Summary
والهدف من هذا البروتوكول هو حقن رودامين مترافقة في شكل اجناة دوزوفيليا وصورة إيننويا actin قضبان الجمعية بعد الإجهاد الحراري.
Abstract
الغرض من هذا البروتوكول هو تصور قضبان actin داخل النواة التي تجمع في الأجنة الزهرية الميلانوغاستر الحية بعد الإجهاد الحراري. قضبان Actin هي السمة المميزة لاستجابة الإجهاد Actin المحفوظة وغير القابلة للانكولوجيا (ASR) التي ترافق الأمراض البشرية ، بما في ذلك الأمراض العصبية. في السابق، أظهرنا أن ASR يساهم في فشل التشكلات المُرفَضة وتقليل قدرة الأجنة النامية على البقاء. يسمح هذا البروتوكول بالدراسة المستمرة للآليات الكامنة في تجميع القضيب ACTIN و ASR في نظام نموذجي قابل للغاية للتصوير وعلم الوراثة والكيمياء الحيوية. يتم جمع الأجنة وتركيبها على غطاء لإعدادها للحقن. يتم تخفيف رودامين مترافقة غلوبال أكتين (G-actinالأحمر)وتحميلها في microneedle. يتم إجراء حقنة واحدة في مركز كل جنين. بعد الحقن ، يتم احتضان الأجنة في درجة حرارة مرتفعة ويتم تصور قضبان actin داخل النواة عن طريق المجهر confocal. ويمكن إجراء عملية استعادة الفلوريسنس بعد تجارب التحسس الضوئي (FRAP) على قضبان أكتين؛ ويمكن أيضا أن تكون صورت غيرها من الهياكل أكتين الغنية في السيتوبلازم. نجد أن G-actinRedizes مثل G-actin الذاتية ولا تتداخل، من تلقاء نفسها، مع تطور الجنين الطبيعي. أحد القيود المفروضة على هذا البروتوكول هو أنه يجب توخي الحذر أثناء الحقن لتجنب الإصابة الخطيرة بالجنين. ومع ذلك، مع الممارسة، حقن G-actinالأحمر في الأجنة Drosophila هو وسيلة سريعة وموثوق بها لتصور قضبان actin ويمكن بسهولة أن تستخدم مع الذباب من أي نوع جيني أو مع إدخال ضغوط الخلوية الأخرى، بما في ذلك نقص الأكسجة والأكسدة.
Introduction
يصف هذا البروتوكول كيفية حقن G-actinRed لتصور تجميع قضبان actin داخل النواة في الأجنة التي تعاني من الإجهاد الحراري التي تخضع لاستجابة الإجهاد Actin غير القابلة للتحميل (ASR)1. وضعنا هذا البروتوكول لمساعدة الدراسات من ASR، والتي في الأجنة يؤدي إلى انقطاع morphogenesis وانخفاض الجدوى، وفي أنواع الخلايا البشرية الكبار يرتبط مع الأمراض بما في ذلك الفشل الكلوي2, اعتلالات العضلات3, ومرض الزهايمر وهنتنغتون4,5,6,7,8. هذا ASR هو الناجم عن العديد من الضغوط الخلوية، بما في ذلك الصدمة الحرارية9،10،11، الإجهاد التأكسي4،6، انخفاض ATP التوليف12، وغير طبيعي Huntingtin أو β-amyloid oligomerization4،5،6،7،9،13،14،16. السمة المميزة لـ ASR هي تجميع قضبان actin الشاذة في إما السيتوبلازم أو نواة الخلايا المصابة ، والتي تحركها فرط النشاط الناجم عن الإجهاد من بروتين التفاعل actin ، Cofilin1،5،6،10. ولسوء الحظ، لا تزال هناك فجوات معرفية رئيسية فيما يتعلق بـ ASR. على سبيل المثال، وظيفة قضبان actin غير معروف. نحن لا نفهم لماذا قضبان تشكل في السيتوبلازم لبعض أنواع الخلايا، ولكن نواة الآخرين. كما أنه ليس من الواضح ما إذا كان ASR وقائيًا أو غير مُبطِل للخلايا أو الأجنة التي تخضع للإجهاد. وأخيرا، ما زلنا لا نعرف الآليات التفصيلية الكامنة في Cofilin فرط التنشيط أو actin قضبان الجمعية. وهكذا، يوفر هذا البروتوكول فحص سريع ومتعدد الاستخدامات للتحقيق في ASR عن طريق تصور تشكيل قضيب actin وديناميكية في النظام التجريبي القابلة للتصرّف للغاية من جنين ذبابة الفاكهة الحية.
تم تطوير بروتوكول microinject G-actinRed في أجنة دروسوفيليا الحية في البداية لدراسة ديناميات هياكل cytoplasmic الطبيعية17 خلال أحداث بناء الأنسجة. في تلك الدراسات، وجدنا أنحقنة G-actin Red لم تؤثر سلبًا على عمليات النمو المبكرة في الجنين، بما في ذلك تحلل السيتوكينات أو17،18. ثم قمنا بتعديل البروتوكول ، وتكييف معالجة الجنين وحقن G-actinRed للسماح بتصوير قضبان actin في الأجنة المجهدة الحرارية التي تخضع لـ ASR1. يمكن استخدام طرق أخرى إلى جانب حقن G-actinRed لتصور actin في الأجنة. هذه الأساليب تعتمد على التعبير عن البروتينات الفلورية (FPs) الموسومة إلى actin أو إلى مجالات البروتينات الملزمة actin ، مثل Utrophin- mCherry ، Lifeact ، F-tractin -GFP ، وMoesin -GFP (استعرضت في19). ومع ذلك، فإن استخدام هذه المسابير FP يتطلب الحذر لأنها يمكن أن تستقر أو تعطل بعض الهياكل actin، لا تسمية على قدم المساواة جميع الهياكل actin20، وفي حالة actin-GFP، هي مفرطة جدا - إشكالية لتحليل الجمعية قضيب الذي لا يقتصر على الإجهاد تعتمد ولكن أيضا actin التركيز تعتمد1. وهكذا، G-actinالأحمر هو المسبار المفضل لدراسات قضيب في الأجنة تطير، وحجم كبير من الجنين يسمح حقنه سهلة.
سير عمل هذا البروتوكول مشابه لتقنيات الحقن المجهرية الأخرى الراسخة التي استخدمت لحقن البروتينات والأحماض النووية والعقاقير والمؤشرات الفلورية في الأجنة الدروسوفيا 21،22،23،24،25،26،27. ومع ذلك، بعد الحقن المجهري من G-actinالأحمر هنا، والأجنة تتعرض لضغوط الحرارة خفيفة للحث على ASR وداخل النواة actin قضبان التجميع. بالنسبة للمختبرات التي والحصول على الذباب وتلاعب الحقن، ينبغي أن تكون هذه الطريقة قابلة للتنفيذ بسهولة وقابلة للتكيف مع خطوط محددة للدراسة فيما يتعلق بـ ASR، بما في ذلك تحريضها من خلال ضغوط مختلفة أو تعديل في خلفيات جينية متميزة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد أكواب جمع الأجنة وألواح عصير التفاح أجار
- قبل خمسة أيام من تجربة الحقن، قم ببناء28 أو شراء كأسين صغيرين على الأقل لجمع الأجنة. جعل الطازجة 60 مم عصير التفاح أجار لوحات لاستخدامها مع أكواب جمع صغيرة28. لوحات تخزين في صناديق بلاستيكية مغطاة بمناشف ورقية رطبة عند 4 °C.
