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Biology

Quantificando o declínio proteostático específico do tecido em elegans caenorhabditis

Published: September 07, 2021
doi:
10.3791/61100
, ,
1Department of Biomedical Genetics,University of Rochester Medical Center

Summary

O declínio proteostático é uma marca do envelhecimento, facilitando o aparecimento de doenças neurodegenerativas. Delineamos um protocolo para medir quantificadamente a proteostase em dois tecidos elegans caenorhabditis diferentes através da expressão heteróloga de repetições de poliglutamina fundidas a um repórter fluorescente. Este modelo permite uma rápida análise genética in vivo da proteostase.

Abstract

A capacidade de manter a função adequada e o dobrável do proteome (proteína homeostase) diminui durante o envelhecimento normal, facilitando o aparecimento de um número crescente de doenças associadas à idade. Por exemplo, proteínas com expansões de poliglutamina são propensas à agregação, como exemplificado com a proteína de huntingtina e o aparecimento concomitante da doença de Huntington. A deterioração associada à idade do proteome tem sido amplamente estudada através do uso de caenorhabditis elegans transgênicos expressando repetições de polq fundidas a uma proteína fluorescente amarela (YFP). Este modelo animal transgênico poliQ::YFP facilita a quantificação direta do declínio associado à idade do proteome através da imagem da formação progressiva de focos fluorescentes (ou seja, agregados proteicos) e subsequente aparecimento de defeitos de locomoção que se desenvolvem como resultado do colapso do proteome. Além disso, a expressão do transgênico polyQ::YFP pode ser impulsionada por promotores específicos do tecido, permitindo a avaliação da proteostase entre tecidos no contexto de um organismo multicelular intacto. Este modelo é altamente receptivo à análise genética, proporcionando assim uma abordagem para quantificar o envelhecimento que é complementar aos ensaios de vida útil. Descrevemos como medir com precisão a formação de focos de polq::YFP dentro de neurônios ou músculos da parede corporal durante o envelhecimento, e o subsequente aparecimento de defeitos comportamentais. Em seguida, destacamos como essas abordagens podem ser adaptadas para maior rendimento e potenciais aplicações futuras usando outras estratégias emergentes para a análise genética de C. elegans.

Introduction

A homeostase proteica (proteostase) é definida como a capacidade celular de manter a função adequada e a dobra do proteome. O desafio inerente à proteostase é garantir que todas as proteínas sejam devidamente dobradas e mantidas em uma conformação nativa, que é ainda mais amplificada pela natureza variada do tamanho da proteína, composição de aminoácidos, conformação estrutural, estabilidade, rotatividade, expressão, compartimentação subcelular e modificações1. A proteostase é mantida através da ação coordenada de uma grande rede proteostática, composta por aproximadamente 2000 proteínas únicas, que regulam a síntese adequada, dobramento, tráfico e degradação dentro do proteome2,3. Os componentes do cavalo de trabalho da rede proteostática são nove grandes famílias de acompanhantes moleculares4. Cada tipo de tecido e célula utiliza preferencialmente subconjuntos específicos de acompanhantes moleculares, presumivelmente em alinhamento com as diferentes demandas de proteomes distintos5.

Uma marca registrada do envelhecimento organismo normal é o declínio progressivo e o colapso da proteostase celular, que é considerada uma base subjacente para o início e progressão de um número crescente de doenças associadas à idade. Por exemplo, doença de Alzheimer, doença de Parkinson, doença de Huntington, e a Esclerose Lateral Amiotrófica (ELA) compartilham uma característica comum: em cada caso, a manifestação da neurodegeneração é impulsionada por alterações genéticas que predispõem uma proteína mutante à agregação (amilóide-β/Tau, α-sinucleína, HTT, FUS/TBD-43/SOD-1,respectivamente) 6,7,8, 8,9,10 . Durante o envelhecimento, a integridade e induibilidade da rede proteostática diminui, o que resulta no acúmulo de agregados proteotóxicos que resultam em disfunção celular e neurodegeneração. Note-se que as doenças conformais proteicas não são exclusivas dos neurônios, e ocorrem em múltiplos tecidos, como destacado pelo diabetes tipo II, mieloma múltiplo e fibrose cística11,12,13,14. Portanto, a elucidação de mecanismos capazes de preservar a proteostase facilitará o desenvolvimento de intervenções direcionadas para o tratamento da doença e promoverá o envelhecimento saudável.

O pequeno nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) tem sido fundamental na descoberta de genes e caminhos elucidadores que alteram a proteostase. Muitos componentes da rede proteostática e as vias de transdução de sinal que regulam a proteostase são evolutivamente conservados. Além disso, C. elegans reduziu a complexidade e a redundância em relação aos sistemas de vertebrados, tornando-o mais agradável à análise genética e à descoberta genética. Outras vantagens de C. elegans que o levaram a ser amplamente utilizado como um sistema modelo para estudar proteostase incluem: genômica genética e funcional poderosa, um ciclo de vida curto (3 dias) e vida útil (3 semanas), um genoma compacto e bem anotado, a disponibilidade de uma ampla variedade de mutantes genéticos, e a facilidade de visualizar mudanças específicas de tecido na biologia celular usando repórteres fluorescentes.

