול הפרוטאום. האתגר המובנה בפרוטוסטזיס הוא להבטיח שכל החלבונים מקופלים ומתוחזקים כראוי בקונפורמציה מקומית, המוגברת עוד יותר על ידי האופי המגוון של גודל החלבון, הרכב חומצות האמינו, קונפורמציה מבנית, יציבות, מחזור, ביטוי, מידור תת-תאי ושינויים1. Proteostasis נשמר באמצעות פעולה מתואמת של רשת פרוטאוסטטיקה גדולה, המורכבת מכ -2000 חלבונים ייחודיים, המסדירים סינתזה נכונה, קיפול, סחר והשפלה בתוך הפרוטאום2,3. רכיבי סוס העבודה של הרשת הפרוטאוסטאטית הם תשע משפחות עיקריות שלמלווים מולקולריים 4. כל רקמה וסוג תא מעדיף להשתמש בתת-קבוצות ספציפיות של מלווים מולקולריים, ככל הנראה בקנה אחד עם הדרישות השונות של פרוטאומים נפרדים5.
סימן היכר אחד של הזדקנות אורגניזמית נורמלית הוא הירידה המתקדמת והתמוטטות הפרוטאוסטזיס התאי, אשר נחשב כבסיס להתפרצות והתקדמות של מספר גדל והולך של מחלות הקשורות לגיל. לדוגמה, מחלת אלצהיימר, פרקינסון, מחלת הנטינגטון וטרשת אמיוטרופית לרוחב (ALS) חולקות מאפיין משותף: בכל מקרה ביטוי של ניוון עצבי מונע על ידי שינויים גנטיים הנטיות חלבון מוטנטי לצבירה (עמילואיד-β/טאו, α-סינוקלין, HTT, FUS/TBD-43/SOD-1, בהתאמה)6,7,8,9,10 . במהלך ההזדקנות, השלמות וחוסר ההגבלות של הרשת הפרוטאוסטקטית יורדת, מה שגורם להצטברות של אגרגטים פרוטאוטוקסיים הגורמים לתפקוד לקוי של התאים ולדגנרציה עצבית. ראוי לציין, מחלות קונפורמציה חלבון אינם ייחודיים נוירונים, להתרחש על פני רקמות מרובות, כפי מודגש על ידי סוכרת מסוג II, מיאלומה נפוצה, סיסטיק פיברוזיס11,12,13,14. לכן, מנגנונים מובהרים המסוגלים לשמר פרוטאוסטזיס יקלו על פיתוח התערבויות ממוקדות לטיפול במחלות ולקדם הזדקנות בריאה.
אלגנס האדמה הקטנה Nematode Caenorhabditis (C. elegans) סייעה בגילוי גנים ובמסלולים מבהירים המשנים פרוטאוסטזיס. רכיבים רבים של הרשת הפרוטאוסטקטית ומסלולי התמרת האות המווסתים את הפרוטאוסטזיס נשמרים מבחינה אבולוציונית. יתר על כן, C. elegans הפחיתה את המורכבות והיתירות ביחס למערכות בעלי חוליות, מה שהופך אותה למקובלת יותר לניתוח גנטי ולגילוי גנים. יתרונות נוספים של C. elegans שהובילו אותו להיות בשימוש נרחב כמערכת מודל לחקר פרוטאוסטזיס כוללים: גנומיקה גנטית ותפקודית רבת עוצמה, מחזור חיים קצר (3 ימים) ותוחלת חיים (3 שבועות), גנום קומפקטי ומובהר היטב, הזמינות של מגוון רחב של מוטציות גנטיות, ואת הקלות של הדמיית שינויים ספציפיים לרקמות בביולוגיה של התא באמצעות כתבים פלואורסצנטיים.
