Quantifizierung des gewebespezifischen proteostatischen Rückgangs bei Caenorhabditis elegans
Summary
Der proteostatische Rückgang ist ein Kennzeichen des Alterns und erleichtert das Auftreten neurodegenerativer Erkrankungen. Wir skizzieren ein Protokoll zur quantifizierbaren Messung der Proteostase in zwei verschiedenen Caenorhabditis elegans-Geweben durch heterologe Expression von Polyglutamin-Wiederholungen, die mit einem fluoreszierenden Reporter verschmolzen sind. Dieses Modell ermöglicht eine schnelle genetische In-vivo-Analyse der Proteostase.
Abstract
Die Fähigkeit, die richtige Funktion und Faltung des Proteoms (Proteinhomöostase) aufrechtzuerhalten, nimmt während des normalen Alterns ab, was das Auftreten einer wachsenden Anzahl altersbedingter Krankheiten erleichtert. Zum Beispiel sind Proteine mit Polyglutamin-Expansionen anfällig für Aggregation, wie das Huntingtin-Protein und der gleichzeitige Ausbruch der Huntington-Krankheit zeigen. Die altersbedingte Verschlechterung des Proteoms wurde umfassend durch die Verwendung von transgenen Caenorhabditis elegans untersucht, die PolyQ-Wiederholungen exprimieren, die mit einem gelb fluoreszierenden Protein (YFP) verschmolzen sind. Dieses transgene PolyQ::YFP-Tiermodell ermöglicht die direkte Quantifizierung des altersbedingten Rückgangs des Proteoms durch Abbildung der fortschreitenden Bildung von Fluoreszenzherden (d.h. Proteinaggregaten) und des anschließenden Auftretens von Fortbewegungsdefekten, die sich als Folge des Zusammenbruchs des Proteoms entwickeln. Darüber hinaus kann die Expression des polyQ::YFP-Transgens durch gewebespezifische Promotoren gesteuert werden, was die Beurteilung der Proteostase über Gewebe hinweg im Kontext eines intakten mehrzelligen Organismus ermöglicht. Dieses Modell ist für die genetische Analyse sehr gut geeignet und bietet somit einen Ansatz zur Quantifizierung des Alterns, der die Lebensdauerassays ergänzt. Wir beschreiben, wie die Bildung von PolyQ::YFP-Herden in Neuronen oder Körperwandmuskeln während des Alterns und das anschließende Auftreten von Verhaltensdefekten genau gemessen werden kann. Als nächstes zeigen wir auf, wie diese Ansätze für einen höheren Durchsatz und mögliche zukünftige Anwendungen mit anderen aufkommenden Strategien für die genetische Analyse von C. elegans angepasst werden können.
Introduction
Proteinhomöostase (Proteostase) ist definiert als die zelluläre Fähigkeit, die richtige Funktion und Faltung des Proteoms aufrechtzuerhalten. Die inhärente Herausforderung für die Proteostase besteht darin, sicherzustellen, dass alle Proteine ordnungsgemäß gefaltet und in einer nativen Konformation gehalten werden, die durch die vielfältige Natur der Proteingröße, der Aminosäurezusammensetzung, der strukturellen Konformation, der Stabilität, des Umsatzes, der Expression, der subzellulären Kompartimentierung und der Modifikationen weiter verstärkt wird1. Die Proteostase wird durch die koordinierte Wirkung eines großen proteostatischen Netzwerks aufrechterhalten, das aus etwa 2000 einzigartigen Proteinen besteht, die die ordnungsgemäße Synthese, Faltung, den Transport und den Abbau innerhalb des Proteoms regulieren2,3. Die Arbeitspferdkomponenten des proteostatischen Netzwerks sind neun Hauptfamilien molekularer Chaperone4. Jeder Gewebe- und Zelltyp verwendet bevorzugt spezifische Untergruppen molekularer Chaperone, vermutlich in Übereinstimmung mit den unterschiedlichen Anforderungen verschiedener Proteome5.