ملاحظة: سوف توفر أكواب جمع الأجنة الصغيرة، المُلَغَلة بأرقام الذبابة كما هو موضح في الخطوة 1.3، أعدادًا كافية من الأجنة لكل تجربة، مع ضمان إمكانية إجراء معالجة الجنين وحقنه في وقت قصير بما يكفي للسماح بتصوير مراحل النمو المبكرة. - سخّن أطباق عصير التفاح إلى 18 درجة مئوية وأضف داب من معجون الخميرة إلى وسط اللوحة. معجون الخميرة هو عجينة بسيطة من الخميرة النشطة والمياه المقطرة.
- لتعزيز زرع البيض الأكثر سخاء، إعداد أكواب جمع مع الذباب 2 أيام قبل التجربة. إضافة ما لا يقل عن 100 الإناث و 50 ذباب الذكور إلى أكواب جمع، وأعلى مع طبق عصير التفاح المعدة (الشكل 1، الخطوة 1). في الأيام التي تسبق تجربة الحقن تغيير لوحات عصير التفاح على الأقل مرتين كل يوم، مرة واحدة في الصباح ومرة واحدة في المساء.
ملاحظة: يتم الحصول على أفضل نتائج الحقن والتصوير عندما يتم الاحتفاظ بأكواب جمع الأجنة عند درجة حرارة 18 درجة مئوية مع ضوء 12 ساعة/ دورة ضوء.
2. إعداد حل الأسهم العاملة من G-actinالأحمر للمجهر
ملاحظة: هذا الإعداد يجعل فقط 2 ميكرولتر من 5 ملغ / مل المخزون العامل من G-actinالأحمر، لذلك إذا كان المستخدمون غير معتادين على تقنية الحقن المجهري ، فمن المفيد أن تتخطى إلى الخطوة 3 وممارسة الحقن المجهرية مع عازلة محايدة لدرجة اللون اله PH للحفاظ على المخزون العامل الثمين. يمكن تخزين مخزون 10 ميكروغرام من G-actinRed من البائع في عبوته الأصلية في وعاء علوي 16 أوقية مع 500 غرام من الزهاء عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.
- إعداد حل الأسهم G-العازلة مقدما: 5 M تريس-HCl, 0.2 mM CaCl2,pH 8.0. تصفية وتخزينها في درجة حرارة الغرفة.
- في يوم الحقن، وإعداد 1 مل من حل العمل G-العازلة في أنبوب جديد المفاجئة سقف microcentrifuge على الجليد باستخدام المخزون G-العازلة من الخطوة 2.1، تستكمل بما يلي في التركيزات النهائية المشار إليها: 1 mM dithiothreitol (DTT) و 0.2 mM ATP، درجة النقح الانبعاثات 8.0.
ملاحظة: حجم 1 مل من حل العمل G-buffer هو أكثر من ما هو مطلوب لتجربة ولكن يبسط إعداد. يمكن التخلص من الفائض بعد التجربة أو يمكن للمستخدمين تقليصها وفقًا لتفضيلاتهم.- حفظ 10 ميكروغرام G-actinالأحمر المخزون على الجليد، أولا إضافة 1 ميكرولتر من تصفية، والمياه المقطرة إلى الجزء العلوي من قطرة الوردي من G-actinالأحمر داخل الأنبوب.
- بعد ذلك، إضافة 1 μL من الباردة، أعدت حديثا G-العازلة حل العمل من الخطوة 2.2. Pipet صعودا وهبوطا ~ 20 مرة لخلط جيدا مع حجم ماصة تعيين إلى 1 ميكرولتر. الأسهم G-actinالأحمر سيكون الآن في التخفيف النهائي من 5 ملغ / مل.
- احتضان إعداد G-actinالأحمر لمدة 30 دقيقة على الجليد دون عائق.
- جهاز طرد مركزي إعداد G-actinالأحمر في 16,000 x ز لمدة 20 دقيقة في 4 درجة مئوية في microcentrifuge لإزالة أي عجل.
- بعناية pipet 1.5 μL من supernatant في أنبوب قبعة صغيرة صغيرة جديدة على الجليد ، وتجنب بيليه الوردي الداكن.
- تخزين إعداد G-actinالأحمر فوق على الجليد لمدة تصل إلى 6 ساعة حتى تصبح جاهزة لتحميل في microneedle.
ملاحظة: يمكن سحب Microneedles من أنابيب الشعيرات الدموية مقدما على جرة ميكروبيبيت، ثم تخزينها في درجة حرارة الغرفة على شريط من الطين النمذجة في طبق بيتري 100 × 20 ملم. يمكن العثور على المعلمات المقترحة لسحب microneedle في كتاب الطبخ الماص29.
3. جمع الأجنة وجبل للحقن
- السماح للذباب لوضع الأجنة لمدة 30 دقيقة على أطباق عصير التفاح مع معجون الخميرة في 18 درجة مئوية.
- في حين أن الذباب يتم وضع، قبل الدافئة لوحة عصير التفاح أجار دون معجون الخميرة إلى درجة حرارة الغرفة، وقطع 4 سم × 1 سم إسفين مستطيلة من عصير التفاح أجار مع شفرة حلاقة، ومكان على شريحة زجاجية 25 مم × 75 ملم.
- حصاد لوحة من جمع 30 دقيقة وأجنة مُصفّح عن طريق صب التبييض الطازج، المخفف 1:1 مع الماء المقطر، على لوحة ويحوم لوحة لمدة 1 دقيقة، كما هو موضح في28 (الشكل 1، الخطوة 2).
ملاحظة: تباع ماركات مختلفة من التبييض بتركيزات مختلفة. التبييض المستخدمة هنا هو 6٪ هيبوكلوريت الصوديوم من الزجاجة ويتم تخفيفها إلى تركيز نهائي من هيبوكلوريت الصوديوم 3٪. سوف العلامات التجارية التبييض الأخرى بتركيزات أقل قليلا تعمل بشكل جيد على قدم المساواة. - صب التبييض والأجنة المصفحة في سلة جمع (مصفاة خلية 70 ميكرومتر) وشطف اللوحة مرتين بالماء المقطر من زجاجة بخ، مضيفا هذه يغسل إلى سلة جمع.
- شطف بقوة الأجنة المفحتة في سلة جمع مع الماء المقطر حتى لا كتل الخميرة مرئية والسلة لا يترك علامات وردية من التبييض الزائد عندما لطخت على منشفة ورقية.
- حصاد لوحة من جمع 30 دقيقة وأجنة مُصفّح عن طريق صب التبييض الطازج، المخفف 1:1 مع الماء المقطر، على لوحة ويحوم لوحة لمدة 1 دقيقة، كما هو موضح في28 (الشكل 1، الخطوة 2).
- باستخدام فرشاة الطلاء مع شعيرات مبللة بالماء المقطر، ونقل الأجنة المطهرة والمغسلة من سلة جمع على عصير التفاح إعداد أجار إسفين على الشريحة الزجاجية.