ניתן לכמת בקלות את הריקבון המתקדם של פרוטאוסטזיס במהלך ההזדקנות ב- C. elegans. מעבדת מורימוטו הוכיחה לראשונה כי הרחבת פוליגלוטמין התמזגה לחלבון פלואורסצנטי צהוב (polyQ::YFP) יכולה לשמש לכימות ירידה פרוטאוסטקטית ב- C. elegans במהלך הזדקנות15,16,17,18. היתוך YFP ל-35 חזרות על גלוטמין או יותר גורמות להיווצרות הקשורה לגיל של מוקדי פלורסנט יחד עם סימנים לפתולוגיה תאית. ראוי לציין, טווח זה של הרחבת גלוטמין משקף את אורך מערכת הפוליגלוטמין של חלבון הנטינגטון שבו הפתולוגיה של מחלת הנטינגטון מתחילה להיות נצפתה בבני אדם (בדרך כלל >35 CAG חוזר)19. זנים עם ביטוי של polyQ::YFP בתוך תאים שריריים, מעיים או תאי עצב נוצלו כדי לאשר כי הירידה הקשורה לגיל של פרוטאוסטזיס מתרחשת על פני סוגי תאים ורקמות שונים. ביטוי YFP ספציפי לשרירים (כלומר, unc-54p::Q35::YFP) היה הכתב הספציפי לרקמות הנפוץ ביותר, שכן קל לכמת מוקדי פלורסנט מצטברים בימים הראשונים של הבגרות באמצעות מיקרוסקופ פשוט של ניתוח פלואורסצנטי (איור 1A-1B). בנוסף, בעלי חיים הופכים משותקים במהלך אמצע החיים, כמו פרוטאום בתוך השריר מתמוטט בשל ההשפעה הפרוטאוטוקסית של הכתב (איור 1C). באופן דומה, ניתן לעקוב אחר הירידה הקשורה לגיל בפרוטוסטזיס העצבי (rgef-1p::Q40::YFP) על ידי כימות ישיר של היווצרות מוקדים/צבירה וירידות הקשורות לגיל בכיפופי גוף מתואמים לאחר הצבת בעלי חיים בנוזל (איור 2).
כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט על איך למדוד את ההתקדמות תלוית הגיל של הצטברות צבירה חלבון ואת proteotoxicity הקשורים המושרה על ידי הביטוי של פוליגלוטמין חוזר בתוך רקמת נוירונים ושרירים C. elegans. אנו מספקים דוגמאות לתוצאות אופייניות שנוצרו באמצעות זנים ושיטות אלה. יתר על כן, אנו מראים כיצד השתמשנו בשיטות אלה כדי ללמוד רגולציה תמלול של הרשת proteostatic. אנו דנים בדרכים נוספות שבהן ניתן לשלב כתבים אלה בקלות עם ריאגנטים קיימים אחרים או להתאים אותם למסכים גדולים יותר.
Protocol
Representative Results
Discussion
ההזדקנות מאופיינת בירידה הדרגתית בפרוטוסטזיס. פרוטאוסטזיס מתוחזקת על ידי מערכת מורכבת, הרשת הפרוטאוסטקטית, לשליטה מתואמת, דינמית, מגיבה ללחץ של קיפול חלבונים, השפלה ותרגום. מדוע פרוטאוסטזיס נכשל במהלך ההזדקנות אינו מובן היטב, אך אפיגנום מתפורר, ירידה בזינוק בתגובות הלחץ, ואובדן צליבה מפצ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות לחברי מעבדת סמואלסון בעבר ובהווה על עזרתם בחידוד שיטה זו ו/או דיון שסייעו בפיתוח כתב יד זה. מחקר שדווח בפרסום זה נתמך על ידי המכון הלאומי להזדקנות המכונים הלאומיים לבריאות תחת מספרי פרס RF1AG062593 ו- R21AG064519. התוכן הוא באחריות המחברים בלבד ואינו מייצג בהכרח את הדעות הרשמיות של המכונים הלאומיים לבריאות. למממנים לא היה כל תפקיד בעיצוב מחקר, איסוף וניתוח נתונים, החלטה לפרסם או הכנת כתב היד.
Materials
| 24 Well Culture Plates | Greiner Bio-One | #662102 | |
| 2 mL 96-well plates | Greiner Bio-One | #780286 | |
| 600 µL 96-well plates | Greiner Bio-One | #786261 | |
| 96-pin plate replicator | Nunc | 250520 | |
| Air-permeable plate seal | VWR | 60941-086 | |
| bacteriological agar | Affymetrix/USB | 10906 | |
| bacto-peptone | VWR | 90000-368 | |
| C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Ahringer | Source Bioscience | C. elegans RNAi Collection (Ahringer) | See also Kamath et. al, Nature 2003. |
| C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Vidal | Source Bioscience | C. elegans ORF-RNAi Resource (Vidal) | See also Rual et. al, Genome Research 2004. This library is also available from Dharmacon. |
| FuDR (5-Fluoro-2'-deoxyuridine) | Alfa Aesar | L16497 | |
| Glass microscope cover slips | VWR | 48404-455 | |
| Glass microscope slides | VWR | 160004-422 | |
| IPTG (isopropyl beta-D-1-thigalactopyranoside) | Gold Bio | 12481C100 | |
| Retangular non-treated single-well plate, 128x86mm | Thermo-Fisher | 242811 | |
| Sodium Azide, CAS #26628-22-8 | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Zeiss Axio Imager M2m microscope with AxioVision v4.8.2.0 software | Zeiss | unknown | |
| Zeiss StemiSV11 M2 Bio Quad microscope | Zeiss | unknown |
References
- Wolff, S., Weissman, J. S., Dillin, A. Differential scales of protein quality control. Cell. 157 (1), 52-64 (2014).
