Количественная оценка тканеспецифического снижения протеостатического снижения caenorhabditis elegans
Summary
Снижение протеостата является отличительной чертой старения, способствуя возникновению нейродегенеративных заболеваний. Мы описываем протокол количественного измерения протеостаза в двух разных тканях Caenorhabditis elegans посредством гетерологичной экспрессии полиглутаминных повторов, слитых с флуоресцентным репортером. Эта модель позволяет проводить экспресс-анализ протеостаза in vivo.
Abstract
Способность поддерживать правильную функцию и сворачивание протеома (белкового гомеостаза) снижается во время нормального старения, способствуя возникновению растущего числа возрастных заболеваний. Например, белки с полиглутаминными расширениями склонны к агрегации, как по примеру белка гентингтина и сопутствующего начала болезни Гентингтона. Возрастное ухудшение протеома было широко изучено с помощью трансгенных Caenorhabditis elegans, экспрессирующих повторы polyQ, слитые с желтым флуоресцентным белком (YFP). Эта трансгенная модель животных polyQ::YFP облегчает прямую количественную оценку возрастного снижения протеома путем визуализации прогрессирующего образования флуоресцентных очагов (т.е. белковых агрегатов) и последующего возникновения дефектов локомоции, которые развиваются в результате коллапса протеома. Кроме того, экспрессия трансгена polyQ::YFP может управляться тканеспецифическими промодерами, что позволяет оценить протеостаз через ткани в контексте интактного многоклеточного организма. Эта модель очень поддается генетическому анализу, обеспечивая тем самым подход к количественной оценке старения, который дополняет анализы продолжительности жизни. Мы описываем, как точно измерить образование фокусов polyQ::YFP в нейронах или мышцах стенки тела во время старения и последующего возникновения поведенческих дефектов. Далее мы расскажем, как эти подходы могут быть адаптированы для более высокой пропускной способности и потенциальных будущих применений с использованием других новых стратегий генетического анализа C. elegans.
Introduction
Белковый гомеостаз (протеостаз) определяется как клеточная способность поддерживать правильную функцию и сворачивание протеома. Неотъемлемая проблема протеостаза заключается в обеспечении того, чтобы все белки были должным образом свернуты и поддерживались в нативной конформации, которая дополнительно усиливается разнообразной природой размера белка, аминокислотного состава, структурной конформации, стабильности, оборота, экспрессии, субклеточной компартментализации и модификаций1. Протеостаз поддерживается благодаря скоординированному действию большой протеостатической сети, состоящей примерно из 2000 уникальных белков, которые регулируют правильный синтез, сворачивание, торговлю и деградацию в протеоме2,3. Компонентами рабочей лошадки протеостатической сети являются девять основных семейств молекулярных шаперонов4. Каждая ткань и тип клеток преимущественно используют специфические подмножества молекулярных шаперонов, по-видимому, в соответствии с различными требованиями различных протеомов5.
Одним из отличительных признаков нормального старения организма является прогрессирующее снижение и коллапс клеточного протеостаза, который считается основной основой для возникновения и прогрессирования растущего числа возрастных заболеваний. Например, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, болезнь Хантингтона и боковой амиотрофический склероз (БАС) имеют общую характеристику: в каждом случае проявление нейродегенерации обусловлено генетическими изменениями, которые предрасполагают мутантный белок к агрегации (амилоид-β/тау, α-синуклеин, HTT, FUS/TBD-43/SOD-1, соответственно)6,7,8,9,10 . Во время старения целостность и индуцируемость протеостатической сети снижается, что приводит к накоплению протеотоксических агрегатов, что приводит к клеточной дисфункции и нейродегенерации. Следует отметить, что белковые конформационные заболевания не являются уникальными для нейронов и происходят в нескольких тканях, как подчеркивается диабетом II типа, множественной миеломой и муковисцидозом11,12,13,14. Таким образом, выяснение механизмов, способных сохранить протеостаз, будет способствовать разработке целенаправленных вмешательств для лечения заболеваний и содействия здоровому старению.
Маленькая почвенная нематода Caenorhabditis elegans (C. elegans)сыграла важную роль в обнаружении генов и выяснении путей, которые изменяют протеостаз. Многие компоненты протеостатической сети и сигнальные пути трансдукции, которые регулируют протеостаз, эволюционно сохраняются. Кроме того, C. elegans снизил сложность и избыточность по сравнению с системами позвоночных, что делает его более поддается генетическому анализу и открытию генов. Дополнительные преимущества C. elegans, которые привели к его широкому использованию в качестве модельной системы для изучения протеостаза, включают: мощную генетическую и функциональную геномику, короткий жизненный цикл (3 дня) и продолжительность жизни (3 недели), компактный и хорошо аннотированный геном, наличие широкого ассортимента генетических мутантов и простоту визуализации тканеспецифических изменений в клеточной биологии с помощью флуоресцентных репортеров.