- استخدام زوج من ملاقط تلميح غرامة أو إبرة تشريح لترتيب عشرة أجنة في خط مستقيم على طول المحور الطويل من إسفين أجار مستطيلة (الشكل 1, الخطوة 3). ترتيب الأجنة وجها إلى الذيل، بحيث القطب الأمامي يواجه إلى الجانب الأيمن والدوسل تواجه الباحث(الشكل 1، الخطوة 3 ، تضخيم).
- قطع 0.5 سم من نهاية تلميح P200 ماصة مع شفرة حلاقة وتراجع في "الغراء الجنين" (وصفها في28). معطف بسخاء منطقة 5 ملم في العرض(الشكل 1، الخطوة 4)على طول الحافة الطويلة من 24 مم × 50 مم مستطيلة الأغطية ، والسماح الجافة ، ولصق الجانب حتى. سوف يستغرق التجفيف ~ 30 ثانية، ويكتمل بمجرد أن تظهر المنطقة المغلفة بالغراء كامل غير لامع بدلاً من الرطب أو لامعة.
ملاحظة: إعداد "الغراء الجنين" على الأقل 48 ساعة مقدما. أضف ن-هيبتان إلى شرائط من الشريط على الوجهين في قارورة متألقة كما هو موضح في28. - بمجرد أن جفف "الغراء الجنين" ، ضع بلطف جانب الغراء الأغطية لأسفل على قمة صف الأجنة المنحازة على agar ، مما يترك 2-3 مم من المساحة بين حافة الغطاء وصف الأجنة.
ملاحظة: قد يؤدي لصق الأجنة القريبة جدًا من حافة الغطاء إلى جفاف الأجنة أكثر من اللازم أثناء التجربة. - قم بقلب الغطاء حتى تواجه الأجنة الآن. وينبغي أن تكون عالقة في خط على طول حافة واحدة طويلة من الغطاء، ومنطقة البطن التي تواجهها أقرب حافة الغطاء (الشكل 1، الخطوة 4 ، مكبرة).
- قم بتخريب الأجنة عن طريق وضع الغطاء مع الأجنة بلطف فوق 150 غرام من المجففات الزرقاء الطازجة المخزنة في جرة 16 أوقية برغي أعلى. المسمار بإحكام على غطاء واحتضان لمدة 8-10 دقيقة(الشكل 1، الخطوة 5).
- بعد جفاف، وإزالة الأغطية من جرة مجفف والشريط كل جانب قصير من الأغطية إلى شريحة المجهر، جانب الجنين حتى،مع اثنين من 4 سم2 قطعة من الشريط على الوجهين بحيث يغطي الجنين سوف تناسب على مرحلة الحقن (الشكل 1، الخطوة 6).
- أضف 2-3 قطرات من زيت الهالكربون 27 مع ماصة باستير لتغطية الأجنة المنحازة وحمايتها من المزيد من الجفاف (الشكل 1، الخطوة 6).
4. حقن والحرارة الأجنة الإجهاد لتعزيز تشكيل قضيب actin
ملاحظة: يتم إجراء جميع الحقن في غرفة يتم التحكم فيها بدرجة حرارة عند 18 درجة مئوية.
- إعداد غرف الحضانة الرطبة من طبق بيتري الزجاج لا يقل عن 100 مم × 20 ملم في الحجم وخط الغرفة مع التقلبات من ماسحات الأنسجة المختبرية مبللة بالماء المقطر (الشكل 1, الخطوة 8). تدفئة ما قبل غرف الحضانة عند 32 درجة مئوية أو درجة حرارة الحضانة المطلوبة قبل حقن الأجنة.
- فتح صمام تدفق الهواء للمخنّغ الصغير وتشغيل على الميكروين (الهواء المضغوط أو الهواء المنزل مع ضغط لا يقل عن 90 psi هو مناسبة).
- في حين أن الأجنة هي المجففة، backload السابق إعداد G-actinالأحمر سوبرنات في microneedle باستخدام طرف محمل الصغرى. تعيين ماصة لرسم 1-1.5 μL.
ملاحظة: بسبب اللزوجة actin قد لا تكون دقيقة تحميل وحدات التخزين وقد يكون هناك actin كافية اليسار لتحميل ما لا يقل عن واحد إلى اثنين من microneedles أكثر. يمكن حقن ما يصل إلى 60 جنينًا لكل ميكرونيدل تم تحميله إذا تم معايرة الميكرونسيدل بشكل صحيح ولم يتم انسداده أثناء التجربة. - إرفاق microneedle إلى حامل إبرة وتشديد المسمار. توصيل أنبوب الهواء إلى الميكروين والتأكد من أن ضغط التدفق الخلفي على موازين microneedle إلى 30 ه ب.
- معايرة إعدادات الميكروين لطرد 100 μm قطر فقاعة من G-actinالأحمر (~ 500 pL) على ميكرومتر الشريحة. تدوير مقبض الضغط (500-1500 ه بي سي) وحقن نبض مقبض الوقت (0.1-0.5 s) على الحقن المجهري للحصول على حجم فقاعة الحق. ضبط هذه الإعدادات في كل مرة يتم تحميل microneedle جديدة لحساب التباين في اللزوجة actin وصغر الحجم تلميح.
ملاحظة: إعداد G-actinالأحمر هو لزجة، وقد يكون هناك الهواء في غيض من microneedle التي ينبغي طرد قبل حقن الأجنة. إذا كان G-actinالأحمر لا يطرد بسهولة من غيض من microneedle، كسر بلطف تلميح microneedle ضد حافة ميكرومتر الشريحة. - ضع الشريحة مع الأجنة المثبتة على مرحلة المجهر.
ملاحظة: كل حقن إعداد سيكون مختلفا، لذلك سوف يكون الباحثون لضبط طريقة الحقن وفقا لذلك. هنا يتم نقل الأجنة فيما يتعلق ميكرونيدل ثابتة، وحقن كل جنين عن طريق تشغيل الجنين في microneedle. - ضبط مرحلة micromanipulator والتركيز من الهدف 10x على المجهر الخفيف بحيث تكون الأجنة مرئية. الأجنة هي في الطائرة المحورية الصحيحة عندما الخطوط العريضة للغشاء ال vitelline هي الأكثر حدة والجنين يظهر أكبر. اختيار الأجنة لحقن التي هي في مرحلة النمو الصحيح، بحيث بحلول الوقت الذي يتم الانتهاء من الحضانة بعد الحقن، ومعظم مخلب تصل إلى مرحلة النمو المطلوب (على سبيل المثال، حقن الأجنة في مرحلة بوونيس 2-330 من أجل مراقبة قضبان في الخلية بعد الإجهاد الحراري في 32 درجة مئوية).
- استخدم أدوات التحكم الدقيقة لإدخال الإبرة إلى نفس المستوى البؤري الذي تستخدمه الأجنة.
ملاحظة: إذا كان المصيد microneedle على غطاء بينما تتحرك المرحلة أو microneedle، ثم microneedle هو قريب جدا من الشريحة وليس في الطائرة البؤرية الصحيحة. يجب أن يكون microneedle موازية للأغطية ، وليس في زاوية كبيرة (الشكل 1، الخطوة 7). - أدخل المايكرونيدل في الجنين بحيث يضرب الجنين في وسط منطقة البطن، عند "خط الاستواء" للجنين. حقن الزناد مع دواسة القدم أو "حقن" زر عندما تلميح microneedle مرئيا داخل منتصف الجنين (الشكل 1، الخطوة 7).