- Labbadia, J., Morimoto, R. I. The biology of proteostasis in aging and disease. Annual Review of Biochemistry. 84, 435-464 (2015).
- Powers, E. T., Morimoto, R. I., Dillin, A., Kelly, J. W., Balch, W. E. Biological and chemical approaches to diseases of proteostasis deficiency. Annual Review of Biochemistry. 78, 959-991 (2009).
- Brehme, M., et al. A chaperome subnetwork safeguards proteostasis in aging and neurodegenerative disease. Cell Reports. 9 (3), 1135-1150 (2014).
- Sala, A. J., Bott, L. C., Morimoto, R. I. Shaping proteostasis at the cellular, tissue, and organismal level. Journal of Cell Biology. 216 (5), 1231-1241 (2017).
- Braak, H., Braak, E., Strothjohann, M. Abnormally phosphorylated tau protein related to the formation of neurofibrillary tangles and neuropil threads in the cerebral cortex of sheep and goat. Neuroscience Letters. 171 (1-2), 1-4 (1994).
- Poirier, M. A., Jiang, H., Ross, C. A. A structure-based analysis of huntingtin mutant polyglutamine aggregation and toxicity: evidence for a compact beta-sheet structure. Human Molecular Genetics. 14 (6), 765-774 (2005).
- Vilchez, D., Saez, I., Dillin, A. The role of protein clearance mechanisms in organismal ageing and age-related diseases. Nature Communications. 5, 5659 (2014).
- Eftekharzadeh, B., Hyman, B. T., Wegmann, S. Structural studies on the mechanism of protein aggregation in age related neurodegenerative diseases. Mechanisms of Ageing and Development. 156, 1-13 (2016).
- Pokrishevsky, E., Grad, L. I., Cashman, N. R. TDP-43 or FUS-induced misfolded human wild-type SOD1 can propagate intercellularly in a prion-like fashion. Scientific Reports. 6, 22155 (2016).
- Mukherjee, A., Morales-Scheihing, D., Butler, P. C., Soto, C. Type 2 diabetes as a protein misfolding disease. Trends in Molecular Medicine. 21 (7), 439-449 (2015).
- Sikkink, L. A., Ramirez-Alvarado, M. Biochemical and aggregation analysis of Bence Jones proteins from different light chain diseases. Amyloid. 15 (1), 29-39 (2008).
- Qu, B. H., Strickland, E., Thomas, P. J. Cystic fibrosis: a disease of altered protein folding. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 29 (5), 483-490 (1997).
- Qu, B. H., Strickland, E. H., Thomas, P. J. Localization and suppression of a kinetic defect in cystic fibrosis transmembrane conductance regulator folding. Journal of Biological Chemistry. 272 (25), 15739-15744 (1997).
- Brignull, H. R., Moore, F. E., Tang, S. J., Morimoto, R. I. Polyglutamine proteins at the pathogenic threshold display neuron-specific aggregation in a pan-neuronal Caenorhabditis elegans model. Journal of Neuroscience. 26 (29), 7597-7606 (2006).
- Gidalevitz, T., Ben-Zvi, A., Ho, K. H., Brignull, H. R., Morimoto, R. I. Progressive disruption of cellular protein folding in models of polyglutamine diseases. Science. 311 (5766), 1471-1474 (2006).
- Morimoto, R. I. Stress, aging, and neurodegenerative disease. New England Journal of Medicine. 355 (21), 2254-2255 (2006).
- Morimoto, R. I. Proteotoxic stress and inducible chaperone networks in neurodegenerative disease and aging. Genes & Development. 22 (11), 1427-1438 (2008).
- Walker, F. O. Huntington’s disease. Lancet. 369 (9557), 218-228 (2007).
- Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biology. 2 (1), 0002 (2001).
- Karady, I., et al. Using Caenorhabditis elegans as a model system to study protein homeostasis in a multicellular organism. Journal of Visualized Experiments. (82), e50840 (2013).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
- Cornwell, A. B., Llop, J. R., Salzman, P., Thakar, J., Samuelson, A. V. The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan. Journal of Visualized Experiments. (136), e57819 (2018).