A decadência progressiva da proteostase durante o envelhecimento pode ser facilmente quantificada em C. elegans. O laboratório de Morimoto demonstrou pela primeira vez que uma expansão de poliglutamina fundida à proteína fluorescente amarela(polyQ::YFP) poderia ser usada para quantificar o declínio proteostático em C. elegans durante o envelhecimento15,16,17,18. As fusões de YFP a 35 repetições de glutamina ou mais resultam em uma formação associada à idade de focos fluorescentes, juntamente com sinais de patologia celular. Note-se que esta gama de expansão da glutamina reflete o comprimento do trato de poliglutamina da proteína Huntingtin na qual a patologia da Doença de Huntington começa a ser observada em humanos (tipicamente >35 CAG repete)19. Cepas com expressão de polq::YFP dentro de células musculares, intestinais ou neuronais têm sido utilizadas para confirmar que o declínio associado à idade da proteostase ocorre em diferentes tipos de células e tecidos. PoliQ específico para músculos::YFP expressão (i.e., unc-54p::Q35::YFP) tem sido o repórter mais amplamente utilizado como tecido específico, pois os focos fluorescentes acumulados são fáceis de quantificar nos primeiros dias da vida adulta usando um simples microscópio de dissecação fluorescente(Figura 1A-1B). Além disso, os animais ficam paralisados durante a meia-idade, pois o proteome dentro do músculo entra em colapso devido ao efeito proteotóxico do repórter(Figura 1C). Da mesma forma, o declínio associado à idade na proteostase neuronal pode ser seguido(rgef-1p::Q40::YFP) quantificando diretamente a formação de focos/agregados e declínios associados à idade em curvas corporais coordenadas após a colocação de animais em líquido(Figura 2).

Aqui, apresentamos um protocolo detalhado sobre como medir a progressão dependente da idade do acúmulo agregado de proteínas e a proteotoxicidade associada induzida pela expressão de poliglutamina repetida dentro do tecido neuronal e muscular em C. elegans. Fornecemos exemplos de resultados típicos gerados usando essas cepas e métodos. Além disso, mostramos como utilizamos esses métodos para estudar a regulação transcricional da rede proteostática. Discutimos maneiras adicionais de esses repórteres serem facilmente integrados com outros reagentes existentes ou adaptados para telas maiores.

Protocol

1. Preparação de reagentes Selecione genes de interesse para serem inativados através de RNAi baseados em alimentação. Comprar ações da HT115 E. coli contendo o clone RNAi de interesse20. Alternativamente, subclone o cDNA do gene de interesse no local multicloning do plasmídeo L4440.NOTA: Para evitar a degradação do dsRNA dentro da bactéria, use a cepa HT115. Esta é uma cepa E. coli deficiente RNase III com atividade de polimerase T7 indutível pelo IPTG…

Representative Results

Em C. elegans,o modelo de repetição de poliglutamina tem sido fundamental para a identificação de genes que regulam a rede proteostática. Por exemplo, mostramos anteriormente que a quinase proteica interativa de homeodomina (hpk-1),um cofator transcricional, influencia a proteostase durante o envelhecimento, regulando a expressão da autofagia e dos acompanhantes moleculares31. Descobrimos que a perda de hpk-1, seja por silenciamento RNAi ou em animais mutantes nulo…

Discussion

O envelhecimento é caracterizado por um declínio gradual da proteostase. A proteostase é mantida por um sistema complexo, a rede proteostática, para o controle coordenado, dinâmico e responsivo do estresse do dobrável, degradação e tradução de proteínas. Por que a proteostase falha no curso do envelhecimento é mal compreendida, mas um epigenome em decomposição, a induibilidade em declínio das respostas ao estresse e a perda de conversa cruzada compensatória coincidem com esse colapso. Em C. elegans,</…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gostaríamos de agradecer aos membros passados e presentes do laboratório Samuelson por sua assistência no refinamento deste método e/ou discussão que auxiliou no desenvolvimento deste manuscrito. A pesquisa relatada nesta publicação foi apoiada pelo Instituto Nacional de Envelhecimento dos Institutos Nacionais de Saúde sob os Números de Premiação RF1AG062593 e R21AG064519. O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais dos Institutos Nacionais de Saúde. Os financiadores não tiveram papel na concepção do estudo, coleta e análise de dados, decisão de publicar ou elaboração do manuscrito.

Materials

24 Well Culture Plates Greiner Bio-One #662102
2 mL 96-well plates Greiner Bio-One #780286
600 µL 96-well plates Greiner Bio-One #786261
96-pin plate replicator Nunc 250520
Air-permeable plate seal VWR 60941-086
bacteriological agar Affymetrix/USB 10906
bacto-peptone VWR 90000-368
C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Ahringer Source Bioscience C. elegans RNAi Collection (Ahringer) See also Kamath et. al, Nature 2003.
C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Vidal Source Bioscience C. elegans ORF-RNAi Resource (Vidal) See also Rual et. al, Genome Research 2004. This library is also available from Dharmacon.
FuDR (5-Fluoro-2'-deoxyuridine) Alfa Aesar L16497
Glass microscope cover slips VWR 48404-455
Glass microscope slides VWR 160004-422
IPTG (isopropyl beta-D-1-thigalactopyranoside) Gold Bio 12481C100
Retangular non-treated single-well plate, 128x86mm Thermo-Fisher 242811
Sodium Azide, CAS #26628-22-8 Sigma-Aldrich S2002
Zeiss Axio Imager M2m microscope with AxioVision v4.8.2.0 software Zeiss unknown
Zeiss StemiSV11 M2 Bio Quad microscope Zeiss unknown
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Keywords: ProteostasisCaenorhabditis ElegansPolyglutamine Fluorescent ReporterAgingProtein Misfolding DiseasesAlzheimer’sParkinson’sHuntington’s DiseaseAmyotrophic Lateral SclerosisRNAiOP50 E.coliHypochlorite TreatmentL1 Animals
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Lazaro-Pena, M. I., Cornwell, A. B., Samuelson, A. V. Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (175), e61100, doi:10.3791/61100 (2021).
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