Прогрессирующий распад протеостаза во время старения может быть легко количественно определен в C. elegans. Лаборатория Моримото впервые продемонстрировала, что расширение полиглутамина, слитое с желтым флуоресцентным белком(polyQ::YFP),может быть использовано для количественной оценки протеостатического снижения C. elegans во время старения15,16,17,18. Слияние YFP до 35 и более глутаминов приводит к возрастному образованию флуоресцентных очагов наряду с признаками клеточной патологии. Следует отметить, что этот диапазон расширения глютамина отражает длину полиглутаминового тракта белка Гентингтина, при котором патология болезни Гентингтона начинает наблюдаться у людей (обычно >35 ЦАГ-повторов)19. Штаммы с экспрессией polyQ::YFP в мышечных, кишечных или нейрональных клетках были использованы для подтверждения того, что возрастное снижение протеостаза происходит в разных типах клеток и тканей. Мышечно-специфическая экспрессия polyQ::YFP (т.е. unc-54p::Q35::YFP)была наиболее широко используемым тканеспецифическим репортером, поскольку накапливающиеся флуоресцентные очаги легко поддаются количественной оценке в течение первых нескольких дней взрослой жизни с помощью простого флуоресцентного рассекающего микроскопа(рисунок 1A-1B). Кроме того, животные становятся парализованными в середине жизни, так как протеом внутри мышцы разрушается из-за протеотоксического эффекта репортера(рисунок 1C). Аналогичным образом, возрастное снижение нейронального протеостаза можетсопровождаться (rgef-1p::Q40::YFP)путем непосредственной количественной оценки образования очагов/агрегатов и возрастного снижения скоординированных изгибов тела после помещения животных в жидкость(рисунок 2).
Здесь мы представляем подробный протокол о том, как измерить возрастную прогрессию накопления белковых агрегатов и связанную с ней протеотоксичность, индуцированную экспрессией полиглутаминных повторов в нейронной и мышечной ткани у C. elegans. Мы приведем примеры типичных результатов, полученных с использованием этих штаммов и методов. Кроме того, мы показываем, как мы использовали эти методы для изучения транскрипционной регуляции протеостатической сети. Мы обсуждаем дополнительные способы, которыми эти репортеры могут быть легко интегрированы с другими существующими реагентами или адаптированы для больших экранов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Старение характеризуется постепенным снижением протеостаза. Протеостаз поддерживается сложной системой, протеостатической сетью, для скоординированного, динамического, стресс-реагирующего контроля сворачивания, деградации и трансляции белка. Почему протеостаз терпит неудачу в про…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить бывших и нынешних членов лаборатории Самуэльсона за их помощь в совершенствовании этого метода и / или обсуждении, которое помогло разработке этой рукописи. Исследования, представленные в этой публикации, были поддержаны Национальным институтом по проблемам старения Национальных институтов здравоохранения под номерами RF1AG062593 и R21AG064519. Содержание является исключительной ответственностью авторов и не обязательно отражает официальную точку зрения Национальных институтов здравоохранения. Спонсоры не имели никакого значения в разработке исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.
Materials
| 24 Well Culture Plates | Greiner Bio-One | #662102 | |
| 2 mL 96-well plates | Greiner Bio-One | #780286 | |
| 600 µL 96-well plates | Greiner Bio-One | #786261 | |
| 96-pin plate replicator | Nunc | 250520 | |
| Air-permeable plate seal | VWR | 60941-086 | |
| bacteriological agar | Affymetrix/USB | 10906 | |
| bacto-peptone | VWR | 90000-368 | |
| C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Ahringer | Source Bioscience | C. elegans RNAi Collection (Ahringer) | See also Kamath et. al, Nature 2003. |
| C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Vidal | Source Bioscience | C. elegans ORF-RNAi Resource (Vidal) | See also Rual et. al, Genome Research 2004. This library is also available from Dharmacon. |
| FuDR (5-Fluoro-2'-deoxyuridine) | Alfa Aesar | L16497 | |
| Glass microscope cover slips | VWR | 48404-455 | |
| Glass microscope slides | VWR | 160004-422 | |
| IPTG (isopropyl beta-D-1-thigalactopyranoside) | Gold Bio | 12481C100 | |
| Retangular non-treated single-well plate, 128x86mm | Thermo-Fisher | 242811 | |
| Sodium Azide, CAS #26628-22-8 | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Zeiss Axio Imager M2m microscope with AxioVision v4.8.2.0 software | Zeiss | unknown | |
| Zeiss StemiSV11 M2 Bio Quad microscope | Zeiss | unknown |
References
- Wolff, S., Weissman, J. S., Dillin, A. Differential scales of protein quality control. Cell. 157 (1), 52-64 (2014).