- Angeli, S., et al. A DNA synthesis inhibitor is protective against proteotoxic stressors via modulation of fertility pathways in Caenorhabditis elegans. Aging (Albany NY). 5 (10), 759-769 (2013).
- Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset. PLoS One. 9 (1), 85964 (2014).
- Byerly, L., Cassada, R. C., Russell, R. L. The life cycle of the nematode Caenorhabditis elegans. I. Wild-type growth and reproduction. Developmental Biology. 51 (1), 23-33 (1976).
- Schemper, M. Cox Analysis of Survival Data with Non-Proportional Hazard Functions. Journal of the Royal Statistical Society. Series D (The Statistician). 41 (4), 455-465 (1992).
- Royston, P., Parmar, M. K. The use of restricted mean survival time to estimate the treatment effect in randomized clinical trials when the proportional hazards assumption is in doubt. Statistics in Medicine. 30 (19), 2409-2421 (2011).
- Campbell, I. Chi-squared and Fisher-Irwin tests of two-by-two tables with small sample recommendations. Statistics in Medicine. 26 (19), 3661-3675 (2007).
- Busing, F. M., Weaver, B., Dubois, S. 2 x 2 Tables: a note on Campbell’s recommendation. Statistics in Medicine. 35 (8), 1354-1358 (2016).
- Das, R., et al. The homeodomain-interacting protein kinase HPK-1 preserves protein homeostasis and longevity through master regulatory control of the HSF-1 chaperone network and TORC1-restricted autophagy in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 13 (10), 1007038 (2017).
- Garcia, S. M., Casanueva, M. O., Silva, M. C., Amaral, M. D., Morimoto, R. I. Neuronal signaling modulates protein homeostasis in Caenorhabditis elegans post-synaptic muscle cells. Genes & Development. 21 (22), 3006-3016 (2007).
- Morley, J. F., Brignull, H. R., Weyers, J. J., Morimoto, R. I. The threshold for polyglutamine-expansion protein aggregation and cellular toxicity is dynamic and influenced by aging in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (16), 10417-10422 (2002).
- Labbadia, J., Morimoto, R. I. Repression of the Heat Shock Response Is a Programmed Event at the Onset of Reproduction. Molecular Cell. 59 (4), 639-650 (2015).
- Shemesh, N., Shai, N., Ben-Zvi, A. Germline stem cell arrest inhibits the collapse of somatic proteostasis early in Caenorhabditis elegans adulthood. Aging Cell. 12 (5), 814-822 (2013).
- Ben-Zvi, A., Miller, E. A., Morimoto, R. I. Collapse of proteostasis represents an early molecular event in Caenorhabditis elegans aging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (35), 14914-14919 (2009).
- Walther, D. M., et al. Widespread Proteome Remodeling and Aggregation in Aging C. elegans. Cell. 161 (4), 919-932 (2015).
- Cohen, E., Bieschke, J., Perciavalle, R. M., Kelly, J. W., Dillin, A. Opposing activities protect against age-onset proteotoxicity. Science. 313 (5793), 1604-1610 (2006).
- Silva, M. C., et al. A genetic screening strategy identifies novel regulators of the proteostasis network. PLoS Genetics. 7 (12), 1002438 (2011).
- Zhang, L., Ward, J. D., Cheng, Z., Dernburg, A. F. The auxin-inducible degradation (AID) system enables versatile conditional protein depletion in C. elegans. Development. 142 (24), 4374-4384 (2015).
- Hansen, M., Hsu, A. L., Dillin, A., Kenyon, C. New genes tied to endocrine, metabolic, and dietary regulation of lifespan from a Caenorhabditis elegans genomic RNAi screen. PLoS Genetics. 1 (1), 119-128 (2005).
- Nollen, E. A., et al. Genome-wide RNA interference screen identifies previously undescribed regulators of polyglutamine aggregation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (17), 6403-6408 (2004).
- Samuelson, A. V., Carr, C. E., Ruvkun, G. Gene activities that mediate increased life span of C. elegans insulin-like signaling mutants. Genes & Development. 21 (22), 2976-2994 (2007).
- Johnson, D. W., et al. The Caenorhabditis elegans Myc-Mondo/Mad complexes integrate diverse longevity signals. PLoS Genetics. 10 (4), 1004278 (2014).
- Wang, Z., Sherwood, D. R. Dissection of genetic pathways in C. elegans. Methods in Cell Biology. 106, 113-157 (2011).
- Jorgensen, E. M., Mango, S. E. The art and design of genetic screens: caenorhabditis elegans. Nature Reviews Genetics. 3 (5), 356-369 (2002).