Ein Kennzeichen der normalen organismischen Alterung ist der fortschreitende Rückgang und Zusammenbruch der zellulären Proteostase, von der angenommen wird, dass sie eine zugrunde liegende Grundlage für den Beginn und das Fortschreiten einer wachsenden Anzahl altersbedingter Krankheiten ist. Zum Beispiel haben Alzheimer-Krankheit, Parkinson-Krankheit, Huntington-Krankheit und Amyotrophe Lateralsklerose (ALS) ein gemeinsames Merkmal: In jedem Fall wird die Manifestation der Neurodegeneration durch genetische Veränderungen angetrieben, die ein mutiertes Protein für die Aggregation prädisponieren (Amyloid-β / Tau, α-Synuclein, HTT, FUS / TBD-43 / SOD-1)6,7,8,9,10 . Während des Alterns nimmt die Integrität und Induzierbarkeit des proteostatischen Netzwerks ab, was zur Anhäufung von proteotoxischen Aggregaten führt, die zu zellulärer Dysfunktion und Neurodegeneration führen. Bemerkenswert ist, dass Protein-Konformationskrankheiten nicht nur auf Neuronen beschränkt sind und in mehreren Geweben auftreten, wie Typ-II-Diabetes, multiples Myelom und Mukoviszidose11,12,13,14. Daher wird die Aufklärung von Mechanismen, die in der Lage sind, die Proteostase zu erhalten, die Entwicklung gezielter Interventionen zur Behandlung von Krankheiten und zur Förderung eines gesunden Alterns erleichtern.
Der kleine Bodennematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) war maßgeblich an der Entdeckung von Genen und der Aufklärung von Signalwegen beteiligt, die die Proteostase verändern. Viele Komponenten des proteostatischen Netzwerks und der Signaltransduktionswege, die die Proteostase regulieren, sind evolutionär konserviert. Darüber hinaus hat C. elegans die Komplexität und Redundanz im Vergleich zu Wirbeltiersystemen reduziert, was es für die genetische Analyse und Genentdeckung zugänglicher macht. Weitere Vorteile von C. elegans, die dazu geführt haben, dass es als Modellsystem zur Untersuchung der Proteostase weit verbreitet ist, sind: leistungsstarke genetische und funktionelle Genomik, ein kurzer Lebenszyklus (3 Tage) und eine kurze Lebensdauer (3 Wochen), ein kompaktes und gut annotiertes Genom, die Verfügbarkeit einer breiten Palette genetischer Mutanten und die einfache Visualisierung gewebespezifischer Veränderungen in der Zellbiologie mit fluoreszierenden Reportern.
Der fortschreitende Zerfall der Proteostase während des Alterns kann leicht in C. elegans quantifiziert werden. Das Morimoto-Labor zeigte zunächst, dass eine Polyglutaminexpansion, die mit gelb fluoreszierendem Protein (polyQ::YFP) verschmolzen ist, zur Quantifizierung des proteostatischen Rückgangs von C. elegans während des Alterns verwendet werden kann15,16,17,18. YFP-Fusionen zu 35 Glutamin-Wiederholungen oder mehr führen zu einer altersbedingten Bildung von Fluoreszenzherden zusammen mit Anzeichen einer zellulären Pathologie. Bemerkenswert ist, dass dieser Bereich der Glutaminexpansion die Länge des Polyglutamintraktes des Huntingtin-Proteins widerspiegelt, bei dem die Pathologie der Huntington-Krankheit beim Menschen beobachtet wird (typischerweise >35 CAG-Wiederholungen)19. Stämme mit Expression von polyQ::YFP in Muskel-, Darm- oder neuronalen Zellen wurden verwendet, um zu bestätigen, dass der altersbedingte Rückgang der Proteostase über verschiedene Zell- und Gewebetypen hinweg auftritt. Die muskelspezifische PolyQ::YFP-Expression (d.h. unc-54p::Q35::YFP)war der am weitesten verbreitete gewebespezifische Reporter, da akkumulierende fluoreszierende Herde in den ersten Tagen des Erwachsenenalters mit einem einfachen fluoreszierenden Seziermikroskop leicht zu quantifizieren sind (Abbildung 1A-1B). Zusätzlich werden Tiere in der Lebensmitte gelähmt, da das Proteom im Muskel aufgrund der proteotoxischen Wirkung des Reporters kollabiert (Abbildung 1C). In ähnlicher Weise kann der altersbedingte Rückgang der neuronalen Proteostase (rgef-1p::Q40::YFP) durch direkte Quantifizierung der Herde/Aggregatbildung und altersassoziierter Rückgänge in koordinierten Körperbeugen nach dem Einbringen von Tieren in Flüssigkeit verfolgt werden (Abbildung 2).
Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll vor, wie das altersabhängige Fortschreiten der Proteinaggregatakkumulation und die damit verbundene Proteotoxizität, die durch die Expression von Polyglutamin-Wiederholungen in neuronalem und Muskelgewebe in C. elegansinduziert wird, gemessen werden kann. Wir liefern Beispiele für typische Ergebnisse, die mit diesen Stämmen und Methoden generiert werden. Darüber hinaus zeigen wir, wie wir diese Methoden verwendet haben, um die transkriptionelle Regulation des proteostatischen Netzwerks zu untersuchen. Wir besprechen zusätzliche Möglichkeiten, wie diese Reporter einfach in andere vorhandene Reagenzien integriert oder für größere Bildschirme angepasst werden können.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das Altern ist durch einen allmählichen Rückgang der Proteostase gekennzeichnet. Die Proteostase wird durch ein komplexes System, das proteostatische Netzwerk, zur koordinierten, dynamischen, stressreaktionsschnellen Steuerung von Proteinfaltung, -abbau und -translation aufrechterhalten. Warum die Proteostase im Laufe des Alterns versagt, ist kaum verstanden, aber ein zerfallendes Epigenom, eine abnehmende Induzierbarkeit von Stressreaktionen und der Verlust von kompensatorischem Crosstalk fallen alle mit diesem Zusamm…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir möchten den ehemaligen und gegenwärtigen Mitgliedern des Samuelson-Labors für ihre Unterstützung bei der Verfeinerung dieser Methode und/oder Diskussion danken, die die Entwicklung dieses Manuskripts unterstützt hat. Die in dieser Publikation berichtete Forschung wurde vom National Institute on Aging der National Institutes of Health unter den Award-Nummern RF1AG062593 und R21AG064519 unterstützt. Der Inhalt liegt in der alleinigen Verantwortung der Autoren und stellt nicht unbedingt die offiziellen Ansichten der National Institutes of Health dar. Die Geldgeber spielten keine Rolle beim Studiendesign, der Datenerhebung und -analyse, der Entscheidung zur Veröffentlichung oder der Vorbereitung des Manuskripts.
Materials
| 24 Well Culture Plates | Greiner Bio-One | #662102 | |
| 2 mL 96-well plates | Greiner Bio-One | #780286 | |
| 600 µL 96-well plates | Greiner Bio-One | #786261 | |
| 96-pin plate replicator | Nunc | 250520 | |
| Air-permeable plate seal | VWR | 60941-086 | |
| bacteriological agar | Affymetrix/USB | 10906 | |
| bacto-peptone | VWR | 90000-368 | |
| C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Ahringer | Source Bioscience | C. elegans RNAi Collection (Ahringer) | See also Kamath et. al, Nature 2003. |
| C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Vidal | Source Bioscience | C. elegans ORF-RNAi Resource (Vidal) | See also Rual et. al, Genome Research 2004. This library is also available from Dharmacon. |
| FuDR (5-Fluoro-2'-deoxyuridine) | Alfa Aesar | L16497 | |
| Glass microscope cover slips | VWR | 48404-455 | |
| Glass microscope slides | VWR | 160004-422 | |
| IPTG (isopropyl beta-D-1-thigalactopyranoside) | Gold Bio | 12481C100 | |
| Retangular non-treated single-well plate, 128x86mm | Thermo-Fisher | 242811 | |
| Sodium Azide, CAS #26628-22-8 | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Zeiss Axio Imager M2m microscope with AxioVision v4.8.2.0 software | Zeiss | unknown | |
| Zeiss StemiSV11 M2 Bio Quad microscope | Zeiss | unknown |
References
- Wolff, S., Weissman, J. S., Dillin, A. Differential scales of protein quality control. Cell. 157 (1), 52-64 (2014).
- Labbadia, J., Morimoto, R. I. The biology of proteostasis in aging and disease. Annual Review of Biochemistry. 84, 435-464 (2015).