- حقن G-actinالأحمر مرة واحدة وإزالة ببطء microneedle. حرك المرحلة وكرر لكل جنين من المرحلة التنموية المناسبة.
ملاحظة: توسيع الجنين أمر طبيعي كما يتم حقن G-actinالأحمر وقليلا من السيتوبلازم قد تسرب من الجنين. - بعد حقن جميع الأجنة، ضع الشريحة مع الأجنة في غرفة الحضانة الرطبة المعدة، واغلق الغطاء (الشكل 1، الخطوة 8). إذا كان يحاول الحصول على الأجنة التي تصل إلى الخلية، والحرارة الإجهاد الأجنة في 32 درجة مئوية لمدة 60-75 دقيقة في غرفة الحضانة الرطبة.
ملاحظة: لوحظ أن أوقات الحضانة تسمح بالتصور للقضبان في الأجنة المعالجة بالحرارة. وسوف يكون وقت الحضانة أطول للأجنة غير الإجهاد الحرارة السيطرة لأن التنمية ستكون أبطأ في درجة حرارة أقل31. ويمكن احتضان هذه الأجنة التحكم في غرف رطبة في درجات حرارة مثل 18 درجة مئوية أو 25 درجة مئوية، اعتمادا على تصميم تجربة محددة والسؤال الذي يتعين طرحه. الحد الأدنى من وقت الحضانة اللازملـ G-actin Red لنشره في جميع أنحاء الجنين هو 30 دقيقة.
5. صورة actin قضبان في الأجنة وشدد الحرارة عن طريق المجهر confocal
- في حين يجري الأجنة وشدد الحرارة، تشغيل المجهر confocal واختيار قناة الليزر 561 نانومتر.
- نقل عدسة الهدف (25x، 40x أو 63x الموصى بها) إلى موقف العمل.
- إذا كان التصوير حرارة وشدد الأجنة، ثم تعيين حاضنة مرحلة ساخنة لتحقيق درجة حرارة داخلية من 32 درجة مئوية. يمكن استخدام مقياس حرارة نقطة واطلاق النار أو الأشعة تحت الحمراء للتحقق من درجة الحرارة في أو بالقرب من الهدف.
- إزالة الشريحة مع الأجنة المحقونة من غرفة الحضانة الرطبة بعد اكتمال الحضانة (الشكل 1، الخطوة 9).
- تعمل بسرعة، برفق ابعاد قطع الشريط على الوجهين التي كانت تستخدم في التمسك الأغطية مع الأجنة شنت على الشريحة (الشكل 1، الخطوة 9).
تنبيه: كن لطيفًا أثناء هذه الخطوات حيث يمكن أن تتحطم الأغطية بسهولة إذا تم تطبيق الكثير من القوة. - عصا اثنين 2.5 سم طويلة قطعة من الشريط على الوجهين معا وقطع الشريط في نصف بالطول لجعل اثنين من شرائط، 2.5 × 0.5 سم طويلة (الشكل 1، الخطوة 10).
- عصا ثلثي طول كل شريط الشريط على الغطاء الأول، يحيط كل جانب من الأجنة في زيت الهالوكربون 27 (الشكل 1, الخطوة 10, البرتقالي), ترك ثلث الشريط شرائط تتدلى قبالة حافة الغطاء الأول حيث عالقون الأجنة. استخدمي اليدين القفازتين، وتوخي الحذر من لمس الأجنة خلال هذه الخطوة.
- ضع بلطف غطاء مستطيل ثان على رأس أشرطة الشريط لشطائر الأجنة بين الأغطية (الشكل 1، الخطوة 10 ، الأزرق). محاذاة حواف 25 ملم ولكن الحفاظ على حواف 50 مم إزاحة من بعضها البعض بمقدار 1 سم في العرض.
ملاحظة: هذا الغطاء الثاني 'ق السطح الكامل سوف تصبح سطح التصوير الجديد الذي سوف يواجه عدسة الهدف، لذلك الحرص على عدم الحصول على بصمات الأصابع أو زيت الهالكربون 27 على هذا السطح يغطي الثاني. الإزاحة ضروريّة أنّ أنّ إضافيّة هالوكاربون 27 زيت يستطيع كنت أضفت أن يزجّت أجنة بتعادل. إذا لزم الأمر، إضافة زيت الهالكربون 27 في التماس حيث يغطي اثنين يجتمع في الجزء العلوي من شطيرة وسوف معطف الأجنة عن طريق عمل الشعرية (انظر خطوط متقطعة في الشكل 1، الخطوة 10). - اضغط بلطف على المناطق من الأغطية التي هي مباشرة على رأس الشريط الشريط مع الجانب الحاد من razorblade للحصول على غطاء للتمسك الشريط.
- اقلب ساندويتش الأغطية وضعه على ممسحة نسيج معملية للحفاظ على سطح التصوير نظيفًا وتحمله إلى المجهر confocal (الشكل 1، الخطوة 11). تأكد من أن الشريط عالق تمامًا في كل من الأغطية قبل التصوير.
- تأكد من أن المرحلة الساخنة في درجة الحرارة وإذا كان استخدام المجهر المقلوب، إضافة السائل الغمر على عدسة الهدف المحدد.
- ضع ساندويتش الأغطية على المسرح بعناية لضمان أن سطح التصوير الجديد(2 nd coverslip) هو واحد لمس السائل الغمر(الشكل 1، الخطوة 11).
ملاحظة: إذا لزم الأمر، قم بلصق شطيرة الأغطية على المسرح بقطعتين صغيرتين من الشريط المزدوج الجانب لمنع الحركة غير الضرورية أثناء التصوير إذا لم تكن الأغطية مناسبة بشكل جيد في المرحلة الساخنة. - التركيز على الجنين الذي هو في الخلية (Bownes المرحلة 4a30) أو مرحلة النمو المطلوب باستخدام إما الضوء المنقولة أو الفلوريس.
- بمجرد أن يتم التركيز على الجنين، انتقل إلى وضع اقتناء الليزر على المجهر confocal وضبط قوة الليزر والمكاسب، وحجم الإطار، والتبليط، وإعدادات الإسقاط حسب الرغبة.
- خذ صورًا للعرض السطحي عبر الأسطح المحورية لنويات الجنين للعثور على قضبان أكتين داخل النواة. يجب أن تظهر قضبان في اتجاهات متعددة كما الشرائط أو النقاط الساطعة داخل نواة مظلمة نسبيا (الشكل 2A, 2C).
6- تجارب التصوير البديلة
- أداء FRAP للتحقيق في دوران actin على طول قضبان actin داخل النواة أو في هياكل أكتين السيتوبلازمي, مثل نصائح من الشقوق غشاء البلازما أثناء خلوية.
- في برنامج التصوير، اختر منطقة مستطيلة حول نصائح جفن أو قضبان actin التي للحصول على التجربة.
- اختيار منطقة صغيرة مربعة من مركز قضيب actin داخل منطقة اقتناء مستطيلة لتبييض. تأكد من أن نصائح قضيب actin مرئية ولا يتم تبييضها أثناء التجربة للسماح بالتتبع الدقيق للقضيب داخل النواة.
- تعيين ليزر التبييض لتكفير 50x وتعيين قوة الليزر التبييض إلى أقصى حد.
- اختر دورة زمنية للحصول على الصور كل ثانية بإجمالي يصل إلى 120 ثانية بأقصى سرعة بكسل وتعيين الليزر على التبييض بعد أول ثانيتين من الحصول على الصور.
