JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

Caenorhabditis eleganlarında Dokuya Özgü Proteostatik Düşüşün Ölçülmesi

Published: September 07, 2021
doi:
10.3791/61100
, ,
1Department of Biomedical Genetics,University of Rochester Medical Center

Summary

Proteostatik düşüş, nörodejeneratif hastalıkların başlangıcını kolaylaştıran yaşlanmanın ayırt edici bir özelliğidir. İki farklı Caenorhabditis elegans dokularındaki proteostazları, floresan bir muhabire kaynaşmış poliglutamin tekrarlarının heterolog ifadesiyle ölçülebilir bir şekilde ölçmek için bir protokol özetliyoruz. Bu model proteostazın hızlı in vivo genetik analizine izin verir.

Abstract

Proteonun (protein homeostazı) uygun işlevini ve katlamasını sürdürme yeteneği normal yaşlanma sırasında azalır ve yaşla ilişkili hastalıkların giderek artan sayıda başlangıcını kolaylaştırır. Örneğin, poliglutamin genleşmelerine sahip proteinler, huntingtin proteini ve Huntington hastalığının eşlik eden başlangıcı ile örneklendirilir. Proteonun yaşa bağlı bozulması, sarı floresan proteine (YFP) kaynaşmış poliQ tekrarlarını ifade eden transgenik Caenorhabditis elegans kullanımı ile yaygın olarak incelenmiştir. Bu poliQ::YFP transgenik hayvan modeli, floresan odakların (yani protein agregalarının) ilerleyici oluşumunu ve daha sonra proteomin çökmesi sonucu gelişen lokomotion kusurlarının başlangıcını görüntüleme yoluyla proteomin yaşa bağlı düşüşünün doğrudan nicelemesini kolaylaştırır. Ayrıca, polyQ::YFP transgene ekspresyosu dokuya özgü promotörler tarafından yönlendirilebilir ve proteostazın sağlam çok hücreli bir organizma bağlamında dokular arasında değerlendirilmesini sağlar. Bu model genetik analize son derece elverişlidir, böylece yaşam süresi testlerini tamamlayıcı olan yaşlanmayı ölçmek için bir yaklaşım sağlar. Yaşlanma sırasında nöronlar veya vücut duvar kası içindeki poliQ::YFP odak oluşumunun ve daha sonra davranış kusurlarının başlangıcının nasıl doğru bir şekilde ölçüldüklerini açıklıyoruz. Daha sonra, bu yaklaşımların C. elegans genetik analizi için diğer gelişmekte olan stratejileri kullanarak daha yüksek verim ve gelecekteki potansiyel uygulamalar için nasıl uyarlanabilebileceğini vurguluyoruz.

Introduction

Protein homeostazı (proteostaz), proteomun düzgün çalışmasını ve kat katlamasını sağlamak için hücresel yetenek olarak tanımlanır. Proteostazın doğasında var olan zorluk, tüm proteinlerin protein boyutunun çeşitli doğası, amino asit bileşimi, yapısal konformasyon, stabilite, ciro, ifade, hücresel altı bölümlere ayırma ve değişikliklerle daha da güçlendirilen yerel bir konformasyonda düzgün bir şekilde katlanmasını ve korunmasını sağlamaktır1. Proteostaz, proteom 2,3içinde uygun sentezi, katlamayı, kaçakçılığı ve bozulmayı düzenleyen yaklaşık 2000 benzersiz proteinden oluşan büyük bir proteostatik ağın koordineli etkisi ile sürdürülür. Proteostatik ağın iş atı bileşenleri moleküler refakatçilerin dokuz ana ailesidir4. Her doku ve hücre tipi tercihen moleküler refakatçilerin belirli alt kümelerini kullanır, muhtemelen farklı proteomların farklı talepleri ile uyumlu olarak5.