- Powers, E. T., Morimoto, R. I., Dillin, A., Kelly, J. W., Balch, W. E. Biological and chemical approaches to diseases of proteostasis deficiency. Annual Review of Biochemistry. 78, 959-991 (2009).
- Brehme, M., et al. A chaperome subnetwork safeguards proteostasis in aging and neurodegenerative disease. Cell Reports. 9 (3), 1135-1150 (2014).
- Sala, A. J., Bott, L. C., Morimoto, R. I. Shaping proteostasis at the cellular, tissue, and organismal level. Journal of Cell Biology. 216 (5), 1231-1241 (2017).
- Braak, H., Braak, E., Strothjohann, M. Abnormally phosphorylated tau protein related to the formation of neurofibrillary tangles and neuropil threads in the cerebral cortex of sheep and goat. Neuroscience Letters. 171 (1-2), 1-4 (1994).
- Poirier, M. A., Jiang, H., Ross, C. A. A structure-based analysis of huntingtin mutant polyglutamine aggregation and toxicity: evidence for a compact beta-sheet structure. Human Molecular Genetics. 14 (6), 765-774 (2005).
- Vilchez, D., Saez, I., Dillin, A. The role of protein clearance mechanisms in organismal ageing and age-related diseases. Nature Communications. 5, 5659 (2014).
- Eftekharzadeh, B., Hyman, B. T., Wegmann, S. Structural studies on the mechanism of protein aggregation in age related neurodegenerative diseases. Mechanisms of Ageing and Development. 156, 1-13 (2016).
- Pokrishevsky, E., Grad, L. I., Cashman, N. R. TDP-43 or FUS-induced misfolded human wild-type SOD1 can propagate intercellularly in a prion-like fashion. Scientific Reports. 6, 22155 (2016).
- Mukherjee, A., Morales-Scheihing, D., Butler, P. C., Soto, C. Type 2 diabetes as a protein misfolding disease. Trends in Molecular Medicine. 21 (7), 439-449 (2015).
- Sikkink, L. A., Ramirez-Alvarado, M. Biochemical and aggregation analysis of Bence Jones proteins from different light chain diseases. Amyloid. 15 (1), 29-39 (2008).
- Qu, B. H., Strickland, E., Thomas, P. J. Cystic fibrosis: a disease of altered protein folding. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 29 (5), 483-490 (1997).
- Qu, B. H., Strickland, E. H., Thomas, P. J. Localization and suppression of a kinetic defect in cystic fibrosis transmembrane conductance regulator folding. Journal of Biological Chemistry. 272 (25), 15739-15744 (1997).
- Brignull, H. R., Moore, F. E., Tang, S. J., Morimoto, R. I. Polyglutamine proteins at the pathogenic threshold display neuron-specific aggregation in a pan-neuronal Caenorhabditis elegans model. Journal of Neuroscience. 26 (29), 7597-7606 (2006).
- Gidalevitz, T., Ben-Zvi, A., Ho, K. H., Brignull, H. R., Morimoto, R. I. Progressive disruption of cellular protein folding in models of polyglutamine diseases. Science. 311 (5766), 1471-1474 (2006).
- Morimoto, R. I. Stress, aging, and neurodegenerative disease. New England Journal of Medicine. 355 (21), 2254-2255 (2006).
- Morimoto, R. I. Proteotoxic stress and inducible chaperone networks in neurodegenerative disease and aging. Genes & Development. 22 (11), 1427-1438 (2008).
- Walker, F. O. Huntington’s disease. Lancet. 369 (9557), 218-228 (2007).
- Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biology. 2 (1), 0002 (2001).
- Karady, I., et al. Using Caenorhabditis elegans as a model system to study protein homeostasis in a multicellular organism. Journal of Visualized Experiments. (82), e50840 (2013).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
- Cornwell, A. B., Llop, J. R., Salzman, P., Thakar, J., Samuelson, A. V. The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan. Journal of Visualized Experiments. (136), e57819 (2018).
- Angeli, S., et al. A DNA synthesis inhibitor is protective against proteotoxic stressors via modulation of fertility pathways in Caenorhabditis elegans. Aging (Albany NY). 5 (10), 759-769 (2013).
- Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset. PLoS One. 9 (1), 85964 (2014).
