Quantificazione del declino proteostatico tessuto-specifico nella Caenorhabditis elegans
Summary
Il declino proteostatico è un segno distintivo dell’invecchiamento, facilitando l’insorgenza di malattie neurodegenerative. Delineiamo un protocollo per misurare in modo quantificabile la proteostasi in due diversi tessuti di Caenorhabditis elegans attraverso l’espressione eterologa di ripetizioni di poliglutamina fuse a un reporter fluorescente. Questo modello consente una rapida analisi genetica in vivo della proteostasi.
Abstract
La capacità di mantenere il corretto funzionamento e il ripiegamento del proteoma (omeostasi proteica) diminuisce durante il normale invecchiamento, facilitando l’insorgenza di un numero crescente di malattie associate all’età. Ad esempio, le proteine con espansioni di poliglutamina sono inclini all’aggregazione, come esemplificato con la proteina huntingtina e l’insorgenza concomitante della malattia di Huntington. Il deterioramento associato all’età del proteoma è stato ampiamente studiato attraverso l’uso di Caenorhabditis elegans transgenici che esprimono ripetizioni polyQ fuse a una proteina fluorescente gialla (YFP). Questo modello animale transgenico polyQ::YFP facilita la quantificazione diretta del declino del proteoma associato all’età attraverso l’imaging della progressiva formazione di focolai fluorescenti (cioè aggregati proteici) e la successiva insorgenza di difetti di locomozione che si sviluppano a seguito del collasso del proteoma. Inoltre, l’espressione del transgene polyQ::YFP può essere guidata da promotori tessuto-specifici, consentendo la valutazione della proteostasi tra i tessuti nel contesto di un organismo multicellulare intatto. Questo modello è altamente suscettibile di analisi genetica, fornendo così un approccio per quantificare l’invecchiamento che è complementare ai saggi della durata della vita. Descriviamo come misurare con precisione la formazione di focolai polyQ::YFP all’interno dei neuroni o del muscolo della parete corporea durante l’invecchiamento e la successiva insorgenza di difetti comportamentali. Successivamente, evidenziamo come questi approcci possono essere adattati per una maggiore produttività e potenziali applicazioni future utilizzando altre strategie emergenti per l’analisi genetica di C. elegans.
Introduction
L’omeostasi proteica (proteostasi) è definita come la capacità cellulare di mantenere il corretto funzionamento e il ripiegamento del proteoma. La sfida intrinseca alla proteostasi è garantire che tutte le proteine siano correttamente ripiegate e mantenute in una conformazione nativa, che è ulteriormente amplificata dalla varia natura delle dimensioni delle proteine, dalla composizione degli amminoacidi, dalla conformazione strutturale, dalla stabilità, dal turnover, dall’espressione, dalla compartimentazione subcellulare e dalle modifiche1. La proteostasi viene mantenuta attraverso l’azione coordinata di una grande rete proteostatica, costituita da circa 2000 proteine uniche, che regolano la corretta sintesi, ripiegamento, traffico e degradazione all’interno del proteoma2,3. I componenti cavallo di battaglia della rete proteostatica sono nove famiglie principali di chaperoni molecolari4. Ogni tessuto e tipo di cellula utilizza preferenzialmente sottoinsiemi specifici di chaperoni molecolari, presumibilmente in linea con le diverse esigenze di proteomi distinti5.
Un segno distintivo del normale invecchiamento dell’organismo è il progressivo declino e collasso della proteostasi cellulare, che si ritiene sia una base di base per l’insorgenza e la progressione di un numero crescente di malattie associate all’età. Ad esempio, il morbo di Alzheimer, il morbo di Parkinson, la malattia di Huntington e la sclerosi laterale amiotrofica (SLA) condividono una caratteristica comune: in ogni caso la manifestazione della neurodegenerazione è guidata da alterazioni genetiche che predispongono all’aggregazione una proteina mutante (amiloide-β/Tau, α-sinucleina, HTT, FUS/TBD-43/SOD-1, rispettivamente)6,7,8,9,10 . Durante l’invecchiamento, l’integrità e l’inducibilità della rete proteostatica diminuisce, il che si traduce nell’accumulo di aggregati proteotossici che provocano disfunzione cellulare e neurodegenerazione. Da notare, le malattie conformazionali proteiche non sono uniche per i neuroni e si verificano su più tessuti, come evidenziato dal diabete di tipo II, dal mieloma multiplo e dalla fibrosi cistica11,12,13,14. Pertanto, chiarire meccanismi in grado di preservare la proteostasi faciliterà lo sviluppo di interventi mirati per il trattamento della malattia e per promuovere un invecchiamento sano.
Il piccolo nematode del suolo Caenorhabditis elegans (C. elegans) è stato determinante nella scoperta di geni e nel chiarire i percorsi che alterano la proteostasi. Molti componenti della rete proteostatica e le vie di trasduzione del segnale che regolano la proteostasi sono evolutivamente conservati. Inoltre, C. elegans ha ridotto la complessità e la ridondanza rispetto ai sistemi di vertebrati, rendendolo più suscettibile all’analisi genetica e alla scoperta di geni. Ulteriori vantaggi di C. elegans che hanno portato ad essere ampiamente utilizzato come sistema modello per studiare la proteostasi includono: potente genomica genetica e funzionale, un breve ciclo di vita (3 giorni) e durata della vita (3 settimane), un genoma compatto e ben annotato, la disponibilità di un vasto assortimento di mutanti genetici e la facilità di visualizzare i cambiamenti specifici del tessuto nella biologia cellulare utilizzando reporter fluorescenti.