Normal organizmasal yaşlanmanın ayırt edici özelliklerinden biri, giderek artan sayıda yaşa bağlı hastalığın başlangıcı ve ilerlemesi için temel olduğu düşünülen hücresel proteostazın ilerleyici düşüşü ve çökmesidir. Örneğin, Alzheimer hastalığı, Parkinson hastalığı, Huntington hastalığı ve Amyotrofik Lateral Skleroz (ALS) ortak bir özelliği paylaşmaktadır: her durumda nörodejenerasyonun tezahürü, mutant bir proteini toplama (amiloid-β / Tau, α-synuclein, HTT, FUS/TBD-43/SOD-1, sırasıyla)6,7,8,9,10 . Yaşlanma sırasında, proteostatik ağın bütünlüğü ve indükbilitesi azalır, bu da hücresel işlev bozukluğu ve nörodejenerasyon ile sonuçlanan proteotoksik agregaların birikmesiyle sonuçlanır. Not olarak, protein konformasyonel hastalıklar nöronlara özgü değildir ve tip II diyabet, multipl miyelom ve kistik fibrozis11 , 12 , 13,14ile vurgulandığı gibi birden fazla dokuda görülür. Bu nedenle, proteostazları koruyabilen elucidating mekanizmaları, hastalığın tedavisi için hedefe yönelik müdahalelerin geliştirilmesini ve sağlıklı yaşlanmayı teşvik edecektir.

Küçük toprak nematod Caenorhabditis elegans (C. elegans) genlerin keşfedilmesinde ve proteostazı değiştiren yolların aydınlatıcı yollarında etkili olmuştur. Proteostatik ağın birçok bileşeni ve proteostazı düzenleyen sinyal transdüksiyon yolları evrimsel olarak korunur. Ayrıca, C. elegans omurgalı sistemlere göre karmaşıklığı ve artıklığı azaltarak genetik analiz ve gen keşfine daha uygun hale getirmiştir. C. elegans’ın proteostaz çalışması için bir model sistemi olarak yaygın olarak kullanılmasına yol açan ek avantajları şunlardır: güçlü genetik ve fonksiyonel genomik, kısa bir yaşam döngüsü (3 gün) ve ömür (3 hafta), kompakt ve iyi açıklamalı bir genom, geniş bir genetik mutant yelpazesinin mevcudiyeti ve floresan muhabirleri kullanarak hücre biyolojisinde dokuya özgü değişiklikleri görselleştirme kolaylığı.

Yaşlanma sırasında proteostazın ilerleyici bozunması C. elegans’ta kolayca ölçülebilir. Morimoto laboratuvarı ilk olarak, sarı floresan proteine (polyQ::YFP)kaynaşmış bir poliglutamin genişlemesinin, yaşlanma sırasında C. elegans’taki proteostatik düşüşü ölçmek için kullanılabileceğini göstermiştir15,16,17,18. 35 glutamin tekrarı veya daha fazlasına YFP füzyonları, hücresel patoloji belirtileri ile birlikte floresan odakların yaşa bağlı bir oluşumuna neden sonuçlanır. Not olarak, bu glutamin genişlemesi aralığı, Huntington Hastalığı patolojisinin insanlarda gözlenmeye başladığı Huntingtin proteininin poliglutamin kanalının uzunluğunu yansıtır (tipik olarak >35 CAG tekrar eder)19. Kas, bağırsak veya nöronal hücrelerde poliQ::YFP ekspresyürü ile suşlar, proteostazın yaşa bağlı düşüşünün farklı hücre ve doku tiplerinde meydana geldiğini doğrulamak için kullanılmıştır. Kaslara özgü poliQ::YFP ekspresyifi (örneğin, unc-54p::Q35::YFP),biriken floresan odakların basit bir floresan diseksiyon mikroskobu kullanılarak yetişkinliğin ilk birkaç gününde ölçülmesi kolay olduğu için en yaygın kullanılan dokuya özgü muhabir olmuştur (Şekil 1A-1B). Ek olarak, hayvanlar orta yaşam sırasında felç olur, çünkü kas içindeki proteom muhabirin proteotoksik etkisi nedeniyle çöker (Şekil 1C). Benzer şekilde, nöronal proteostazdaki yaşa bağlı düşüş (rgef-1p::Q40::YFP) hayvanları sıvıya yerleştirdikten sonra koordineli vücut virajlarındaki odak/agrega oluşumu ve yaşa bağlı düşüşler doğrudan ölçülerek takip edilebilir (Şekil 2).

Burada, protein agrega birikiminin yaşa bağlı ilerlemesinin ve C. elegans’tanöronal ve kas dokusunda poliglutamin tekrarlarının ekspresyonu ile indüklenen ilişkili proteotoksisitenin nasıl ölçülacağı hakkında ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Bu suşlar ve yöntemler kullanılarak oluşturulan tipik sonuçlara örnekler sunuyoruz. Ayrıca, proteostatik ağın transkripsiyonsal düzenlemesini incelemek için bu yöntemleri nasıl kullandığımızı gösteriyoruz. Bu muhabirlerin mevcut diğer reaktiflerle kolayca entegre edilebilmesinin veya daha büyük ekranlara uyarlanabilmesinin ek yollarını tartışıyoruz.