- كمّيّة البيانات لتحديد نصف الوقت من ال [فلويسنسّنسّا ريستنس1].
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يتم تصوير سير عمل تخطيطي للتعامل مع الأجنة في الشكل 1، ويتم عرض جدول زمني لتجربة نموذجية في الجدول 1. تقدير لنتيجة تجريبية جيدة هو أنه لكل 10 أجنة حقن، ما لا يقل عن نصف الأجنة ينظر إليها سيكون في مرحلة النمو الصحيح، غير التالفة، وتظهر ASR قوية مع الإجهاد الحراري في 32 درجة مئوية. وسوف يتضح هذا ASR من خلال تجميع قضبان actin داخل النواة كما هو مبين في صورة عرض سطحية تمثيلية للجنين في الشكل 2A (اللوحة اليمنى). سوف تظهر قضبان أكتين في عدة اتجاهات (متوازية أو عمودية على طائرة التصوير) داخل النوى ويمكن تصويرها من خلال عدة طائرات محورية. وبالمقارنة، فإن الأجنة المحتضنة في 18 درجة مئوية لن تعرض قضبان actin(الشكل 2A، اللوحة اليسرى). ويمكن تحديد نسبة النوى التي تحتوي على قضبان كميا، كما هو موضح في الشكل 2B. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن إجراء التجارب FRAP على قضبان (الشكل 2C). يتم الرجوع إلى طريقة التقدير الكمي المقترحة لبيانات FRAP في1، ويرد مثال على مؤامرة استرداد الفلوريسين لمنطقة مبيضة مقابل غير مبيضة لقضيب actin في الشكل 2D.
إذا تعرض الجنين لأضرار شديدة عن طريق الحقن أو أصبح جافًا جدًا أثناء التجربة، فقد يتم ملاحظة حالة التشنج الميتاوتية وسيتم تعطيل عملية التليفون الخلوي. في بعض الأحيان، قد لا تكون قضبان مرئية بسبب الفشل في الحصول على ما يكفي من actin حقن في الجنين. إذا حدث هذا، تأكد من أن كمية G-actinRed المحقونة هي 500 pL (تقاس بالميكرمتر في الخطوة 4.5) وتأكد من أن هذه الكمية تظل متسقة بين الأجنة عن طريق إجراء حقن اختبار في الزيت المحيط للتحقق من حجم فقاعة G-actinRed بين كل جنين microinjection. بالإضافة إلى ذلك، لضمان تصور قضيب، والعمل بسرعة لإضافة غطاء ونقل الأجنة إلى مرحلة المجهر ساخنة مرة واحدة يتم أخذها من الغرفة الرطبة في الخطوة 5.4، كما هو عكس قضبان التجمع1 وقضبان يمكن تفكيك إذا تم الاحتفاظ الأجنة في درجة حرارة أقل من 32 درجة مئوية لأكثر من 30 دقيقة.
الشكل 1: نظرة عامة تخطيطية على معالجة الأجنة أثناء التجربة. (1) الكبار الذباب في أكواب جمع الأجنة وضع الأجنة على أطباق عصير التفاح أجار. (2) يتم dechorionated الأجنة مع 1:1 التبييض: الماء المقطر، وسكب في سلة جمع، وغسلها جيدا بالماء المقطر لإزالة التبييض والحطام. (3) يتم نقل الأجنة مع فرشاة الطلاء إلى إسفين عصير التفاح مستطيلة على شريحة وترتيبها على الجانبين، من الرأس إلى الذيل، مع منطقة الظهر التي تواجه حافة أجار. (4) منطقة 5 × 50 مم من غطاء زجاجي (برتقالي) مغلفة بـ "أغراء جنين" وضغطت بلطف على صف الأجنة المرتبة على الـ agar لتمسكها بالأغطية. (5) يتم عكس الغطاء مع الأجنة بحيث تواجه الأجنة. يتم تخ المجففات الأجنة في جرة أعلى المسمار. (6) مباشرة بعد الجفاف، يتم تسجيل الغطاء إلى شريحة، والأجنة التي تواجه، ويتم تغطية الأجنة مع زيت الهالكربون 27. (7) يتم استخدام microneedle محملة مسبقًابـ G-actin Red المعدة لصنع حقنة واحدة في وسط منطقة البطن لكل جنين ، مع إبرة موضوعة بالتوازي مع الغطاء. (8) بعد الحقن ، يتم احتضان الأجنة داخل طبق بيتري مرطب مع ماسحات الأنسجة المختبرية الرطبة في درجة حرارة التحكم (18 درجة مئوية) أو مع الإجهاد الحراري (32 درجة مئوية). (9) بعد الحضانة ، يتم إزالة الغطاء مع الأجنة على ذلك من الشريحة. (10) قطعتين من الشريط على الوجهين هي الطبقات على رأس بعضها البعض، شرائح في نصف طول، ووضعها على جانبي النفط المحيطة الأجنة على الغطاء الأول. يتم وضع غطاء ثاني (أزرق) فوق الأول لإنشاء سطح تصوير جديد ، أو تعويض بحيث يترك فجوة لمزيد من الزيت لإضافته لتغطية الأجنة حسب الضرورة. (11) إذا كان التصوير على مجهر مقلوب، يتم عكس ساندويتش غطاء بحيث يواجه الغطاء الثاني الهدف. يتم التصوير في غرفة محتضنة ، ويتم تصور قضبان actin عبر عدة طائرات محورية من نوى كل جنين. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: النتائج التمثيلية لقضبان actin في الأجنة التي تعمل بالحرارة. (أ) لا ينظر إلى قضبان أكتين في جنين تم احتضانه عند درجة حرارة التحكم 18 درجة مئوية (اللوحة اليسرى) ، ولكن ينظر في نوات جنين كان مجهدا بالحرارة عند 32 درجة مئوية (اللوحة اليمنى). (ب)القياس الكمي للنسبة المئوية للنيات مع قضبان أكتين من تجربة تمثيلية. كل نقطة تمثل جنينا واحدا حيث تم عد قضبان ونوى في المنطقة المصورة بأكملها (ن = 22 جنينا في 18 درجة مئوية؛ ن = 23 جنينا عند 32 درجة مئوية؛ شرائط الخطأ تظهر انحرافا معياريا). تم استخدام اختبار t للطالب، مع افتراض التباين غير المتكافئ، لحساب قيمة p. (C)سلسلة زمنية تمثيلية يظهر FRAP على قضيب actin. يشار إلى الجزء من قضيب التي تم تبييضها بواسطة رأس سهم أبيض. التبييض المسبق هو 2 s قبل خطوة التبييض. الوقت = 0 s هو خطوة التبييض، وتم تتبع استرداد الفلوريسنس حتى 60 s آخر التبييض. (D) مؤامرة يظهر ديناميات الانتعاش لdin fluorescence في منطقة مبيض من قضيب، مقارنة مع منطقة غير مبيض في قضيب نفسه. قضبان مستقرة بشكل ملحوظ و actin داخلها لا دوران. وهكذا، لا ينظر إلى أي انتعاش. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الجدول 1: سير العمل التجريبي مع الجدول الزمني المقترح. يلخص هذا الجدول الزمني الوقت المتوقع الذي سيستغرقه إكمال كل خطوة من خطوات البروتوكول.