Il progressivo decadimento della proteostasi durante l’invecchiamento può essere facilmente quantificato in C. elegans. Il laboratorio di Morimoto ha dimostrato per la prima volta che un’espansione di poliglutamina fusa in proteina fluorescente gialla(polyQ::YFP)potrebbe essere utilizzata per quantificare il declino proteostatico di C. elegans durante l’invecchiamento15,16,17,18. Le fusioni YFP a 35 ripetizioni di glutammina o più provocano una formazione associata all’età di focolai fluorescenti insieme a segni di patologia cellulare. Da notare, questa gamma di espansione della glutammina rispecchia la lunghezza del tratto poliglutamminico della proteina Huntingtina a cui la patologia della Malattia di Huntington inizia ad essere osservata negli esseri umani (tipicamente >35 ripetizioni CAG)19. Ceppi con espressione di polyQ::YFP all’interno di cellule muscolari, intestinali o neuronali sono stati utilizzati per confermare che il declino associato all’età della proteostasi si verifica in diversi tipi di cellule e tessuti. L’espressione poliQ::YFP muscolo-specifica (cioè unc-54p::Q35::YFP)è stata la reporter tessuto-specifica più utilizzata, poiché l’accumulo di focolai fluorescenti è facile da quantificare nei primi giorni dell’età adulta utilizzando un semplice microscopio fluorescente sezionante (Figura 1A-1B). Inoltre, gli animali diventano paralizzati durante la mezza età, poiché il proteoma all’interno del muscolo collassa a causa dell’effetto proteotossico del reporter (Figura 1C). Allo stesso modo, il declino associato all’età della proteostasi neuronale può essere seguito (rgef-1p::Q40::YFP) quantificando direttamente la formazione di focolai/aggregati e il declino associato all’età nelle curve coordinate del corpo dopo aver messo gli animali in liquido (Figura 2).
Qui, presentiamo un protocollo dettagliato su come misurare la progressione dipendente dall’età dell’accumulo di aggregati proteici e la proteotossicità associata indotta dall’espressione di ripetizioni di poliglutamina all’interno del tessuto neuronale e muscolare in C. elegans. Forniamo esempi di risultati tipici generati utilizzando questi ceppi e metodi. Inoltre, mostriamo come abbiamo utilizzato questi metodi per studiare la regolazione trascrizionale della rete proteostatica. Discutiamo di ulteriori modi in cui questi reporter possono essere facilmente integrati con altri reagenti esistenti o adattati per schermi più grandi.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’invecchiamento è caratterizzato da un graduale declino della proteostasi. La proteostasi è mantenuta da un sistema complesso, la rete proteostatica, per il controllo coordinato, dinamico e sensibile allo stress del ripiegamento, della degradazione e della traduzione delle proteine. Il motivo per cui la proteostasi fallisce nel corso dell’invecchiamento è poco compreso, ma un epigenoma in decomposizione, una diminuzione dell’inducibilità delle risposte allo stress e la perdita di crosstalk compensatorio coincidono t…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare i membri passati e presenti del laboratorio Samuelson per la loro assistenza nel perfezionamento di questo metodo e / o discussione che ha aiutato lo sviluppo di questo manoscritto. La ricerca riportata in questa pubblicazione è stata supportata dal National Institute on Aging del National Institutes of Health con i numeri di premio RF1AG062593 e R21AG064519. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali del National Institutes of Health. I finanziatori non hanno avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio, nella raccolta e nell’analisi dei dati, nella decisione di pubblicare o nella preparazione del manoscritto.
Materials
| 24 Well Culture Plates | Greiner Bio-One | #662102 | |
| 2 mL 96-well plates | Greiner Bio-One | #780286 | |
| 600 µL 96-well plates | Greiner Bio-One | #786261 | |
| 96-pin plate replicator | Nunc | 250520 | |
| Air-permeable plate seal | VWR | 60941-086 | |
| bacteriological agar | Affymetrix/USB | 10906 | |
| bacto-peptone | VWR | 90000-368 | |
| C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Ahringer | Source Bioscience | C. elegans RNAi Collection (Ahringer) | See also Kamath et. al, Nature 2003. |
| C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Vidal | Source Bioscience | C. elegans ORF-RNAi Resource (Vidal) | See also Rual et. al, Genome Research 2004. This library is also available from Dharmacon. |
| FuDR (5-Fluoro-2'-deoxyuridine) | Alfa Aesar | L16497 | |
| Glass microscope cover slips | VWR | 48404-455 | |
| Glass microscope slides | VWR | 160004-422 | |
| IPTG (isopropyl beta-D-1-thigalactopyranoside) | Gold Bio | 12481C100 | |
| Retangular non-treated single-well plate, 128x86mm | Thermo-Fisher | 242811 | |
| Sodium Azide, CAS #26628-22-8 | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Zeiss Axio Imager M2m microscope with AxioVision v4.8.2.0 software | Zeiss | unknown | |
| Zeiss StemiSV11 M2 Bio Quad microscope | Zeiss | unknown |
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