Protocol

1. Reaktiflerin hazırlanması Besleme tabanlı RNAi aracılığıyla inaktive edilecek ilgi genlerini seçin. RNAi faiz klonunu içeren HT115 E. coli hisse senetleri20. Alternatif olarak, ilgi geninin cDNA’sını L4440 plazmidinin çok kavunlu bölgesine subklase edin.NOT: Bakteri içindeki dsRNA’nın bozulmasını önlemek için HT115 suşu kullanın. Bu, IPTG-indüklen T7 polimeraz aktivitesi ile RNase III eksikliği olan bir E. coli suşudur. Besleme bazlı RNAi…

Representative Results

C. elegans’da poliglutamin tekrar modeli proteostatik ağı düzenleyen genlerin tanımlanmasında etkili olmuştur. Örneğin, daha önce homeodomainin transkripsiyonel bir kofaktör olan protein kinazını(hpk-1)etkileşime sokarak, otofaji ve moleküler refakatçilerin ekspresyonunu düzenleyerek yaşlanma sırasında proteostazları etkilediğini gösterdik31. RNAi susturma veya hpk-1 (pk1393) null mutant hayvanlarda hpk-1 kaybının yaşlanma sırasında bi…

Discussion

Yaşlanma, proteostazda kademeli bir düşüş ile karakterizedir. Proteostaz, protein katlama, bozulma ve çevirinin koordineli, dinamik, strese duyarlı kontrolü için karmaşık bir sistem olan proteostatik ağ tarafından korunur. Proteostazın yaşlanma sırasında neden başarısız olduğu yezih anlaşılmaktadır, ancak çürüyen bir epigenom, stres yanıtlarının azalan indüksiyonatı ve telafi edici çapraz konuşma kaybı bu arıza ile çakışmaktadır. C. elegans’ta, birden fazla stres yanıtı …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Samuelson laboratuvarının geçmiş ve şimdiki üyelerine, bu yöntemin iyileştirilmesine ve/veya bu makalenin geliştirilmesine yardımcı olan tartışmalara yardımları için teşekkür ederiz. Bu yayında bildirilen araştırmalar, RF1AG062593 ve R21AG064519 Ödül Numaraları altında Ulusal Sağlık Enstitülerinin Yaşlanması Ulusal Enstitüsü tarafından desteklendi. İçerik sadece yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Sağlık Enstitülerinin resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir. Fon sağlayıcılar çalışma tasarımı, veri toplama ve analiz, yayınlama kararı veya makalenin hazırlanmasında hiçbir rol oynamamışlardır.