| الطلب | خطوه | الوقت المطلوب لكل خطوة | وصف |
| 1 | 1.1 | 5 أيام مقدما | جعل أقفاص جمع الأجنة. صب عصير التفاح لوحات أجار. |
| 2 | 1.2-1.3 | قبل يومين | إعداد أقفاص جمع مع ذباب الذكور والإناث الكبار. |
| 3 | 2.6 ملاحظة | يوم واحد مقدما | سحب أنابيب شعرية لجعل microneedles. |
| 4 | 2.1-2.6 | 7 . | إعداد G-actin. |
| 5 | 3.1 | 30 دقيقة | السماح للذباب لوضع البيض. |
| 6 | 3.2-3.10 | 15-30 دقيقة | جمع، جبل، المجففة الأجنة. تغطية الأجنة مع النفط. |
| 7 | 4.1 | 30 دقيقة مقدما | إعداد غرف الحضانة الرطبة. |
| 8 | 4.2-4.4 | 1 دقيقة | تحميل microneedle. |
| 9 | 4.5-4.10 | 10-20 دقيقة | معايرة G-actin حجم فقاعة وحقن الأجنة. |
| 10 | 4.11 | 30 دقيقة-1+ ح | احتضان / الحرارة الإجهاد أجنة. |
| 11 | 5.1-5.3 | ساعة مقدماً | بدوره على المجهر ومرحلة الحضانة. |
| 12 | 5.4-5.10 | 5 دقائق | أجنة ساندويتش بين الأغطية للتصوير. |
| 13 | 5.11-6.6 | 15 دقيقة-1+ ح | صورة داخل النوى actin قضبان في الأجنة. |
الجدول 2: اقتراحات استكشاف الأخطاء وإصلاحها. يوفر هذا الجدول اقتراحات لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها للمساعدة في إكمال البروتوكول بنجاح.
| مشكلة محتملة | اقتراحات |
| الذباب لا يضع ما يكفي من الأجنة. | قم بإعداد الكوب قبل 5 أيام على الأقل (راجع الخطوات 1.1-1.3). تغيير لوحات 3x يوميا مما يصل الى التجربة لتشجيع وضع البيض. اسمحوا الذباب وضع الأجنة لمدة 1 ساعة بدلا من 30 دقيقة. إعداد أكواب مع الذباب الكبار الشباب. |
| لا يتم طرد G-actin من microneedle. | زيادة الضغط وضبط الوقت على ناخن micro. كسر تلميح microneedle أبعد من ذلك (راجع الخطوة 4.5 ملاحظة). منذ القباقيب الرئيسية قد لا تكون واضحة، تحميل إبرة جديدة. |
| من الصعب معايرة حجم فقاعة صغيرة بما فيه الكفاية. | ضبط إعدادات الضغط والوقت (راجع الخطوة 4.5). منذ فتح تلميح microneedle قد تكون كبيرة جدا، تحميل إبرة جديدة. |
| تُطلق الأجنة من الغراء على الغطاء أثناء الحقن. | ضبط "الغراء الجنين" الاتساق لأغطية المستقبل عن طريق إضافة المزيد من الشريط على الوجهين إلى حل heptane (الرجوع إلى الخطوة 3.5 ملاحظة). |
| تجف الأجنة أثناء حضانة درجة الحرارة. | تأكد من أن الشريحة هي مستوى في غرفة الحضانة (الرجوع إلى الخطوة 4.11) وأن النفط لا لمس أي شيء قد فتاة بعيدا. إضافة قطرات إضافية من النفط إلى الأجنة. تقليل وقت ما قبل الحقن بالجفاف (راجع الخطوة 3.8). |
| النفط لا يغطي تماما الأجنة بين الأغطية الأولى والثانية. | إضافة زيت إضافي عن طريق عمل شعري إلى الفجوة الصغيرة بين الأغطية (الرجوع إلى الخطوة 5.8 ملاحظة). |
| قضبان actin داخل النواة غير مرئية في الأجنة التي تجهد الحرارة. | حقن حجم أكبر من G-actin (الرجوع إلى الخطوة 4.5). تأكد من أن درجة حرارة كل من الحضانة بعد الحقن (راجع الخطوة 4.11) وغرفة التصوير هي 32 درجة مئوية (راجع الخطوة 5.3). |
| فقاعات كبيرة من G-actin مرئية حول موقع حقن الأجنة. | حقن حجم أصغر من G-actin (الرجوع إلى الخطوة 4.5). زيادة الوقت الجنين جفاف لتعزيز الاحتفاظ بشكل أفضل من actin حقن داخل الجنين (الرجوع إلى الخطوة 3.8). |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
أهمية هذه الطريقة هي أنها تستخدم بروتوكول راسخ من الحقن المجهري في الأجنة دروسوفيليا 21,22,23,24,25,26,27 لتمكين البحوث الجديدة بشأن ASR و المرافقة actin قضبان التجميع. من المزايا الرئيسية لحقن G-actinRed في الأجنة الحية أنه يمكن دراسة ASR في ظل مجموعة متنوعة من السياقات. بالنسبة للدراسات المستقبلية، قد تتضمن هذه السياقات حقن أجنة من أنواع جينية أخرى كجزء من شاشة متحولة أو تعريض الأجنة المحقونة لظروف إجهاد مختلفة، مثل الإجهاد التأاكسي4،32. على الرغم من عدم وصفها بالتفصيل هنا، يمكن أيضا أن يتم تعديل هذه التقنية حقن لحقن الأحماض النووية، والبروتينات الأخرى، والمخدرات والأصباغ المؤشر (على سبيل المثال، انظر21،22،23،24،32) لدراسة ASR. وهكذا، تقدم هذه الطريقة عدداً من الأساليب لتحديد نطاق الضغوط التي تحفز ASR، وتتميز بشكل أكبر بالاستجابات الخلوية أثناء ASR (مثل التغيرات في نشاط الميتوكوندريا)، والكشف عن جزيئات وآليات جديدة تحت تجميع قضبان داخل النواة.
وتشمل بعض الخطوات الحاسمة للبروتوكول ما يلي: في الخطوة 3.8، يجب أن تكون الأجنة مجففة بشكل صحيح لضمان الحقن الناجح وأفضل صحة الجنين. يعتمد وقت الجفاف على درجة الحرارة المحيطة والرطوبة في المختبر ، لذلك يوصى بممارسة التركيب والجفاف والحقن مع عازلة درجة حرارة عالية محايدة أولاً لإنشاء هذه المعلمة للتعامل مع الأجنة. في الخطوة 4.5، يجب ضبط إعدادات الحقن و microneedle بدقة للسماح بحقن ما يكفي من G-actinRed في الأجنة. إذا تم حقن القليل جدا G-actinالأحمر في الجنين, قد لا يكون تصور قضبان actin بسهولة, منذ تشكيل قضبان actin يعتمد على تركيز أكتين الحرة1. بالإضافة إلى ذلك، سيكون من الصعب الحصول على نتائج متسقة من تجارب FRAP إذا لم يكن هناك ما يكفي من G-actinRed حقن، منذ كثافة الفلوريسين لن تكون عالية بما يكفي للتغلب على الفلورسيسنس الخلفية. لذلك، من المهم معايرة حجم الفقاعة في كل مرة يتم تحميل إبرة جديدة واستخدامها. G-actinالأحمر هو لزج ويميل إلى تسد داخل microneedle. في بعض الأحيان، وهذا يمكن أن يؤدي إلى حقن كميات متغيرة من G-actin في الأجنة. إذا تم انسداد microneedle وتطهير microneedle مع ارتفاع الضغط فشل، قد يكون من الضروري محاولة كسر غيض من microneedle مزيد من أو حتى تحميل ميكرونيدل جديد وحقن مجموعة جديدة من الأجنة. وأخيراً، في الخطوة 4-11، يجب أن تحضن الأجنة في درجة حرارة مرتفعة وللمرة الكافية لكي يتم تحريضها وقضبان لتشكيل1. وينبغي رصد درجات الحرارة في جميع الحاضنات باستمرار، ويجب أن يكون الوقت لنقل الأجنة من الحاضنة إلى الحاضنة محدودا، وأن يستخدم جهاز توقيت في جميع الحضانات. يتم سرد المشاكل المحتملة الأخرى في الجدول 2 مع نصائح استكشاف الأخطاء وإصلاحها المصاحبة.