- Labbadia, J., Morimoto, R. I. The biology of proteostasis in aging and disease. Annual Review of Biochemistry. 84, 435-464 (2015).
- Powers, E. T., Morimoto, R. I., Dillin, A., Kelly, J. W., Balch, W. E. Biological and chemical approaches to diseases of proteostasis deficiency. Annual Review of Biochemistry. 78, 959-991 (2009).
- Brehme, M., et al. A chaperome subnetwork safeguards proteostasis in aging and neurodegenerative disease. Cell Reports. 9 (3), 1135-1150 (2014).
- Sala, A. J., Bott, L. C., Morimoto, R. I. Shaping proteostasis at the cellular, tissue, and organismal level. Journal of Cell Biology. 216 (5), 1231-1241 (2017).
- Braak, H., Braak, E., Strothjohann, M. Abnormally phosphorylated tau protein related to the formation of neurofibrillary tangles and neuropil threads in the cerebral cortex of sheep and goat. Neuroscience Letters. 171 (1-2), 1-4 (1994).
- Poirier, M. A., Jiang, H., Ross, C. A. A structure-based analysis of huntingtin mutant polyglutamine aggregation and toxicity: evidence for a compact beta-sheet structure. Human Molecular Genetics. 14 (6), 765-774 (2005).
- Vilchez, D., Saez, I., Dillin, A. The role of protein clearance mechanisms in organismal ageing and age-related diseases. Nature Communications. 5, 5659 (2014).
- Eftekharzadeh, B., Hyman, B. T., Wegmann, S. Structural studies on the mechanism of protein aggregation in age related neurodegenerative diseases. Mechanisms of Ageing and Development. 156, 1-13 (2016).
- Pokrishevsky, E., Grad, L. I., Cashman, N. R. TDP-43 or FUS-induced misfolded human wild-type SOD1 can propagate intercellularly in a prion-like fashion. Scientific Reports. 6, 22155 (2016).
- Mukherjee, A., Morales-Scheihing, D., Butler, P. C., Soto, C. Type 2 diabetes as a protein misfolding disease. Trends in Molecular Medicine. 21 (7), 439-449 (2015).
- Sikkink, L. A., Ramirez-Alvarado, M. Biochemical and aggregation analysis of Bence Jones proteins from different light chain diseases. Amyloid. 15 (1), 29-39 (2008).
- Qu, B. H., Strickland, E., Thomas, P. J. Cystic fibrosis: a disease of altered protein folding. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 29 (5), 483-490 (1997).
- Qu, B. H., Strickland, E. H., Thomas, P. J. Localization and suppression of a kinetic defect in cystic fibrosis transmembrane conductance regulator folding. Journal of Biological Chemistry. 272 (25), 15739-15744 (1997).
- Brignull, H. R., Moore, F. E., Tang, S. J., Morimoto, R. I. Polyglutamine proteins at the pathogenic threshold display neuron-specific aggregation in a pan-neuronal Caenorhabditis elegans model. Journal of Neuroscience. 26 (29), 7597-7606 (2006).
- Gidalevitz, T., Ben-Zvi, A., Ho, K. H., Brignull, H. R., Morimoto, R. I. Progressive disruption of cellular protein folding in models of polyglutamine diseases. Science. 311 (5766), 1471-1474 (2006).
- Morimoto, R. I. Stress, aging, and neurodegenerative disease. New England Journal of Medicine. 355 (21), 2254-2255 (2006).
- Morimoto, R. I. Proteotoxic stress and inducible chaperone networks in neurodegenerative disease and aging. Genes & Development. 22 (11), 1427-1438 (2008).
- Walker, F. O. Huntington’s disease. Lancet. 369 (9557), 218-228 (2007).
- Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biology. 2 (1), 0002 (2001).
- Karady, I., et al. Using Caenorhabditis elegans as a model system to study protein homeostasis in a multicellular organism. Journal of Visualized Experiments. (82), e50840 (2013).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
- Cornwell, A. B., Llop, J. R., Salzman, P., Thakar, J., Samuelson, A. V. The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan. Journal of Visualized Experiments. (136), e57819 (2018).