Materials

24 Well Culture Plates Greiner Bio-One #662102
2 mL 96-well plates Greiner Bio-One #780286
600 µL 96-well plates Greiner Bio-One #786261
96-pin plate replicator Nunc 250520
Air-permeable plate seal VWR 60941-086
bacteriological agar Affymetrix/USB 10906
bacto-peptone VWR 90000-368
C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Ahringer Source Bioscience C. elegans RNAi Collection (Ahringer) See also Kamath et. al, Nature 2003.
C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Vidal Source Bioscience C. elegans ORF-RNAi Resource (Vidal) See also Rual et. al, Genome Research 2004. This library is also available from Dharmacon.
FuDR (5-Fluoro-2'-deoxyuridine) Alfa Aesar L16497
Glass microscope cover slips VWR 48404-455
Glass microscope slides VWR 160004-422
IPTG (isopropyl beta-D-1-thigalactopyranoside) Gold Bio 12481C100
Retangular non-treated single-well plate, 128x86mm Thermo-Fisher 242811
Sodium Azide, CAS #26628-22-8 Sigma-Aldrich S2002
Zeiss Axio Imager M2m microscope with AxioVision v4.8.2.0 software Zeiss unknown
Zeiss StemiSV11 M2 Bio Quad microscope Zeiss unknown
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wolff, S., Weissman, J. S., Dillin, A. Differential scales of protein quality control. Cell. 157 (1), 52-64 (2014).
  2. Labbadia, J., Morimoto, R. I. The biology of proteostasis in aging and disease. Annual Review of Biochemistry. 84, 435-464 (2015).
  3. Powers, E. T., Morimoto, R. I., Dillin, A., Kelly, J. W., Balch, W. E. Biological and chemical approaches to diseases of proteostasis deficiency. Annual Review of Biochemistry. 78, 959-991 (2009).
  4. Brehme, M., et al. A chaperome subnetwork safeguards proteostasis in aging and neurodegenerative disease. Cell Reports. 9 (3), 1135-1150 (2014).
  5. Sala, A. J., Bott, L. C., Morimoto, R. I. Shaping proteostasis at the cellular, tissue, and organismal level. Journal of Cell Biology. 216 (5), 1231-1241 (2017).
  6. Braak, H., Braak, E., Strothjohann, M. Abnormally phosphorylated tau protein related to the formation of neurofibrillary tangles and neuropil threads in the cerebral cortex of sheep and goat. Neuroscience Letters. 171 (1-2), 1-4 (1994).
  7. Poirier, M. A., Jiang, H., Ross, C. A. A structure-based analysis of huntingtin mutant polyglutamine aggregation and toxicity: evidence for a compact beta-sheet structure. Human Molecular Genetics. 14 (6), 765-774 (2005).
  8. Vilchez, D., Saez, I., Dillin, A. The role of protein clearance mechanisms in organismal ageing and age-related diseases. Nature Communications. 5, 5659 (2014).
  9. Eftekharzadeh, B., Hyman, B. T., Wegmann, S. Structural studies on the mechanism of protein aggregation in age related neurodegenerative diseases. Mechanisms of Ageing and Development. 156, 1-13 (2016).
  10. Pokrishevsky, E., Grad, L. I., Cashman, N. R. TDP-43 or FUS-induced misfolded human wild-type SOD1 can propagate intercellularly in a prion-like fashion. Scientific Reports. 6, 22155 (2016).
  11. Mukherjee, A., Morales-Scheihing, D., Butler, P. C., Soto, C. Type 2 diabetes as a protein misfolding disease. Trends in Molecular Medicine. 21 (7), 439-449 (2015).
  12. Sikkink, L. A., Ramirez-Alvarado, M. Biochemical and aggregation analysis of Bence Jones proteins from different light chain diseases. Amyloid. 15 (1), 29-39 (2008).
  13. Qu, B. H., Strickland, E., Thomas, P. J. Cystic fibrosis: a disease of altered protein folding. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 29 (5), 483-490 (1997).
  14. Qu, B. H., Strickland, E. H., Thomas, P. J. Localization and suppression of a kinetic defect in cystic fibrosis transmembrane conductance regulator folding. Journal of Biological Chemistry. 272 (25), 15739-15744 (1997).
  15. Brignull, H. R., Moore, F. E., Tang, S. J., Morimoto, R. I. Polyglutamine proteins at the pathogenic threshold display neuron-specific aggregation in a pan-neuronal Caenorhabditis elegans model. Journal of Neuroscience. 26 (29), 7597-7606 (2006).
  16. Gidalevitz, T., Ben-Zvi, A., Ho, K. H., Brignull, H. R., Morimoto, R. I. Progressive disruption of cellular protein folding in models of polyglutamine diseases. Science. 311 (5766), 1471-1474 (2006).
  17. Morimoto, R. I. Stress, aging, and neurodegenerative disease. New England Journal of Medicine. 355 (21), 2254-2255 (2006).
  18. Morimoto, R. I. Proteotoxic stress and inducible chaperone networks in neurodegenerative disease and aging. Genes & Development. 22 (11), 1427-1438 (2008).
  19. Walker, F. O. Huntington’s disease. Lancet. 369 (9557), 218-228 (2007).
  20. Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biology. 2 (1), 0002 (2001).
  21. Karady, I., et al. Using Caenorhabditis elegans as a model system to study protein homeostasis in a multicellular organism. Journal of Visualized Experiments. (82), e50840 (2013).
  22. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