ومن القيود الرئيسية لهذا البروتوكول أنه يجب توخي الحذر الاستثنائي للحفاظ على صحة الأجنة أثناء الحقن والحضانة والتصوير. وقد تم تصميم البروتوكول لتحقيق أقصى قدر من صحة الجنين، ومع ممارسة كبيرة، يمكن للباحث إكمال جميع خطوات البروتوكول مع تطور الجنين في التقدم بالمعدلات المتوقعة في درجة الحرارة31. وهناك قيد ثان للبروتوكول هو ضرورة وجود جهاز للتلاعب المجهري ، الذي يمكن أن يكون مكلفا إلى حد ما وليس معدات شائعة لكل مختبر ذبابة. ومع ذلك، إذا تم تجهيز مختبر مجاور لحقن أجنة أخرى (على سبيل المثال، Xenopus،حمار وحشي، وCaenorhabditis elegans)أو الخلايا المتصّنة، فإن تلاعب الحقن المستخدم من المرجح أن يكون مناسبًا لحقن دروسو فيليا. في هذه الحالة، فقط شكل الإبرة تحتاج إلى تكييفها لأجنة دروسوفيليا وفقا للمبادئ التوجيهية لكتاب الطبخ ماشيت29. وبدلاً من ذلك، هناك بعض الخيارات الأقل تكلفة في السوق (مثل الحقن المجهري التناظري)، والتي يمكن أن تقلل إلى حد كبير من تكلفة تجميع جهاز حقن.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
لم يعلن عن تضارب المصالح.
Acknowledgments
يعترف المؤلفان بامتنان بعمل ليوليو تشنغ وتسنغ هوي شيويه، اللذين ساعدا في ريادة هذه التقنية في مختبر سوكاك، وكذلك حسن سيد الذي ساعد في التحليل. يتم تمويل العمل لهذه الدراسة من خلال منحة من المعاهد القومية للصحة (R01 GM115111).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenosine triphosphate (ATP) | Millipore-Sigma | A23835G | Component of G buffer |
| Apple juice, Mott's, 64 fl oz | Mott's | 014800000344 | Component of apple juice plates |
| Bacto Agar | BD | 214010 | Component of apple juice plates |
| Bleach, PureBright Germicidal, 6.0% sodium hypochlorite | KIK International | 059647210020 | For dechorionating embryos |
| Calcium chloride | Millipore-Sigma | C1016500G | Component of G buffer |
| Cell strainer, 70 μm | Falcon | 352350 | For collecting dechorionated embryos |
| Confocal microscope, LSM 880 34-channel with Airyscan | Zeiss | 0000001994956 | For imaging intranuclear actin rods |
| Desiccant | Drierite | 24001 | For desiccating embryos |
| Dissecting microscope, Stemi 508 Stereoscope with 8:1 zoom | Zeiss | 4350649000000 | For arranging embryos on agar wedge |
| Dissecting needle, 5 in | Fisher Scientific | 08965A | For arranging embryos on agar wedge |
| Dithiothreitol (DTT) | Fisher Scientific | BP1725 | Component of G buffer |
| Double-sided Tape, Scotch Permanent, 0.5 in x 250 in | 3M | 021200010323 | For making embryo glue |
| Embryo collection cage | Genessee Scientific | 59100 | For housing adult flies and collecting embryos |
| Fine tip tweezers, Dumont Tweezer, Style 5 | Electron Microscopy Sciences | 72701D | For arranging embryos on agar wedge |
| Glass capillaries, Borosillicate glass, thin 1 mm x 0.75 mm | World Precision Instruments, Inc. | TW1004 | For microneedles |
| Halocarbon oil 27 | Millipore-Sigma | H8773100ML | For hydration of embryos |
| Heated stage incubator | Zeiss | 4118579020000, 4118609020000, 4118609010000 | For confocal imaging |
| Lab Tissue Wipers, KimWipes | Kimberly-Clark | 34155 | Lab tissue wipers |
| Light microscope, Invertoskop 40C Inverted Phase contrast microscope, refurbished | Zeiss | Discontinued | Injection microscope |
| Methyl-4-hydroxybenzoate | Millipore-Sigma | H36471KG | Component of apple juice plates |
| Microinjector, FemtoJet4x | Eppendorf | 5253000025 | Microinjector |
| Micro loader tips, epT.I.P.S. 20 μL | Eppendorf | 5242956003 | For loading microneedles |
| Micromanipulator and injection stage with x,y,z dials for needle adjustment | Bernard Instruments, Inc (Houston, TX) | Custom | For performing microinjections |
| Micropipette puller, Model P-97, Flaming/Brown | Sutter Instruments | P97 | For pulling capillary tubes to make microneedles |
| Microscope cover glass 24x50-1.5 | Fisher Scientific | 12544E | For mounting embryos |
| Microscope slides, Lilac Colorfrost, Precleaned, 25 x 75 x 1mm | Fisher Scientific | 22037081 | For mounting embryos for injection |
| n-Heptane | Fisher Scientific | H3601 | Component of embryo glue |
| Objective, 10x | Zeiss | Discontinued | 10x objective for injection microscope |
| Objective, C-Apochromat 40x/1,2 W Korr. FCS | Zeiss | 4217679971711 | 40x water objective for confocal |
| Objective, LD LCI Plan-Apochromat 25x/0.8 Imm Cor DIC M27 for oil, water, silicone oil or glycerine immersion (D=0-0.17mm) (WD=0.57mm at D=0.17mm) | Zeiss | 4208529871000 | 25x mixed immersion objective for confocal |
| Objective, Plan-Apocrhomat 63x/1.40 Oil DIC f/ELYRA | Zeiss | 4207829900799 | 63x oil objective for confocal |
| Paintbrush, Robert Simmons Expression E85 Pointed Round size 2 | Daler-Rowney | 038372016954 | For transferring embryos |
| Paper towels, Kleenex C-fold paper towels, white | Kimberly-Clark | 884266344845 | For blotting cell strainer |
| Pasteur pipette, 5 3/4 in | Fisher Scientific | 1367820A | For covering embryos with oil |
| Petri dish, glass, 100 x 20 mm | Corning | 3160102 | For humid incubation chamber |
| Petri dish, plastic, 60 x 15 mm | VWR | 25384092 | For apple juice plates |
| Pipette, Eppendorf Reference 0.5-10 μL | Eppendorf | 2231000604 | For loading the microneedle |
| Pipette tip, xTIP4 250 μL | Biotix | 63300006 | For adding embryo glue to coverslip |
| Razor blade | VWR | 55411050 | For cutting agar wedge, tape, pipette tips |
| Rhodamine-conjugated globular actin, human platelet (non-muscle; 4x10 μg) | Cytoskeleton, Inc. | APHR-A | G-actin^Red |
| Scintillation vial, 20 mL Glass borosillicate with polyethylene liner and urea caps | Fisher Scientific | 033377 | For making embryo glue |
| Screw top jar, 16 oz | Nalgene | 000194414195 | For desiccating embryos |
| Stage micrometer | Electron Microscopy Sciences | 602104PG | For calibrating volume of G-actin injection |
| Sucrose | Millipore-Sigma | 840971KG | Component of apple juice plates |
| Trizma base | Millipore-Sigma | T15031KG | Component of G buffer |
| Yeast, Lesaffre Yeast Corporation Yeast, Red Star Active Dry, 32 oz | Lesaffre Yeast Corporation | 117929157002 | Component of yeast paste |
References
- Figard, L., et al. Cofilin-mediated Actin Stress Response is maladaptive in heat-stressed embryos. Cell Reports. 26 (49), 3493-3501 (2019).