- Byerly, L., Cassada, R. C., Russell, R. L. The life cycle of the nematode Caenorhabditis elegans. I. Wild-type growth and reproduction. Developmental Biology. 51 (1), 23-33 (1976).
- Schemper, M. Cox Analysis of Survival Data with Non-Proportional Hazard Functions. Journal of the Royal Statistical Society. Series D (The Statistician). 41 (4), 455-465 (1992).
- Royston, P., Parmar, M. K. The use of restricted mean survival time to estimate the treatment effect in randomized clinical trials when the proportional hazards assumption is in doubt. Statistics in Medicine. 30 (19), 2409-2421 (2011).
- Campbell, I. Chi-squared and Fisher-Irwin tests of two-by-two tables with small sample recommendations. Statistics in Medicine. 26 (19), 3661-3675 (2007).
- Busing, F. M., Weaver, B., Dubois, S. 2 x 2 Tables: a note on Campbell’s recommendation. Statistics in Medicine. 35 (8), 1354-1358 (2016).
- Das, R., et al. The homeodomain-interacting protein kinase HPK-1 preserves protein homeostasis and longevity through master regulatory control of the HSF-1 chaperone network and TORC1-restricted autophagy in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 13 (10), 1007038 (2017).
- Garcia, S. M., Casanueva, M. O., Silva, M. C., Amaral, M. D., Morimoto, R. I. Neuronal signaling modulates protein homeostasis in Caenorhabditis elegans post-synaptic muscle cells. Genes & Development. 21 (22), 3006-3016 (2007).
- Morley, J. F., Brignull, H. R., Weyers, J. J., Morimoto, R. I. The threshold for polyglutamine-expansion protein aggregation and cellular toxicity is dynamic and influenced by aging in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (16), 10417-10422 (2002).
- Labbadia, J., Morimoto, R. I. Repression of the Heat Shock Response Is a Programmed Event at the Onset of Reproduction. Molecular Cell. 59 (4), 639-650 (2015).
- Shemesh, N., Shai, N., Ben-Zvi, A. Germline stem cell arrest inhibits the collapse of somatic proteostasis early in Caenorhabditis elegans adulthood. Aging Cell. 12 (5), 814-822 (2013).
- Ben-Zvi, A., Miller, E. A., Morimoto, R. I. Collapse of proteostasis represents an early molecular event in Caenorhabditis elegans aging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (35), 14914-14919 (2009).
- Walther, D. M., et al. Widespread Proteome Remodeling and Aggregation in Aging C. elegans. Cell. 161 (4), 919-932 (2015).
- Cohen, E., Bieschke, J., Perciavalle, R. M., Kelly, J. W., Dillin, A. Opposing activities protect against age-onset proteotoxicity. Science. 313 (5793), 1604-1610 (2006).
- Silva, M. C., et al. A genetic screening strategy identifies novel regulators of the proteostasis network. PLoS Genetics. 7 (12), 1002438 (2011).
- Zhang, L., Ward, J. D., Cheng, Z., Dernburg, A. F. The auxin-inducible degradation (AID) system enables versatile conditional protein depletion in C. elegans. Development. 142 (24), 4374-4384 (2015).
- Hansen, M., Hsu, A. L., Dillin, A., Kenyon, C. New genes tied to endocrine, metabolic, and dietary regulation of lifespan from a Caenorhabditis elegans genomic RNAi screen. PLoS Genetics. 1 (1), 119-128 (2005).
- Nollen, E. A., et al. Genome-wide RNA interference screen identifies previously undescribed regulators of polyglutamine aggregation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (17), 6403-6408 (2004).
- Samuelson, A. V., Carr, C. E., Ruvkun, G. Gene activities that mediate increased life span of C. elegans insulin-like signaling mutants. Genes & Development. 21 (22), 2976-2994 (2007).
- Johnson, D. W., et al. The Caenorhabditis elegans Myc-Mondo/Mad complexes integrate diverse longevity signals. PLoS Genetics. 10 (4), 1004278 (2014).
- Wang, Z., Sherwood, D. R. Dissection of genetic pathways in C. elegans. Methods in Cell Biology. 106, 113-157 (2011).
- Jorgensen, E. M., Mango, S. E. The art and design of genetic screens: caenorhabditis elegans. Nature Reviews Genetics. 3 (5), 356-369 (2002).