- Angeli, S., et al. A DNA synthesis inhibitor is protective against proteotoxic stressors via modulation of fertility pathways in Caenorhabditis elegans. Aging (Albany NY). 5 (10), 759-769 (2013).
- Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset. PLoS One. 9 (1), 85964 (2014).
- Byerly, L., Cassada, R. C., Russell, R. L. The life cycle of the nematode Caenorhabditis elegans. I. Wild-type growth and reproduction. Developmental Biology. 51 (1), 23-33 (1976).
- Schemper, M. Cox Analysis of Survival Data with Non-Proportional Hazard Functions. Journal of the Royal Statistical Society. Series D (The Statistician). 41 (4), 455-465 (1992).
- Royston, P., Parmar, M. K. The use of restricted mean survival time to estimate the treatment effect in randomized clinical trials when the proportional hazards assumption is in doubt. Statistics in Medicine. 30 (19), 2409-2421 (2011).
- Campbell, I. Chi-squared and Fisher-Irwin tests of two-by-two tables with small sample recommendations. Statistics in Medicine. 26 (19), 3661-3675 (2007).
- Busing, F. M., Weaver, B., Dubois, S. 2 x 2 Tables: a note on Campbell’s recommendation. Statistics in Medicine. 35 (8), 1354-1358 (2016).
- Das, R., et al. The homeodomain-interacting protein kinase HPK-1 preserves protein homeostasis and longevity through master regulatory control of the HSF-1 chaperone network and TORC1-restricted autophagy in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 13 (10), 1007038 (2017).
- Garcia, S. M., Casanueva, M. O., Silva, M. C., Amaral, M. D., Morimoto, R. I. Neuronal signaling modulates protein homeostasis in Caenorhabditis elegans post-synaptic muscle cells. Genes & Development. 21 (22), 3006-3016 (2007).
- Morley, J. F., Brignull, H. R., Weyers, J. J., Morimoto, R. I. The threshold for polyglutamine-expansion protein aggregation and cellular toxicity is dynamic and influenced by aging in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (16), 10417-10422 (2002).
- Labbadia, J., Morimoto, R. I. Repression of the Heat Shock Response Is a Programmed Event at the Onset of Reproduction. Molecular Cell. 59 (4), 639-650 (2015).
- Shemesh, N., Shai, N., Ben-Zvi, A. Germline stem cell arrest inhibits the collapse of somatic proteostasis early in Caenorhabditis elegans adulthood. Aging Cell. 12 (5), 814-822 (2013).
- Ben-Zvi, A., Miller, E. A., Morimoto, R. I. Collapse of proteostasis represents an early molecular event in Caenorhabditis elegans aging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (35), 14914-14919 (2009).
- Walther, D. M., et al. Widespread Proteome Remodeling and Aggregation in Aging C. elegans. Cell. 161 (4), 919-932 (2015).
- Cohen, E., Bieschke, J., Perciavalle, R. M., Kelly, J. W., Dillin, A. Opposing activities protect against age-onset proteotoxicity. Science. 313 (5793), 1604-1610 (2006).
- Silva, M. C., et al. A genetic screening strategy identifies novel regulators of the proteostasis network. PLoS Genetics. 7 (12), 1002438 (2011).
- Zhang, L., Ward, J. D., Cheng, Z., Dernburg, A. F. The auxin-inducible degradation (AID) system enables versatile conditional protein depletion in C. elegans. Development. 142 (24), 4374-4384 (2015).
- Hansen, M., Hsu, A. L., Dillin, A., Kenyon, C. New genes tied to endocrine, metabolic, and dietary regulation of lifespan from a Caenorhabditis elegans genomic RNAi screen. PLoS Genetics. 1 (1), 119-128 (2005).
- Nollen, E. A., et al. Genome-wide RNA interference screen identifies previously undescribed regulators of polyglutamine aggregation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (17), 6403-6408 (2004).
- Samuelson, A. V., Carr, C. E., Ruvkun, G. Gene activities that mediate increased life span of C. elegans insulin-like signaling mutants. Genes & Development. 21 (22), 2976-2994 (2007).
- Johnson, D. W., et al. The Caenorhabditis elegans Myc-Mondo/Mad complexes integrate diverse longevity signals. PLoS Genetics. 10 (4), 1004278 (2014).
- Wang, Z., Sherwood, D. R. Dissection of genetic pathways in C. elegans. Methods in Cell Biology. 106, 113-157 (2011).
- Jorgensen, E. M., Mango, S. E. The art and design of genetic screens: caenorhabditis elegans. Nature Reviews Genetics. 3 (5), 356-369 (2002).