- Ashworth, S. L., et al. ADF/cofilin mediates actin cytoskeletal alterations in LLC-PK cells during ATP depletion. American Journal of Physiology Renal Physiology. 284 (4), 852-862 (2003).
- Vandebrouck, A., et al. In vitro analysis of rod composition and actin dynamics in inherited myopathies. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 69 (5), 429-441 (2010).
- Minamide, L. S., Striegl, A. M., Boyle, J. A., Meberg, P. J., Bamburg, J. R. Neurodegenerative stimuli induce persistent ADF/cofilin-actin rods that disrupt distal neurite function. Nature Cell Biology. 2 (9), 628-636 (2000).
- Bamburg, J. R., et al.
- Bamburg, J. R., Bernstein, B. W. Actin dynamics and cofilin-actin rods in alzheimer disease. Cytoskeleton. 73 (9), 477-497 (2016).
- Bernstein, B. W., Chen, H., Boyle, J. A., Bamburg, J. R. Formation of actin-ADF/cofilin rods transiently retards decline of mitochondrial potential and ATP in stressed neurons. AJP: Cell Physiology. 291 (5), 828-839 (2006).
- Munsie, L. N., Desmond, C. R., Truant, R. Cofilin nuclear-cytoplasmic shuttling affects cofilin-actin rod formation during stress. Journal of Cell Science. 125 (17), 3977-3988 (2012).
- Iida, K., Iida, H., Yahara, I. Heat shock induction of intranuclear actin rods in cultured mammalian cells. Experimental Cell Research. 165, 207-215 (1986).
- Ohta, Y., Nishida, E., Sakai, H., Miyamoto, E. Dephosphorylation of cofilin accompanies heat shock-induced nuclear accumulation of cofilin. Journal of Biological Chemistry. 264 (27), 16143-16148 (1989).
- Iida, K., Matsumoto, S., Yahara, I. The KKRKK sequence is involved in heat shock-induced nuclear translocation of the 18-kDa actin-binding protein, cofilin. Cell Structure and Function. 17 (1), 39-46 (1992).
- Minamide, L. S., et al. Isolation and characterization of cytoplasmic cofilin-actin rods. Journal of Biological Chemistry. 285 (8), 5450-5460 (2010).
- Masurovsky, E. B., Benitez, H. H., Kim, S. U., Murray, M. R. Origin, development, and nature of intranuclear rodlets and associated bodies in chicken sympathetic neurons. The Journal of Cell Biology. 44 (7), 172-191 (1970).
- Feldman, M. L., Peters, A. Intranuclear rods and sheets in rat cochlear nucleus. Journal of Neurocytology. 1 (2), 109-127 (1972).
- Nishida, E., et al. Cofilin is a component of intranuclear and cytoplasmic actin rods induced in cultured cells. Cell Biology. 84 (8), 5262-5266 (1987).
- Ono, S., Abe, H., Nagaoka, R., Obinata, T. Colocalization of ADF and cofilin in intranuclear actin rods of cultured muscle cells. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 14 (2), 195-204 (1993).
- Xue, Z., Sokac, A. M. Back-to-back mechanisms drive actomyosin ring closure during Drosophila embryo cleavage. The Journal of Cell Biology. 215 (3), 335-344 (2016).
- Cao, J., Albertson, R., Riggs, B., Field, C. M., Sullivan, W. Nuf, a Rab11 effector, maintains cytokinetic furrow integrity by promoting local actin polymerization. Journal of Cell Biology. 182 (2), 301-313 (2008).
- Spracklen, A. J., Fagan, T. N., Lovander, K. E., Tootle, T. L. The pros and cons of common actin labeling tools for visualizing actin dynamics during Drosophila oogenesis. Developmental Biology. 393 (2), 209-226 (2014).
- Chen, Q., Nag, S., Pollard, T. D. Formins filter modified actin subunits during processive elongation. Journal of Structural Biology. 177 (1), 32-39 (2012).
- Iordanou, E., Chandran, R. R., Blackstone, N., Jiang, L. RNAi interference by dsRNA injection into Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments. (50), 2477 (2011).
- Juarez, M. T., Patterson, R. A., Li, W., McGinnis, W. Microinjection wound assay and in vivo localization of epidermal wound response reporters in Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments. 81, 50750 (2013).
- Carreira-Rosario, A., et al. Recombineering homologous recombination constructs in Drosophila. Journal of Visualized Experiments. (77), 50346 (2013).
- Brust-Mascher, I., Scholey, J. M. Microinjection techniques for studying mitosis in the Drosophila melanogaster syncytial embryo. Journal of Visualized Experiments. (31), 1382 (2009).
- Catrina, I. E., Bayer, L. V., Omar, O. S., Bratu, D. P. Visualizing and tracking endogenous mRNAs in live Drosophila melanogaster egg chambers. Journal of Visualized Experiments. (148), 58545 (2019).
- Wessel, A. D., Gumalla, M., Grosshans, J., Schmidt, C. F. The mechanical properties of early Drosophila embryos measured by high-speed video microrheology. Biophysical Journal. 108 (8), 1899-1907 (2015).
- Mollinari, C., González, Microinjection and transgenesis. Microinjection and Transgenesis: Strategies and Protocols. Cid-Arregui, A., García-Carrancá, A. , Springer. Berlin. 587-603 (1998).
- Figard, L., Sokac, A. M. Imaging cell shape change in living Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments. (49), 2503 (2011).
- Oesterle, A. Pipette Cookbook 2018: P-97 and P-1000 Micropipette Pullers. , Sutter Instruments. Novato, CA. (2018).
- Bownes, M. A photographic study of development in the living embryo of Drosophila melanogaster. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 33 (3), 789-801 (1975).
- Powsner, L. The effects of temperature on the durations of the developmental stages of Drosophila melanogaster. Physiological Zoology. 8 (4), 474-520 (1935).
- Hunter, M. V., Willoughby, P. M., Bruce, A. E. E., Fernandez-Gonzalez, R. Oxidative Stress Orchestrates Cell Polarity to Promote Embryonic Wound Healing. Developmental Cell. 47 (3), 377-387 (2018).