  23. Cornwell, A. B., Llop, J. R., Salzman, P., Thakar, J., Samuelson, A. V. The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan. Journal of Visualized Experiments. (136), e57819 (2018).
  24. Angeli, S., et al. A DNA synthesis inhibitor is protective against proteotoxic stressors via modulation of fertility pathways in Caenorhabditis elegans. Aging (Albany NY). 5 (10), 759-769 (2013).
  25. Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset. PLoS One. 9 (1), 85964 (2014).
  26. Byerly, L., Cassada, R. C., Russell, R. L. The life cycle of the nematode Caenorhabditis elegans. I. Wild-type growth and reproduction. Developmental Biology. 51 (1), 23-33 (1976).
  27. Schemper, M. Cox Analysis of Survival Data with Non-Proportional Hazard Functions. Journal of the Royal Statistical Society. Series D (The Statistician). 41 (4), 455-465 (1992).
  28. Royston, P., Parmar, M. K. The use of restricted mean survival time to estimate the treatment effect in randomized clinical trials when the proportional hazards assumption is in doubt. Statistics in Medicine. 30 (19), 2409-2421 (2011).
  29. Campbell, I. Chi-squared and Fisher-Irwin tests of two-by-two tables with small sample recommendations. Statistics in Medicine. 26 (19), 3661-3675 (2007).
  30. Busing, F. M., Weaver, B., Dubois, S. 2 x 2 Tables: a note on Campbell’s recommendation. Statistics in Medicine. 35 (8), 1354-1358 (2016).
  31. Das, R., et al. The homeodomain-interacting protein kinase HPK-1 preserves protein homeostasis and longevity through master regulatory control of the HSF-1 chaperone network and TORC1-restricted autophagy in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 13 (10), 1007038 (2017).
  32. Garcia, S. M., Casanueva, M. O., Silva, M. C., Amaral, M. D., Morimoto, R. I. Neuronal signaling modulates protein homeostasis in Caenorhabditis elegans post-synaptic muscle cells. Genes & Development. 21 (22), 3006-3016 (2007).
  33. Morley, J. F., Brignull, H. R., Weyers, J. J., Morimoto, R. I. The threshold for polyglutamine-expansion protein aggregation and cellular toxicity is dynamic and influenced by aging in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (16), 10417-10422 (2002).
  34. Labbadia, J., Morimoto, R. I. Repression of the Heat Shock Response Is a Programmed Event at the Onset of Reproduction. Molecular Cell. 59 (4), 639-650 (2015).
  35. Shemesh, N., Shai, N., Ben-Zvi, A. Germline stem cell arrest inhibits the collapse of somatic proteostasis early in Caenorhabditis elegans adulthood. Aging Cell. 12 (5), 814-822 (2013).
  36. Ben-Zvi, A., Miller, E. A., Morimoto, R. I. Collapse of proteostasis represents an early molecular event in Caenorhabditis elegans aging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (35), 14914-14919 (2009).
  37. Walther, D. M., et al. Widespread Proteome Remodeling and Aggregation in Aging C. elegans. Cell. 161 (4), 919-932 (2015).
  38. Cohen, E., Bieschke, J., Perciavalle, R. M., Kelly, J. W., Dillin, A. Opposing activities protect against age-onset proteotoxicity. Science. 313 (5793), 1604-1610 (2006).
  39. Silva, M. C., et al. A genetic screening strategy identifies novel regulators of the proteostasis network. PLoS Genetics. 7 (12), 1002438 (2011).
  40. Zhang, L., Ward, J. D., Cheng, Z., Dernburg, A. F. The auxin-inducible degradation (AID) system enables versatile conditional protein depletion in C. elegans. Development. 142 (24), 4374-4384 (2015).
  41. Hansen, M., Hsu, A. L., Dillin, A., Kenyon, C. New genes tied to endocrine, metabolic, and dietary regulation of lifespan from a Caenorhabditis elegans genomic RNAi screen. PLoS Genetics. 1 (1), 119-128 (2005).
  42. Nollen, E. A., et al. Genome-wide RNA interference screen identifies previously undescribed regulators of polyglutamine aggregation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (17), 6403-6408 (2004).
  43. Samuelson, A. V., Carr, C. E., Ruvkun, G. Gene activities that mediate increased life span of C. elegans insulin-like signaling mutants. Genes & Development. 21 (22), 2976-2994 (2007).
  44. Johnson, D. W., et al. The Caenorhabditis elegans Myc-Mondo/Mad complexes integrate diverse longevity signals. PLoS Genetics. 10 (4), 1004278 (2014).
  45. Wang, Z., Sherwood, D. R. Dissection of genetic pathways in C. elegans. Methods in Cell Biology. 106, 113-157 (2011).
  46. Jorgensen, E. M., Mango, S. E. The art and design of genetic screens: caenorhabditis elegans. Nature Reviews Genetics. 3 (5), 356-369 (2002).

Tags

Keywords: ProteostasisCaenorhabditis ElegansPolyglutamine Fluorescent ReporterAgingProtein Misfolding DiseasesAlzheimer’sParkinson’sHuntington’s DiseaseAmyotrophic Lateral SclerosisRNAiOP50 E.coliHypochlorite TreatmentL1 Animals
check_url/61100?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Lazaro-Pena, M. I., Cornwell, A. B., Samuelson, A. V. Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (175), e61100, doi:10.3791/61100 (2021).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image